タンパク質間相互作用に関与する潜在的に多重特異的なペプチド結合ドメインのアミノ酸選好の計算予測

私たちは、より特異的なタンパク質-タンパク質相互作用におけるアミノ酸選好の計算予測のためのプロトコルを提案します。このプロトコルは、これらの相互作用のメディエーターの設計における最初のステップと見なすことができます。私たちは、免疫学技術者において、これらのメディエーターを特定の相互作用の潜在的な阻害剤として使用することに興味を持っています。

特定の結合部位間のアミノ酸の好みを特徴付けるために使用される私たちの実装者は、高価で面倒です。当社のプロトコルは、効率性とシリーズ運用に基づくバイオに裏打ちされた技術です。この戦略は、多数のライン配列を処理する可能性を秘めており、アミノ酸の好みに完全かつ一貫した違いをもたらします。

私たちのプロトコルは、通常限られた数の配列、Webラボアプローチのプロセスからより完全なものよりも好まれる多数のDNA配列を処理することにより、費用対効果の高い専門的なソリューションを提供します。免疫製品の阻害剤の開発に加えて、この方法論の性能を他の製品群と比較したいと考えています。これにより、免疫学的な文脈だけでなく、シグナル伝達やコミュニケーションなどの他の細胞機能においても、多重特異性の構造的基盤をよりよく理解することができます。

まず、タンパク質-タンパク質複合体の構造をダウンロードします。これを行うには、タンパク質データバンクのホームページに移動し、メイン検索ボックスにPDB IDを入力します。構造体のメインページで、[Download Files]をクリックし、[Biological Assembly 1]をクリックして、PDB gz形式のファイルをダウンロードします。

ダウンロードしたストラクチャーをUCSF Chimeraで開きます。「Tools」に移動し、「Structure Editing」に移動し、「Change Chain IDs」をクリックします。最初にAとラベル付けされた2番目のチェーンの名前をBに変更します。次に、[お気に入り]をクリックし、[モデルパネル]をクリックします。

2つのチェーンを持つモデルを選択し、グループ化/グループ解除ボタンをクリックして、各チェーンを異なるモデルに分割します。次に、2つのモデルを選択し、コピー/結合ボタンをクリックします。結合されたモデルの新しい名前を入力します。

[ソース モデルを閉じる] をオンにし、[OK] をクリックします。Selectをクリックし、次にChainをクリックし、ダイマー内のチェーンがAおよびBとして識別されたことを確認します。File and save PDBをクリックして、編集した構造を新しいPDBファイルとして保存します。リガンドタンパク質のターゲットセグメントを特定するには、BUDE Alanine Scanサーバーに移動します。「Structure Upload」の下の「Choose File」ボタンをクリックし、保存したPDBファイルをアップロードします。

次のページで、構造体が正しく読み込まれたことを確認し、サーバー内のジョブの名前を入力します。チェーンAをレセプターとして、Bをリガンドとして設定し、Start Scanボタンをクリックしてジョブを送信します。ジョブが終了したら、[Show Results] をクリックして [Results] ページを開きます。

「残基」リストから、ターゲット結合表面との相互作用が良好であると予測される残基のストレッチを選択します。このプロトコルとアミノ酸セグメントを使用して、IRF5結合表面と相互作用することが予測されました。計算アラニン走査型突然変異誘発を用いて、13個のアミノ酸セグメントが424位から436位まで予測され、p L x ISモチーフはアルギニン432から始まる。

まず、配列多様化のためのタンパク質ペプチド界面を調製します。Chimera で PDB ファイルを開き、ターゲット サブユニットの構造が損なわれず、原子や結合が欠落していないことを確認します。構造からすべての非必須分子を除去するには、[選択]、[残基]の順にクリックし、標準アミノ酸以外のすべての分子を選択します。

次に、[アクション]、[Adams/Bonds]の順にクリックし、削除します。次に、SequenceのFavoritesをクリックし、リガンドと見なされるチェーンをクリックします。リガンド鎖を同定された相互作用セグメントにクロップするには、選択したポジション間の残基を除くすべての残基を削除します。

「File and save PDB」をクリックして、編集した構造を別のPDBファイルに保存します。このファイルを、Rosetta アプリケーションからアクセスできる Linux の場所にコピーします。Rosetta の fixedbb アプリケーションを使用して、このコマンドを実行することにより、シーケンスの多様化の前に塩基構造のすべてのアミノ酸側鎖の再パックを実行します。

次に、次のコマンドを使用して、再パック PDB ファイルの名前を _ repack サフィックスに変更します。次に、pepspecをデザインモードで実行し、このコマンドを使用してシーケンスの多様化を実行します。次に、gen pepspec pwm を使用して pwm を生成します。

Py スクリプトは Rosetta スイートに含まれています。このスクリプトを実行するには、次のコマンドを使用します。配列ロゴを作成するには、前のステップで生成したペプチド配列のファイルを参照のテキストエディターで開き、すべての配列をコピーします。

WebLogoサーバーに移動し、シーケンスをMultiple Sequence Alignmentテキストボックスに貼り付けます。入力の長さに応じてロゴの形式とサイズを選択し、[ロゴの作成]をクリックします。このプロトコルを用いて、IRF5結合表面に保存されたp L x ISモチーフについて、アミノ酸の選好性が予測されました。

配列の多様化時に生成された位置、重量マトリックス、および配列ロゴは、位置432でグルタミン酸を、位置433および435でロイシンおよびイソロイシンを好んで示しました。427位、429位、および436位は、典型的にはSerineが占めており、アスパラギン酸およびグルタミン酸に対する高い選好性を示し、リン酸化およびIRF5二量体化の役割を強調している。位置425はセリンに対する高い選好性を示し、非リン酸化形態でのタンパク質間相互作用への関与を示唆している。