Name: 生命の極限状態での適応:極限環境微生物アーキオンSulfolobus acidocaldariusによる実験的進化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぼう、サーモミキサーを用いた高温適応実験プロトコルで、極限環境微生物アーキオンSulfolobus acidocaldariusの実験的進化を研究する方法。この革新的なアプローチは、進化ダイナミクスの理解と環境変化への適応メカニズムの解明に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>低コストのサーモミキサーを用いた好熱剤適応のための実験的進化プロトコル

<ol><li>Nisbet, E. G., Sleep, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+habitat+and+nature+of+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The habitat and nature of early life.</a> Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).</li>
<li>Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Beagle+in+a+bottle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Beagle in a bottle.</a> Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).</li>
<li>Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+and+the+dynamics+of+adaptation+and+genome+evolution+in+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations.</a> ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).</li>
<li>McDonald, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+experimental+evolution+-+a+proving+ground+for+evolutionary+theory+and+a+tool+for+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Microbial experimental evolution - a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery.</a> EMBO Rep. 20 (8), e46992(2019).</li>
<li>Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+design%2C+population+dynamics%2C+and+diversity+in+microbial+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).</li>
<li>McCarthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+limits+of+thermoacidophily+in+the+archaeon+Sulfolobus+solfataricus+by+adaptive+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution.</a> Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+question+of+DNA+repair+in+hyperthermophilic+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea.</a> Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).</li>
<li>Whitaker, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+through+the+lens+of+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Mineral+Geochem%22%5BJournal%5D)">Population dynamics through the lens of extreme environments.</a> Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).</li>
<li>Peeters, E., Thia-Toong, T. -L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ss-LrpB%2C+a+novel+Lrp-like+regulator+of+Sulfolobus+solfataricus+P2%2C+binds+cooperatively+to+three+conserved+targets+in+its+own+control+region%3A+Ss-LrpB-operator+interactions+for+autoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation.</a> Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).</li>
<li>Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -V., Siebers, B., Spadiut, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfolobus+-+A+potential+key+organism+in+future+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sulfolobus - A potential key organism in future biotechnology.</a> Front Microbiol. 8, 2474(2017).</li>
<li>Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+edge%3A+Bioprospecting+extremophiles+for+astrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Indian+Inst+Sci%22%5BJournal%5D)">Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology.</a> J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Sulfolobus+acidocaldarius%2C+a+model+organism+of+the+Crenarchaeota%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota.</a> J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).</li>
<li>Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+characterization+of+Sulfolobus+acidocaldarius+in+a+controlled+bioreactor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment.</a> Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532(2021).</li>
