Name: クライオ電子顕微鏡法から得られたマップへの配位子のモデリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶ クライオ電子顕微鏡法を用いたマクロ分子複合体の高分解能構造解析と配位子モデリング手法。膜タンパク質の構造決定と創薬研究への応用可能性を示す。

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SJはDAE-TIFRから博士課程の学生資格を取得しており、資金提供が認められています。KRVは、DBT B-Lifeの助成金DBT/PR12422/MED/31/287/2014およびインド政府原子力省の支援をプロジェクト識別番号で認めています。RTI4006。

高分子のクライオ電子顕微鏡マップにおける低分子リガンドのモデリング

著者は何も開示していません。

近年、顕微鏡のハードウェアとソフトウェアの改良により、クライオ電子顕微鏡の構造の数が増加しています。単粒子クライオ電子顕微鏡で現時点で達成されている最高分解能は 1.2 Å 57,58,59 ですが、構造の大部分は 3-4 Å の分解能で決定されています。中解像度から低解像度のマップでのリガンドのモデリングは、厄介で、多くの場合、あいまいさをはらんでいます。トランスレーショナルリサーチや創薬のために、学界と製薬業界の両方でクライオ電子顕微鏡が広く使用されていることを考えると、リガンドが正しくモデル化され、曖昧さがないことを確認することが不可欠です。したがって、Qスコア60を計算することにより、配位子原子の分解可能性を定量化することが賢明であり、これは現在、マップの品質とモデルの適合度を評価するための指標としてEMDBおよびChimeraで利用可能です。
最初の例では、ChimeraXを使用して、結核菌エノラーゼ酵素のアポマップとリガンド結合マップとの間の実空間での差分マップを計算しました。高い閾値での追加密度は、活性部位にリガンドであるホスホエノールピルビン酸が存在すること、およびリガンドに結合したMg2+の存在を示唆しています。この場合、マップの解像度は中程度(3.2 Å)であり、水分子は自信を持ってモデル化できないことに注意してください(図1)。この方法に関連する制限は、リガンド結合がタンパク質の有意な立体配座変化を誘導しない場合にのみ適用できることです。この場合、apoとリガンド結合の両方のデータセットが同じピクセルサイズで取得され、Relionで同じパラメータで処理されたため、マップの正規化は実行されませんでした。ただし、Relion46,47 や CryoSparc61 などの異なる再構築プログラムによって生成されたマップ、または品質が異なるマップを比較する場合、意味のある比較を行うには、マップの正規化が不可欠になることに注意してください。
次の例はmGlu5で、クライオ電子顕微鏡の構造51,62から明らかなように、アゴニストの結合により大きな分子再編成を受けます(図2)。このシナリオでは、非結合(apo)受容体とリガンド結合受容体の間には大きな違いがあるため、単純な差分マップを計算することはできません。ここでは、シャープ化されていない、重み付けされていないハーフマップを逆数空間での改良の入力として使用し、その後、実験マップとモデルから導出されたマップとの間の差分マップを計算するServalcatが利用されました。高いしきい値では、違いを視覚化し、モデルの修正と改善のガイドとして機能できます。mGlu5の細胞外および膜貫通ドメイン付近にいくつかのモデル化されていないブロブが観察され、モデルリガンドのガイドとして使用されました(図2)。
3 番目の例は、分解能 (2.3 Å) が β-ガラクトシダーゼのフラグメントサイズ阻害剤のマップ解釈とモデリングにおいてどのように重要な役割を果たすかを示しています。ここでの課題は、データに内在するノイズの中で、Servalcat差分マップで非常に小さなリガンド(<200 Da)を特定し、それを正確にモデル化することでした。フーリエシェル相関(FSC)を使用して決定された高いグローバル分解能に加えて、リガンドに特有の局所分解能も十分に高かったため、リガンドのキラル中心を正確に配置することができました(図3)。溶媒分子の密度は、酵素全体、特にリガンドの周囲の差分マップで観察されました。リガンドと溶媒原子のモデリングに対する分解能の影響も実証されました(図4)。水分子や溶媒分子をモデル化する際には、低い閾値でのノイズが水分子や溶媒分子に似ており、誤解を招く可能性があるため、注意が必要です。
もう1つの重要な考慮事項は、クライオ電子顕微鏡マップだけでは金属イオンを正確に同定するには不十分である可能性があることです。金属イオンの存在と同一性を確認するために、拡張X線吸収微細構造(EXAFS)やエネルギー分散型X線分光法(EDX)などの追加の生物物理学的方法がしばしば必要になります。エノラーゼ酵素とβ-ガラクトシダーゼ酵素の両方で、これらのタンパク質に関する豊富な情報がすでに入手可能なため、Mg2+ がモデル化され、金属イオンの同一性が確認されました。また、これらの場合の金属イオンの配位は、古典的な八面体形状とMg2+のほぼ理想的な配位距離に代表され、それらの同一性の実質的な証拠を提供しました。
