Name: 生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぼう Trypanosoma bruceiのグリコソームpH動態測定法。pH感受性バイオセンサーとフローサイトメトリーを用いて、生きた寄生虫の栄養応答をリアルタイムでモニタリングし、糖代謝制御メカニズムを解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

pHluorin2-PTS1 は、Twist Bioscience 社によって pLEW100v5 にクローニングされ、高コピークローニングベクターでコンストラクトが提供されました。pLEW100v5はジョージ・クロス博士からの贈り物でした。 T. brucei アルドラーゼに対して提起された抗血清は、要求に応じてクレムソン大学のメレディス T. モリス博士から入手できます。JCMとKACの研究所の研究の一部は、米国国立衛生研究所(R01AI156382)からの助成金によって支援されました。SSP は NIH 3R01AI156382 でサポートされました。

Trypanosoma bruceiにおけるグリコソームpHのためのpHluorin2を用いたセンサの開発

<ol><li>Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolysis+in+the+African+trypanosome%3A+Targeting+enzymes+and+their+subcellular+compartments+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development.</a> Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).</li>
<li>Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+carbon+metabolism+in+the+macrophage+phagolysosome-+feast+or+famine%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine.</a> F1000Res. 4, 938(2015).</li>
<li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+Parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).</li>
<li>Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+maintenance+and+dynamics+of+glycosomes+in+trypanosomatid+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).</li>
<li>Allmann, S., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes%3A+A+comprehensive+view+of+their+metabolic+roles+in+t.+Brucei%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).</li>
<li>Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+3-phosphate+alters+Trypanosoma+brucei+hexokinase+activity+in+response+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).</li>
<li>Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+targeted+delivery+of+pH+sensor+for+quantitative+measurements+of+intraglycosomal+pH+in+live+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei.</a> Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).</li>
<li>Mahon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phluorin2%3A+An+enhanced%2C+ratiometric%2C+pH-sensitive+green+florescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).</li>
<li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Restriction digest v.2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2">https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2</a> (2018).</li>
<li>Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3">https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3</a> (2021).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
<li>Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+pex13.2+is+an+accessory+peroxin+that+functions+in+the+import+of+peroxisome+targeting+sequence+type+2+proteins+and+localizes+to+subdomains+of+the+glycosome%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome.</a> mSphere. 5 (1), e00744(2020).</li>
<li>Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+for+nigericin-resistant+yeast+mutants+revealed+genes+controlling+mitochondrial+volume+and+mitochondrial+cation+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis.</a> Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).</li>
<li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+excretion+of+glycolytic+products+is+associated+with+acidification+of+the+parasitophorous+vacuole+during+parasite+egress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress.</a> PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139(2022).</li>
<li>Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoform-1+is+associated+with+serum-dependent+activation+of+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22TheJournal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange.</a> TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurements+of+the+ph+of+mammalian+peroxisomes+using+the+fluorescent+protein+phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).</li>
<li>Jankowski, A., Grinstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+fluorimetric+procedure+for+measurement+of+membrane+potential.+Quantification+of+the+NADPH+oxidase-induced+depolarization+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ph+regulation+in+glycosomes+of+procyclic+form+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).</li>
<li>Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+transfected+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).</li>
<li>Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shuttle+vector+which+facilitates+the+expression+of+transfected+genes+in+Trypanosoma+cruzi+and+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania.</a> Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).</li>
</ol>

著者は利益相反がないことを宣言します。

アフリカのトリパノソーマにおける環境認識と応答機構は十分に理解されていない。栄養素の利用可能性の変化は、グリコソームの酸性化など、寄生虫の多様な応答を引き起こすことが知られています。ここでは、遺伝性タンパク質センサーpHluorin2とフローサイトメトリーを用いて、生細胞の環境摂動に対するグリコソームのpH応答を研究する方法について説明しました。
センサーの使用には、いくつかの重要なステップがあります。第一に、導入遺伝子を発現するトランスフェクション寄生虫の特性評価は、発現に細胞間変動がある可能性があるため、重要です。一部の導入遺伝子の発現レベルは、時間の経過とともに低下する可能性があります。これまでのところ、pHluorin2担持細胞では観察されていませんが、センサーの応答性が大きく変動する場合(例えば、誘導後、センサーシグナルが頑健でない場合)、集団の一部のメンバーが他のメンバーよりも高いレベルでタンパク質を発現する可能性があるため、培養物のクローンアウトが必要になる場合があります。あるいは、再形質転換と選択は、より高い(おそらく一過性の)発現を有する新しい細胞株の作製に有用で...