<li>Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+heat+shock+response+for+the+thermoacidophilic+model+crenarchaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophiles+and+the+problem+of+DNA+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophiles and the problem of DNA instability.</a> Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).</li>
<li>Grogan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+DNA+repair+in+hyperthermophilic+archaea%3A+Persistent+gaps+and+other+reasons+to+focus+on+the+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork.</a> Archaea. 2015, 942605(2015).</li>
<li>Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+dangerous+missense%3A+Thermophiles+display+especially+low+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates.</a> PLoS Genet. 5 (6), e1000520(2009).</li>
<li>Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fidelity+under+harsh+conditions%3A+Analysis+of+spontaneous+mutation+in+the+thermoacidophilic+archaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).</li>
<li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+genetic+tool+box+for+the+Crenarchaeote+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius.</a> Front Microbiol. 3, 214(2012).</li>
<li>Suzuki, S., Kurosawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+gene+encoding+restriction+endonuclease+SuaI+and+development+of+a+host-vector+system+for+the+thermoacidophilic+archaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).</li>
<li>Baes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+translational+dynamics+underlying+heat+shock+response+in+the+thermophilic+crenarchaeon+Sulfolobus+acidocaldarius%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius.</a> mBio. 14 (5), e0359322(2023).</li>
<li>González, A. G., Pérez Y Terrón, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+extremophilic+microorganisms+in+biogeochemical+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22GSC+Adv+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles.</a> GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).</li>
<li>Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfolobus%3A+A+new+genus+of+sulfur-oxidizing+bacteria+living+at+low+pH+and+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Mikrobiol%22%5BJournal%5D)">Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature.</a> Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).</li>
<li>Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+experimental+evolution+in+Escherichia+coli.+I.+Adaptation+and+divergence+during+2%2C000+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Nat%22%5BJournal%5D)">Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations.</a> Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).</li>
<li>Baes, R. Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master's Thesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms">https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms</a> (2018).</li>
<li>Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+impact+of+population+bottlenecks+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution.</a> Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).</li>
<li>Bernander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+of+Sulfolobus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cell cycle of Sulfolobus.</a> Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).</li>
<li>Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+and+the+fate+of+beneficial+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations.</a> Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).</li>