一般に、クライオ電子顕微鏡マップでリガンドをモデル化する際には、いくつかの重要な考慮事項を考慮する必要があります。まず、リガンドの同定とモデリングに適したマップを選択することが重要です。いずれの場合も、リガンド密度を視覚化するには、シャープ化および重み付けされていないマップまたはハーフマップを使用することをお勧めします。これは、シャープ化および重み付けされたマップよりも、マップ内のシャープ化が不十分またはシャープ化されすぎた(シリーズ終了によるノイズ)領域が発生する可能性があるためです。これにより、配位子密度が最適ではなくなる可能性があり、Cootでのモデル構築中に密度を評価するために、さまざまなBファクターシャープニングを使用することができます。シャープ化されたマップを使用してクライオEMマップ内のリガンドを特定することにはリスクがありますが、シャープ化されていないマップはリガンド密度の完全な詳細を示していない場合がありますが、 図1B、Cに示すように、デモンストレーションの目的で使用できます。
モデル化されたリガンドの姿勢は、特にデータが弱い場合に検証する必要があります。mGlu5 で示されているように、局所分解能はクライオ電子顕微鏡マップ全体で異なり、リガンドの偏りのないモデリングは困難な場合があります。Servalcatは、タンパク質およびリガンドモデリングの潜在的な不正確さを検出するための貴重なツールとして使用できます22。
組成の不均一性は、特定の集団のみがリガンドが存在する可能性のあるタンパク質-リガンド複合体に存在する可能性があります(リガンドが低分子量の場合、分類ステップでは不均一性が除去されない可能性があります)。それにもかかわらず、リガンドモデリングに先立って、画像処理中に3D分類63 ステップを反復的に実行し、リガンドの密度が向上するかどうかを確認することが重要である。タンパク質のコピーが複数存在する場合、初期モデルの生成と改良中にマップ全体に対称性を適用すると、対称性に関連するすべての分子のリガンド密度が平均化される可能性があるため、注意が必要です。対称性は、マップを徹底的に検査して、すべてのタンパク質鎖のリガンド密度の存在を確認した後にのみ行う必要があります。
状態(結晶または溶液)と位置(埋没または表面)に応じて、原子は動的になる可能性があり、モデルの精緻化では、これは原子置換パラメータ(ADP)と呼ばれます。モデル内の不正確さの可能性に対する視覚的な手がかりを提供する差分マップとともに、ADP値を使用して、細分化64、65、66、67後の配位子の精度を評価できます。通常、リガンドは周囲の残基と同様のADP値を持つ必要があります、つまり、リガンドが安定して結合し、正確にモデル化されている場合です。ただし、高分子から遠く離れたリガンドの周辺または原子(脂質など)の配位子は、ADP値が高くなる可能性があります。座標の精緻化に加えて、Refmac 33,34 と Phenix の両方で ADP 値28,68 の精緻化が可能です。Refmacでは、マップ計算中にMott-Bethe近似を使用して個々の原子の電子散乱係数を計算します。Phenixの最近のバージョンでは、原子の無秩序を説明するために、結晶学と同様に個々のB因子の改良が導入されました。クライオ電子顕微鏡から導出された精緻なモデルでは、広範囲のADP値(時にはゼロに近い値)が観察されることが非常に多く、モデルとマップの適合度を評価するためにEMDBで使用されるQスコアでさえ、堆積されたプライマリマップとBファクターシャープニング60の性質に依存する。クライオ電子顕微鏡モデルの構築では、複数のマップが使用されることが多く、多くの高分子の異方性分解能により、1つのマップですべての詳細を説明するのに十分ではない可能性があるため、モデリングとリファインに使用されるマップをメソッドで明確に言及する必要があります。 
高分子のリガンドのモデリングにおいて、クライオ電子顕微鏡マップ(結晶学など)の主な制限の1つは、リガンド結合部位の分解能が低い場合、または結合したリガンドが動的である場合、正しいコンフォメーションを確認することが困難になる可能性があることです。さらに、ほとんどのクライオ電子顕微鏡構造の分解能は3 Å未満であり、マップ内の水分子の表現は限られているため、リガンドや薬物の結合における水和の役割を評価することは困難です(ここではエノラーゼとmGluRの例で示されています)。これらの制限に対処するために、計算方法をクライオ電子顕微鏡データと組み合わせて使用することができる69。結晶学とは対照的に、モデルのみが改良され、マップは改良されません。現在、リガンドの存在を示す、または正確なモデリングを保証する唯一の方法は、(Servalcatなどのツールを使用して)省略マップを生成することです。したがって、研究者がモデルを構築して評価するのに役立つツールは数多くありますが、モデルの改良には、近い将来、新しいアプローチや現在のアプローチの変更が期待できる領域がいくつかあります。
この記事では、リガンド密度の手動検査、リガンドジオメトリファイルの生成、クライオEMマップでのリガンドのモデリングなど、リガンドをモデル化するための現在のアプローチに焦点を当てました。これは、構造生物学と創薬においてエキサイティングな時期であり、より高速なフレームレートの直接電子検出器とより高速なデータ取得70 の使用により、比較的短時間で低分子リガンドに結合することが多いいくつかの高分子の高解像度マップ(<2.8 Å)が得られました。SchrodingerスイートのGEMspot69 やRosettaスイートのEMERALD17 などの自動リガンドモデリングツールが最近導入され、実験的なクライオEMデータを考慮しながらリガンドの最も可能性の高い束縛ポーズを見つけようとするため、このプロセスの合理化と自動化が期待されています。X線結晶構造解析と同様に、クライオ電子顕微鏡による低分子リガンドの結合モードを、おそらく1日に2つ以上同定することが現実的な可能性になると考えられています。