寄生キネトプラスチドは、ほとんどの生物と同様に、中枢炭素代謝の基本的な構成要素としてグルコースに依存しています。このグループには、アフリカのトリパノソーマ、トリパノソーマ・ブルーセイなどの医学的に重要な生物が含まれます。アメリカのトリパノソーマ、T. cruzi; リーシュマニア属の寄生虫。グルコース代謝は、病原性ライフサイクル段階における寄生虫の増殖に不可欠です。例えば、グルコースが奪われると、アフリカトリパノソーマの血流型(BSF)は急速に死滅します。特に、解糖系は、感染のこの段階でATPの唯一の供給源として機能します1。リーシュマニア寄生虫も同様に宿主のグルコースに依存しており、宿主マクロファージに存在するアマスティゴートのライフサイクルステージは、成長のためにこの炭素源に依存しています2。
これらの寄生虫は、異なる昆虫媒介者を含む異なるライフスタイルを持っていますが、ブドウ糖への反応と消費方法には多くの共通点があります。例えば、これらの寄生虫は、ほとんどの解糖酵素をグリコソームと呼ばれる修飾ペルオキシソームに局在化させます。このキネトプラスト特異的細胞小器官は、保存された生合成メカニズムと形態に基づいて、哺乳類のペルオキシソームに関連しています3,4,5,6。
解糖系経路酵素のほとんどをグリコソームに区画化することで、寄生虫特異的な経路制御手段が提供されます。化学的pHプローブを用いて、栄養欠乏がプロサイクリック型(PF)グリコソームの急速な酸性化を引き起こし、主要な解糖酵素であるヘキソキナーゼ7,8のアロステリック調節因子結合部位の露出により解糖酵素活性を変化させることを立証しました。以前の研究では、化学プローブは使用するために一定の送達を必要とし、他の用途での有用性は限られていました。さらに、BSF中のグリコソーム内のプローブ分布を維持するという課題により、そのライフステージにおけるグリコソームのpHを調査するためのアプローチの有用性が制限されていました。
本研究では、蛍光タンパク質バイオセンサーpHluorin2を用いて、グルコース飢餓などの環境要因に応答したBSF T. brucei のグリコソームpH変化をモニターしました9 (図1)。この研究の結果は、BSF T. brucei が飢餓に応答してグリコソームを急速に酸性化することを示唆しています。このバイオセンサーにより、 T. brucei および関連寄生虫の解糖系制御に関する理解が深まることが期待されます。

<table><tbody><tr><td>50 mL 組織培養フラスコ (未処理、滅菌)</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 組織培養フラスコ (未処理、滅菌)</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>80 &micro;L型平底384ウェルプレート</td><td>BrandTech&nbsp;</td><td>781620</td><td></td></tr><tr><td>AmaxaヒトT細胞核フェクター&nbsp;キット</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Flow Cytometer</td><td>invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>A24858</td><td>FlowJo software</td></tr><tr><td>BRANDplates 96-Well, flat bottom plate</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR781662</td><td></td></tr><tr><td>Coloc 2 plugin of ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/plugins/coloc-2</td></tr><tr><td>CytKick Max Auto Sampler</td><td>invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>A42973</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX フローサイトメーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡 Sciences 16% パラホルムアルデヒド水溶液、EM グレード、10 mL アンプル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズム</td><td></td><td></td><td>統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>ニゲリシン (ナトリウム塩)</td><td>ケイマン・ケミカル</td><td>11437</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオフェクター 2b</td><td>ロンザ</td><td>生産終了製品</td><td></td></tr><tr><td>OP2 リキッドハンドラー</td><td></td><td>OP2</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン、0.1% (w/v) in H2O</td><td>Sigma Life Science</td><td>CAS:25988-63-0</td><td>HTSアッセイ用ピペッティングロボット</td></tr><tr><td>チアゾールレッド (TO-PRO-3)</td><td>ビオチウム</td><td>#40087</td><td>このブランドのプレートを検出し、CytKick Max Autoで使用できるように、カスタムアクリルプレートスタンドを機械加工しましたサンプラー</td></tr><tr><td>valinomycin</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009152</td><td>HTSアッセイ用ピペッティングロボット</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>pH校正用</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;&nbsp;</td><td>pH校正用</td></tr></tbody></table>