<li>Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+sfGFP+variants+with+improved+and+reliable+functionality+in+industrially+important+thermophilic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria.</a> Biotechnol Biofuels. 11, 8(2018).</li>
<li>Visone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+protein+imaging+in+thermophilic+archaea+by+exploiting+a+novel+protein+tag%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag.</a> PLoS One. 12 (10), e0185791(2017).</li>
<li>Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+stable+fluorescent+proteins+for+advanced+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy.</a> Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 以上 μ;m シリンジ駆動メンブレンフィルター</td><td>StarLab</td><td>E4780-1226</td><td>オートクレーブできない培地成分のフィルター滅菌用です。</td></tr><tr><td>1 &mu;L接種ループ</td><td>グライナー</td><td>731161、731165、または731101</td><td>培養物への接種用。他のループも使用できます。</td></tr><tr><td>1000 &mu;Lピペットチップ</td><td>StarLab</td><td>S1111-6811</td><td>他のピペットチップも使用できます。</td></tr><tr><td>2 mL微量遠心チューブ</td><td>StarLab</td><td>S1620-2700</td><td>サーモミキサーでS. acidocaldariusを培養します。</td></tr><tr><td>200 &mu;Lピペットチップ</td><td>StarLab</td><td>S1111-0816</td><td>他のピペットチップも使用できます。</td></tr><tr><td>円錐形の底部を持つ50mLポリスチレンチューブ</td><td>コーニング</td><td>430828または430829</td><td>その他のチューブを使用することができます。75°Cで性能を確認してくださいプラグシールキャップ付きのチューブでは、十分な曝気ができない場合があります。使用前に確認してください。&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mLシリンジ</td><td>BD plastipak</td><td>300865</td><td>シリンジ駆動フィルターで使用します。</td></tr><tr><td>96ウェルマイクロタイタープレート(未処理、平底)</td><td>Nunc</td><td>260860</td><td>分光光度計で600nmのODを測定するため。</td></tr><tr><td>幅調整可能なマルチチャンネルピペット</td><td>Pipet-Lite</td><td>LA8-300XLS</td><td>オプションですが、マイクロ遠心分離機と96ウェルプレート間の移載にかかる時間を節約できます。</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)</td><td>Millipore</td><td>168355</td><td>ブロックストック溶液I.</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>Priorclave</td><td>B60-SMARTまたはSV100-BASE</td><td>他のオートクレーブも使用できます。</td></tr><tr><td>Breathe-EASY気体透過性シーリングメンブレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763624-100EA</td><td>ピアスマイクロ遠心チューブに使用するサイズにカットします。他のガス透過性メムルバンを代用する場合は、75°Cで性能が適切であることを確認してください。C</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2&middot;2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>ブロックストックソリューション用 I.</td></tr><tr><td>CELLSTAR 6ウェルプレート(懸濁液/未処理)</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>他メーカーの6ウェルプレートで代用できる可能性が高いです。高温での性能を確認してください。</td></tr><tr><td>硫酸コバルト(II)七水和物(CoSO4&middot;7H2O)</td><td>Supelco</td><td>1025560100</td><td>微量元素ストック溶液用。</td></tr><tr><td>塩化銅(II)二水和物(CuCl2&middot;2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td>微量元素ストック溶液用。</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース無水物 (C6H12O6)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11462858</td><td>他のペントース糖およびヘキソース糖も使用できます(例:D-キシロース、D-アラビノース)。グルコースは、S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)</td></tr><tr><td>二蒸留水 (ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1101.1000</td><td>Gelrite (gellan gum) は、融点が高いため、寒天の代わりに固体媒体を作るために使用されます。</td></tr><tr><td>ガラス100mmペトリ皿</td><td>ブランド</td><td>BR455742</td><td>ガラスペトリ皿は、ほとんどの標準的なポリスチレン90mmペトリ皿が75°Cで変形するため、使用されます。C(ブランドに依存)。あるいは、高温で変形しないため、6枚のウェルプレートを使用することもできます。</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>New Brunswick</td><td>Innnova 42R</td><td>他のインキュベーターも使用できます。多くのインキュベーターは65°Cを超える温度に耐えられないため、購入/使用する前に機器の動作温度を確認してください。</td></tr><tr><td>塩化鉄(III)六水和物(FeCl3&middot;Feストック溶液用6H2O)</td><td>Supelco</td><td>103943</td><td></td></tr> 硫酸<tr><td>マグネシウム七水和物(エプソム塩)(MgSO4&middot;7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>ブロックストックソリューション用 I.