細胞は、無数の化学反応を同時に独立して行うことでその機能を達成し、それぞれが環境の合図に応答して生存と適応性を確保するために細心の注意を払って制御されています。これは分子認識によって達成され、生体分子、特にタンパク質が他の高分子や小分子、またはリガンドと一過性または安定な複合体を形成することを可能にします1。したがって、タンパク質-リガンド相互作用は、タンパク質の発現と活性の調節、酵素による基質と補因子の認識、細胞がシグナルを知覚して中継する方法など、生物学のすべてのプロセスの基本です1,2。タンパク質-リガンド複合体の速度論的、熱力学的、および構造的特性をよりよく理解することで、リガンド相互作用の分子基盤が明らかになり、薬物相互作用と特異性を最適化することで合理的な薬物設計が容易になります。タンパク質-リガンド相互作用を研究するための経済的で迅速なアプローチは、多様な低分子を仮想的にスクリーニングし、これらのリガンドの標的タンパク質への結合モードと親和性を予測する計算方法である分子ドッキングを使用することです3。しかし、X線回折(XRD)、核磁気共鳴(NMR)、またはクライオ電子顕微鏡(クライオEM)によって決定された高分解能構造からの実験的証拠は、そのような予測に不可欠な証拠を提供し、特定のターゲットに対するより新しくより効果的な活性化因子または阻害剤の開発に役立ちます。この記事では、この手法が一般的に呼ばれているように、「cryoEM」という略語を使用しています。しかし、正しい命名法の選択については議論が続いており、最近では、サンプルが極低温にあり、電子で画像化されていることを示すために、cryogenic-sample Electron Microscopy(cryoEM)という用語が提案されています4。同様に、クライオ電子顕微鏡から導出されたマップは、電子ポテンシャル、静電ポテンシャル、またはクーロンポテンシャルと呼ばれてきましたが、ここでは簡単にするために、クライオ電子顕微鏡マップ5,6,7,8,9,10を使用します。
XRDは、タンパク質-リガンド複合体の高分解能構造決定におけるゴールドスタンダード技術でしたが、過去数年間で電子顕微鏡データベース(EMDB)12,13に蓄積されたクーロン電位マップまたはクライオEMマップが急増したことが示すように、分解能革命後の11クライオEMは勢いを増しています14。サンプル調製、イメージング、およびデータ処理方法の進歩により、クライオ電子顕微鏡を使用したタンパク質データバンク(PDB)14の堆積数は、2010年から2020年の間に0.7%から17%に増加し、2020年に報告された構造の約50%が3.5 Å以上の分解能で決定されました15,16。CryoEMは、柔軟な非結晶性の生体高分子、特に膜タンパク質や多タンパク質複合体を原子に近い分解能で研究し、結晶化のプロセスを克服し、XRDによる高分解能構造決定に必要な十分に回折する結晶を得ることができるため、製薬業界を含む構造生物学コミュニティで急速に採用されています。
クライオ電子顕微鏡マップにおけるリガンドの正確なモデリングは、分子レベルでのタンパク質-リガンド複合体の設計図として機能するため、最も重要です。X線結晶構造解析で使用されるいくつかの自動化された配位子構築ツールは、配位子を電子密度17,18,19,20に適合または構築するために、配位子密度の形状とトポロジーに依存します。それにもかかわらず、解像度が 3 Å より低い場合、これらのアプローチは、認識と構築のために依存するトポロジカルな特徴が定義されなくなるため、望ましくない結果を生み出す傾向があります。多くの場合、これらの方法は、リガンドをクライオ電子顕微鏡マップに正確にモデル化するのに効果的ではないことが証明されています。これは、これらのマップが低から中程度の分解能の範囲(通常は3.5 Å-5 Å17)で決定されているためです。