生きているtrypanosoma bruceiの動的グリコソームph変化の測定

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

グルコース代謝は、アフリカのトリパノソーマ( Trypanosoma brucei)にとって、寄生虫発生の必須代謝プロセスおよび調節因子として重要です。環境中のグルコースレベルが変化したときに生じる細胞応答については、ほとんど知られていません。血流寄生虫とプロサイクリック型(昆虫期)寄生虫の両方で、グリコソームは解糖の大部分を収容しています。これらの細胞小器官は、グルコース欠乏に応答して急速に酸性化され、その結果、ヘキソキナーゼなどの解糖酵素のアロステリック調節が起こる可能性があります。以前の研究では、pH測定に使用する化学プローブの局所化が困難であり、他のアプリケーションでの有用性が制限されていました。
この論文では、遺伝性タンパク質pHバイオセンサーであるグリコソーム局在性pHorin2を発現する寄生虫の開発と使用について説明します。pHluorin2 はレシオメトリック pH バリアントであり、395 nm で pH(酸)依存的な励起の低下を示すと同時に、475 nm での励起の増加を示します。トランスジェニック寄生虫は、pHluorin2オープンリーディングフレームをトリパノソーマ発現ベクターpLEW100v5にクローニングすることによって生成され、どちらのライフサイクルステージでも誘導可能なタンパク質発現を可能にしました。免疫蛍光法を用いて、pHluorin2バイオセンサーのグリコソーム局在を確認し、バイオセンサーの局在をグリコソーム常在タンパク質アルドラーゼと比較しました。センサーの応答性は、以前にフルオレセインベースのpHセンサーのキャリブレーションに使用したアプローチである、pH 4 から 8 の範囲の一連のバッファーで細胞をインキュベートすることにより、異なる pH レベルでキャリブレーションしました。次に、フローサイトメトリーを用いて405 nmおよび488 nmのpHluorin2蛍光を測定し、グリコソームのpHを測定しました。PF寄生虫のグリコソーム酸性化の引き金として知られているグルコース欠乏に反応してpHを経時的にモニタリングし、生きたトランスジェニックpHluorin2発現寄生虫の性能を検証しました。このツールは、ハイスループット薬物スクリーニングに使用される可能性など、さまざまな用途が考えられます。グリコソームのpHだけでなく、このセンサーを他のオルガネラに適合させたり、他のトリパノソーマチドに使用したりして、生細胞環境におけるpHダイナミクスを理解することができます。

BSF T. bruceiにおけるグリコソームへのpHLuorin2-PTS1局在 pHluorin2-PTS1の細胞内局在を評価するために、寄生虫を免疫蛍光アッセイにかけました。グリコソーム常在タンパク質であるアルドラーゼ(TbAldolase)に対して抗血清と共局在した導入遺伝子からのシグナル(図2A)。抗TbアルドラーゼとpHluorin2-PTS1の共局在のピアソン相関係数の平均は0.895であり、pHluorin2-PTS1は主にグリコソームに局在していることが示されました。pHluorin2-PTS1がグリコソームに局在した状態で、BFグリコソームのpHの調査を進めました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66279/66279fig02.jpg"> <strong class=...