</td></tr><tr><td>塩化マンガン(II)四水和物(MnCl2&middot;4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIALM5005-100G</td><td>微量元素ストック溶液用。</td></tr><tr><td>ミニスマートWi-Fiソケット、エネルギー監視</td><td>Tapo</td><td>Tapo P110</td><td>エネルギー消費を監視するには&nbsp;</td></tr><tr><td>N-Z-アミンA - カゼイン酵素加水分解物&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0626-500G</td><td>N-Z-Amine-Aは、アミノ酸の供給源として使用されます。</td></tr><tr><td>ペーパークリップ(またはその他の頑丈なワイヤー)</td><td>なし</td><td></td><td>なし2mLの微量遠心チューブのピアス用。</td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム(リン酸一カリウム)(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td>ブロック<td>ストック溶液I用。</td></tr><tr><td>PromegaウィザードゲノムDNA精製キット</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>オプションで、実験室でゲノムDNAを抽出する</td></tr><tr><td>モリブデン酸ナトリウム二水和物(Na2MoO4&middot;2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651-100G</td><td>微量元素ストックソリューション用。</td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム十水和物(ホウ砂)(Na2B4O7&middot;10H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>微量元素ストック溶液用。</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>BMG</td><td>SPECTROstar OMEGA</td><td>600nmでの外径測定用。600nmでODを読み取ることができる他の分光光度計も使用できます。</td></tr><tr><td>硫酸(水と1:1の比率で希釈)(H2SO4)</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>11337588</td><td>ブロックストック溶液II/IIIのpHを最終pH2&ndash;3に調整するために使用されます。</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>DLab</td><td>HM100-Pro</td><td>他のサーモミキサーも使用できます。主な考慮事項は、65&ndash を維持する能力です。75度;C温度と400RPM</td></tr><tr><td>ウラシル(C4H4N2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>pyrEの欠失は、S.acidocaldariusで使用される一般的な遺伝マーカーです。欠失株は、成長のためにウラシルで補う必要があります。.DSM639野生型株については厳密には補充は必須ではありませんが、将来の実験で欠失株が含まれる可能性があるため、ここに含めています。</td></tr><tr><td>バナジル硫酸二水和物(VOSO4&middot;2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204862</td><td>微量元素ストック溶液用。</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛七水和物(ZnSO4&middot;7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td>微量元素ストック溶液用。</td></tr></tbody></table>

生命の極限状態での適応:極限環境微生物アーキオンsulfolobus acidocaldariusによる実験的進化

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

成長曲線の測定 S. acidocaldarius DSM639の成長曲線を図3Aに示します。サーモミキサーを使用したインキュベーションと従来のインキュベーターを使用したインキュベーションを比較すると、成長は同様であることがわかりました。平均成長率パラメータは、反復された各成長曲線にロジスティック曲線を当てはめ、平均誤差と標準誤差を計算することによって推定されました。サーモミキサーとインキュベーターの指数関数的フェーズの中期までの時間は、それぞれ27.2時間±1.1時間、31.1時間±1.9時間でした。75°Cでのサーモミキサーとインキュベーターの推定初期倍加時間は、それぞれ4.29時間±0.28時間、4.19時間±0.44時間であり、これは以前に発表された値と一致している24。log10(OD600nm)とlog10(CFU)の関係は、線形モデル(調整済みR2 = 0.82、F(1,22)= 104、p &lt; 0.00001、傾き = 1.73 ± 0.17、切片 = 9.73 ± 0.14)によってよく特徴付けられました。したがって、OD600nm と CFU の関係は、式 CFU = 10(1.73 × log10(OD600nm) + 9.73)) で与えられます。したがって、外径600nmが0.3の場合、約6.7 ×10 8 CFU/mLに相当します(図3B)。
温度発生実験 S . acidocaldarius DSM639に由来する7つの独立した系統を用いて、一定75°C、一定65°C、一定65°C、および温度降下(75-65°C、2回の転移ごとに1°C減少)の3つの温度条件を開始した。OD600nm の測定は、実験の45日間(75°Cで約150世代)の各移し替えの後に行われ、 図4に示されています。日をまたいで行われるOD600nm の測定は、成長期間や温度などの微妙な違いに左右されるため、本質的にノイズが多くなります。ただし、日をまたいで行われた測定は、集団の生存率を評価するだけでなく、フィットネスが時間の経過とともに改善しているかどうかの指標を提供するのに依然として役立ちます。OD600nm では、75°Cの一定の条件からの系統が、実験終了までに初期範囲0.125-0.3から0.248-0.471の範囲に増加しました。これは、この治療によりフィットネスが向上したことを示唆しています。対照的に、65°Cの定常処理からの系統は、ODが600nmで、初期範囲0.018-0.087から最終時点で0.008-0.04に低下したことを示しました。このことは、個体群が一定の65°Cの温度に適応できなかったことを示唆しているが、生存可能な生物が回収できたという事実は、個体群が連続的な希釈によって洗い流されなかったことを示しており、ある程度の適応を示唆している。最後に、温度降下処理の集団は、Tx6(この処理では288時間および73°Cに相当)で0.099-0.279の初期OD600nm 範囲から0.3-0.39に増加し、その後、最終時点で0.003-0.024の範囲まで着実に減少しました。
成長/フィットネスアッセイ 適応度アッセイは、進化実験に続いて各子孫集団に対して実施された。OD600nm は、7つの独立した系統すべてについて48時間成長後にアッセイされ、続いて、各アッセイ温度に対して「選択環境」を主効果として、「replicate/thermomixer」をブロック効果として、線形モデルをRに適合させました。祖先系統の成長は、治療造影剤の参照レベルとして使用されました。データを 図 5 に示します。