クライオ電子顕微鏡によるタンパク質-リガンド複合体の3D構造決定の最初のステップは、リガンドをタンパク質と共精製するか(リガンドがタンパク質に対して高い結合親和性を持つ場合)、またはグリッド調製前にタンパク質溶液をリガンドと特定の期間インキュベートすることです。その後、少量のサンプルをプラズマ洗浄した穴質TEMグリッド上に配置し、続いて液体エタン中で瞬間凍結し、最終的にクライオTEMでイメージングします。数十万から数百万の個々の粒子からの2D投影画像を平均化して、高分子の3次元(3D)クーロン電位マップを再構築します。これらのマップでリガンドと溶媒分子を同定し、モデル化することは、マップ全体の異方性分解能(すなわち、高分子間で分解能が均一ではない)、リガンドが結合している領域の柔軟性、およびデータ内のノイズのために、多くの場合、大きな課題を提起します。XRD用に開発されたモデリング、改良、および視覚化ツールの多くは、現在、同じ目的でクライオEMでの使用に適応されています18,19,20,21。この記事では、リガンドの同定、モデルの構築、クライオEMから得られる座標の改良に現在使用されているさまざまな方法とソフトウェアの概要を示します。特定のタンパク質-リガンド複合体を用いたリガンドのモデリングに関与するプロセスを、さまざまな分解能と複雑さで説明するための段階的なプロトコルが提供されています。
クライオ電子顕微鏡マップでリガンドをモデル化する最初のステップは、マップ内のリガンド密度(非タンパク質)の同定です。リガンド結合がタンパク質の立体配座変化を誘発しない場合、タンパク質-リガンド複合体とアポタンパク質との間の単純な差分マップを計算すると、本質的に余分な密度の領域が強調表示され、リガンドの存在が示唆されます。このような違いは、2つのマップが必要なだけなのですぐに観察でき、3Dリファインメントのプロセス中の中間マップでも、リガンドが存在するかどうかを確認するために使用できます。さらに、分解能が十分に高い(<3.0 Å)場合、差分マップは、水分子の位置や、リガンドおよびタンパク質残基と相互作用するイオンに関する洞察も提供できます。
アポタンパク質マップがない場合、Servalcat22を使用することが可能になり、これはスタンドアロンツールとして利用可能であり、Refmacリファインメントの一部としてCCP-EMソフトウェアスイート23,24に統合され、CCP4 8.0リリース25,26でも統合されています。Servalcatは、シャープ化されていないハーフマップとアポタンパク質モデルを入力として使用して、FSC加重差(Fo-Fc)マップの計算を可能にします。Fo-Fc 省略マップは、実験マップ(Fo)とモデルから導出されたマップ(Fc)との間の不均衡を表します。モデルにリガンドがない場合、Fo-Fcマップの正の密度が実験EMマップと重なると、通常、リガンドの存在を示唆します。ここでの仮定は、タンパク質鎖がマップによく適合しており、残りの正の密度がリガンドの位置を示すことです。ただし、正の密度がモデリングの不正確さ(タンパク質側鎖の回転子が間違っているなど)に起因するかどうかを細心の注意を払って調べることが重要です。
2番目のステップでは、利用可能な化学情報から明確に定義された形状を持つリガンドのデカルト座標ファイルを取得または作成します。CCP4モノマーライブラリにすでに含まれている標準配位子(ATPやNADP+など)は、モノマーアクセッションコードを介して座標ファイルとジオメトリファイルを取得することで、リファインに使用できます。ただし、不明または非標準の配位子については、ジオメトリファイルを作成するためのさまざまなツールを使用できます。例としては、Phenix28のeLBOW27(電子リガンドビルダーおよび最適化ワークベンチ)、Coot29の組み込みツールであるLidia、JLigand/ACEDRG30,31、CCP-EM23,24、Schrodingerスイート内のGlideのLigprep32-aモジュールなどがあります。次に、リガンド座標ファイルは、実験的なクライオ電子顕微鏡マップとCootの差分マップの両方によって導かれて、密度に適合します。これに続いて、Phenix28 での実空間の改良、または Refmac33 での相互改良が行われます。Linuxワークステーション、または優れたグラフィックカードと上記のソフトウェアを搭載したラップトップが必要です。これらのプログラムのほとんどは、さまざまなスイートに含まれています。CCP-EM24 と Phenix28 は、アカデミック ユーザーが無料で利用でき、Coot、Refmac5 33,34,35,36、Servalcat、phenix.real_space_refine など、この記事で使用されているさまざまなツールが含まれています。同様に、Chimera37 と ChimeraX38 は、アカデミック ユーザーに無料ライセンスを提供します。