アフリカのトリパノソーマの血流型のグリコソームの環境的手がかりにpHがどのように応答するかを研究する方法について説明します。このアプローチでは、pH感受性遺伝性タンパク質センサーとフローサイトメトリーを組み合わせて、経時アッセイとハイスループットスクリーニングフォーマットの両方でpHダイナミクスを測定します。

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

グルコース代謝はトリパノソーマ・ブルーセイにとって重要ですが、細胞が環境中のグルコースレベルの変化をどのように感知し、反応するかについてはほとんどわかっていません。私たちは、生きた寄生虫のグリコソームpHをモニターできるpHバイオセンサーを発現する寄生虫を開発し、栄養変動に対する寄生虫の動的応答の理解に役立てています。この実験の課題は、マイクロタイタープレートリーダーを備えたフローサイトメーターと、バイオセンサーの蛍光を測定するための適切なフィルターセットの入手可能性です。さらに、T.bruceiはリスクグループ2の生物であるため、サイトメーターはバイオセーフティレベル2の施設内に収容する必要があります。ヘキソキナーゼとホスホフルクトキナーゼはpHに敏感であるため、グリコソームのpHレベルが解糖系に影響を与える可能性があることが発見されています。しかし、以前に使用されていたpHプローブは、血流形態のグリコソームを正確に標的としていませんでした。この寄生虫のライフステージにおけるグリコソームのpHと解糖の関係を研究するには、より優れたツールが必要でした。pHluorin2-PTS1センサーは、このライフステージにおいて、化学的pHプローブよりもグリコソームへの局在化に優れたツールです。pHセンサーの発現を一晩誘導するだけで、細胞がpHluorin2を生成してグリコソームに局在化させるため、ユーザーフレンドリーです。フローサイトメトリーを使用してpHluorin2を測定すると、顕微鏡検査と比較してスループットが向上し、統計的測定が向上します。

measuring-dynamic-glycosomal-ph-changes-in-living-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

&gt;jove_content&lt;アフリカのトリパノソーマにおけるグリコソームの動態は、電子顕微鏡や蛍光顕微鏡などの伝統的な細胞生物学技術では研究が困難です。...

アフリカトリパノソーマにグライコダイナミクスを監視する蛍光タンパク質を使用した

この原稿は、アフリカのトリパノソーマの生物発光株を使用して、後期感染の追跡を可能にする方法を説明し、in...

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

タンパク質にタグを追加することは、その機能についての洞察を得るための強力な方法です。ここでは、ゲノムスケールのタグ付けが達成できるように、数百のTrypanosoma...

ハイスループット遺伝子タギングで<em&gt;トリパノソーマ</em

アフリカのトリパノソーマは、抗原の変動が低率で発生し、その結果、集団は優勢な変異体である表面糖タンパク質(VSG)タイプを発現する寄生虫と「切り替えられた」変異体の小さな集団で構成されています。...

の検出<em&gt;トリパノソーマ</em磁気活性化細胞選別し、フローサイトメトリーによって&gt;バリアント表面糖タンパク質の切り替え

トリパノソーマ血から分離のこの方法は、哺乳類の血液細胞よりも小さい負となりその表面電荷に依存します。感染した血は配置し、陰イオン交換カラムに扱われます。このメソッド、アフリカ睡眠病の最もフィッティング診断は、免疫学的、生物学的、生化学的、薬学・分子生物調査のため精製の寄生虫を提供します。...

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

シャーガス病の原因物質である トリパノソーマ・クルジの3つのライフサイクル段階におけるβ-ガラクトシダーゼ活性を測定するハイスループット比色アッセイについて述べる。このアッセイは、トリパノサイド化合物を容易、迅速、かつ再現性のある方法で同定するために使用することができる。...

インビトロ β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いた トリパノソーマクルジ のすべてのライフサイクル段階に対する薬物スクリーニング

テロメアは染色体の安定化に不可欠であり、テロメアG -オーバーハング構造はテロメラーゼを介したテロメア維持に不可欠です。我々は最近ではテロメアG...

のテロメアG -オーバーハング構造の検討トリパノソーマ</em

この記事では、フローサイトメトリーを用いて固定し、生きた細胞内のカルパイン活性を測定するための詳細プロトコルを務める。...

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

インフルエンザウイルスとの同時感染は無症候性の中に侵襲性肺炎球菌疾患の誘導に関与する要因の一つです。...

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

この記事では、バクテリオファージラムダの感染の蛍光標識されたバージョンを準備する手順を説明します...

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

学ぼう Trypanosoma bruceiのグリコソームpH動態測定法。pH感受性バイオセンサーとフローサイトメトリーを用いて、生きた寄生虫の栄養応答をリアルタイムでモニタリングし、糖代謝制御メカニズムを解明する。

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

さらに動画を探す