75°Cでアッセイした場合、一定75°C(t検定: t210=3.64、 p = 0.0003)および定数65°C(t検定: t210=2.8、 p = 0.005)処理による系統の系統では、祖先系統よりも平均して適応度が有意に増加しましたが、温度低下処理(t検定: t210=−0.87、 p=0.38)。65°Cでアッセイした場合、平均して、すべての処理の系統でフィットネスの増加が示されました(一定の75°C系統; t検定: t210 = 4.68、 p&lt;0.0001、定数65°C系統; t検定: t210、= 4.24、 p&lt;0.0001、温度低下系統; t検定: t210 = 3.15、 p = 0.002)。しかし、どちらのアッセイ温度でも、系統間の適応度には大きな差がありました(図5)。一部の系統は、先祖代々の系統と大きく異なっていなかったか、適応度が低下していました。これは、温度低下処理の系統で特に顕著でした。
OD600nm とCFU/mLの関係が進化実験中に変化した可能性があることは注目に値します。これは、進化した系統の成長パラメータを決定することで評価できます(ステップ3.1〜3.10に従う)。
全ゲノムシーケンシング結果 全ゲノム解析は、S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq accession NC_007181.1) の参照ゲノムを用いて、75°C条件の7系統についてbreseq(version 0.38.1)を用いて行った。すべての子孫系統のゲノム全体で、挿入、欠失、および一塩基多型(SNP)を含むさまざまな突然変異が明らかになりました(表2)。複数の挿入突然変異と非同義変異は、タンパク質をコードする遺伝子だけでなく、遺伝子のプロモーター領域のフレームシフトにより遺伝子発現に影響を与える可能性のある遺伝子間領域にも見られました。一部の突然変異は、細胞壁の生合成、転写、代謝、細胞輸送、触媒活性などのさまざまな機能に関与する遺伝子の複数の子孫系統にわたって一貫していました(表2)。これらの突然変異の中には、7つの系統のうち5つで54,667塩基対の大幅な欠失がありました。これは、各母集団の欠落カバレッジ証拠プロット(頻度93.2%から100%の範囲)によって確認されました。欠失した領域は、53個の遺伝子の喪失に相当します。これらの遺伝子の適応における役割については、今後の研究で検討する予定です。DSM639の使用した単離物と公表されている参照配列(補足表1を参照)との間には、いくつかの違いが認められました。
振とうインキュベーターとサーモミキサーのエネルギー消費 振とうインキュベーターのエネルギー消費量は、一般的なインキュベーション温度の範囲とここで使用される75°Cの温度で、市販のエネルギーモニタリングスマートプラグを使用したサーモミキサーと比較されました。75°Cでは、サーモミキサーは従来の振とうインキュベーターの約1/40の エネルギーを消費し(図6)、サーモミキサーが実験の進化に関連する二酸化炭素排出量を削減する可能性のある手段であることが示唆されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig01v2.jpg"> 図1:3つの温度処理にわたる進化実験プロトコルを示すフローチャート。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig02v2.jpg"> 図2:成長/フィットネスアッセイプロトコルのステップを示すフローチャート。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig03.jpg"> 図3: S. acidocaldarius DSM639の主要な増殖パラメータの決定とインキュベーションデバイスの比較。 3つの複製培養物を7つの別々のチューブで75°Cで増殖させました。破壊サンプリングを使用して、(A)OD600nm ( n = 3テクニカルレプリケートの標準誤差±平均;一部のエラーバーはプロットシンボルよりも小さい)を測定しました。曲線は、適合したロジスティック成長モデルと(B)コロニー形成ユニット(CFU)を表します。線は近似された対数-対数線形回帰モデルを表します)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig04.jpg"> 図4:進化実験で得られた光学密度(OD600nm)の代表的な結果。 進化実験で測定した独立系統の光学密度を、約150世代にわたって3つの温度処理(定温65°C、定温75°C、低下75°C-65°C)で測定しました。曲線は、各独立した系統の経時的な黄土の滑らかさを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig05.jpg"> 図5:成長アッセイの代表的な結果。 S. acidocaldarius DSM639に由来する独立系統の増殖アッセイ (祖先株と比較した温度変化実験 (定数 65 °C、定数 75 °C、低下 75 °C-65 °C) の後。すべての系統について、65°Cおよび75°Cで増殖をアッセイしました。 色付きのポイントは、技術的反復の平均±標準誤差を示しています(灰色で表示、祖先はn = 12、進化した系統ごとにn = 3)。灰色のバーは、先祖代々のフィットネスの平均±標準誤差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66271/66271fig06.jpg"> 図6:従来のインキュベーターとサーモミキサーデバイスのエネルギー消費量。 エネルギー消費量は、市販のエネルギー監視スマートプラグを使用して2時間以上記録されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/66271fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1: S.acidocaldariusの増殖に必要な培地レシピとストック溶液。 すべての培地およびストック溶液は、再蒸留H2O(ddH2O)で調製し、オートクレーブ滅菌または0.22 μmフィルターによるフィルター滅菌のいずれかで滅菌する必要があります。すべての培地およびストック溶液の調製方法の詳細な説明については、プロトコールのセクション1を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:子孫系統の全ゲノムシーケンシングの代表的な結果。 S. acidocaldarius DSM639の子孫の子孫系統に見られる突然変異は、一定の75°C処理から得られます。突然変異は、系統の直接の祖先に対する相対的な変化を示し、系統はS. acidocaldarius DSM639の参照配列に対していくつかの変化を有する(RefSeq NC_007181;祖先の突然変異は補足表1に示されている)。n は、突然変異が見つかった系統の数を示します。「フォワードリーディングフレーム」上の→遺伝子。「逆読み取りフレーム」上の←遺伝子。†これらの変化は、S. acidocaldarius DSM639の分離株に存在する(A)10→11フレームシフトに関連しています(補足表1)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a> 
補足表1:参照配列に対する S.acidocaldarius DSM639の分離株に存在する変異(RefSeqアクセッションNC_007181.1)。 「フォワードリーディングフレーム」上の→遺伝子。「逆読み取りフレーム」上の←遺伝子。NC_007181.1ではSACI_RS04020が偽遺伝子としてアノテーションされていますが、ここで観察されたΔ1 bpフレームシフト変異は、突然変異と同様にその機能を回復し、 rgy 逆ジャイレース遺伝子と100%同一性を持つタンパク質をコードしていると推定されています(RefSeqアクセッションWP_176586667.1)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66271/Supplementary%20Table-1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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