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>いくつかの研究所のコンソーシアム</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>学術ユーザー向けに無料で、Coot と X 線結晶構造解析用に開発されたツールのリストが含まれています</td></tr><tr><td>CCP-EM</td><td>いくつかの機関のコンソーシアム</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>学術ユーザー向けに無料で、Coot、Relion、その他多くの</td></tr><tr><td>Coot&nbsp;</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>モデル構築用の一般的なソフトウェアですが、上記の他のスイートでも利用可能</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>いくつかの研究所のコンソーシアム</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>モデルをクライオEMマップにドッキングするためのPhenixスイート内のソフトウェア</td></tr><tr><td>、電子顕微鏡データバンク&nbsp;</td><td>複数の研究所のコンソーシアム</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> <td>電子顕微鏡マップの公開リポジトリ</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>Commercial、サーモフィッシャーのカメラ&nbsp;</td></tr><tr><td>フェニックス&nbsp;</td><td>いくつかの研究所のコンソーシアム</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>学術ユーザーのために無料で、Coot</td></tr>タンパク質<tr><td>データバンク</td>いくつかの<td>研究所のコンソーシアム https://rcsb.org</td><td></td><td>高分子構造の公開データベース</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrodinger</td><td></td> <td>https://pymol.org/2/ 分子ウイルス化ツールが含まれています。教育版は無料ですが、制限があります。フルバージョンは少額の料金で入手できます。</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB、ケンブリッジ</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>クライオ電子顕微鏡画像処理用ソフトウェア、CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientificでも利用可能&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>ディスプレイ、分析、その他のための汎用ソフトウェア</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, USA</td><td></td> <td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/表示、分析などのための汎用ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

クライオ電子顕微鏡法から得られたマップへの配位子のモデリング

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

高分子複合体におけるタンパク質-リガンド相互作用の解明は、分子メカニズム、その根底にある生物学的プロセス、および医薬品開発を理解するために重要です。近年、極低温試料電子顕微鏡(クライオEM)は、高分子の構造を決定し、原子に近い分解能でリガンド結合のモードを調査するための強力な技術として浮上しています。クライオ電子顕微鏡マップにおける非タンパク質分子の同定とモデリングは、対象分子全体の異方性分解能とデータ内在のノイズにより、しばしば困難を伴います。この記事では、リガンドの同定、モデル構築、および選択した高分子を使用した原子座標の精緻化に現在使用されているさまざまなソフトウェアと方法を紹介します。エノラーゼ酵素で示されているように、リガンドの存在を特定する最も簡単な方法の1つは、リガンドがある場合とない場合で得られた2つのマップを減算することです。リガンドの余分な密度は、より高いしきい値でも差分マップで目立つ可能性があります。代謝型グルタミン酸受容体mGlu5の場合に示されているように、このような単純な差分マップを生成できない場合があります。最近導入されたFo-Fcオミットマップを導出する方法は、リガンドの存在を検証および実証するためのツールとして役立ちます。最後に、よく研究されているβ-ガラクトシダーゼを例に、クライオ電子顕微鏡マップのリガンドと溶媒分子のモデリングに対する分解能の影響を解析し、クライオ電子顕微鏡を創薬にどのように使用できるかについての展望を示します。

このプロトコールでは、高分子のクライオ電子顕微鏡マップで低分子リガンドをモデル化するために利用可能なツールを紹介します。

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

私たちは、細胞全体、特に膜界面で発生する生理学的プロセスを理解することに関心があります。私たちはクライオ電子顕微鏡を主な技術として使用し、複数の高分子複合体を研究するさまざまな興味深く困難な生物学的問題に取り組んでいます。膜タンパク質やその他の不安定な複合体の構造を決定することは、数十年前は困難でした。しかし、新しい界面活性剤と脂質模倣剤、およびエンダウメントを備えたクライオ電子顕微鏡の技術的進歩により、これらの複合体の迅速な構造決定への道が開かれました。これらの構造は、現在では高分解能で取得できるようになり、創薬に利用できる可能性があります。単粒子クライオ電子顕微鏡では、安定した均質なサンプルの取得、薄い氷にサンプルをランダムな向きで埋め込むこと、S/N比の低い多数の画像を処理すること、3D再構成時の角度方位と分類を正確に決定することが課題となります。リガンドタンパク質複合体のクライオ電子顕微鏡マップにおける低分子の同定とモデリングは、データに内在するノイズ、等方性で低マップ解像度、サンプルの不均一性、リガンドの柔軟性などの理由から困難です。このプロトコールは、低分解能から中分解能のクライオ電子顕微鏡でリガンドと溶媒分子を同定し、モデリングするためのステップバイステップガイドです。

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クライオ電子顕微鏡法から得られたマップへの配位子のモデリング

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