Populus trichocarpaの樹皮の内生細菌および着生細菌マイクロバイオームの定量的評価のためのワークフロー

[プレゼンター]Populus trichocarpaの樹皮の内生菌および上生菌微生物叢の定量的評価のためのワークフローここでは、Populus trichocarpaの内部組織または樹皮の表面にコロニーを形成しているマイクロバイオームを研究するための詳細なワークフローを設計およびテストしました。このワークフローでは、Populus trichocarpaの樹皮の内生および上生マイクロバイオームのサンプリング、収集された材料の処理、ゲノムDNAの抽出、標的領域のPCR増幅、DNAライブラリーの調製、および次世代シーケンシング技術による内生および上生細菌マイクロバイオームのシーケンシングについて詳細に説明しています。また、得られたシーケンスデータの簡単な分析手順も提供します。この実証済みのワークフローは、Populus trichocarpaおよび他の林業種の樹皮の内生および上生マイクロバイオーム群集を経験的に調査するための効果的なアプローチを提供します。生後3か月のポプルストリコカルパの苗木を成長室で育て、滅菌した剪定ばさみを使用して、滅菌した土壌表面から2〜12センチメートルの長さ10センチメートルの茎の部分を切り取ります。茎のセグメントを滅菌した正方形のペトリ皿に入れます。滅菌した四角いペトリ皿で茎の表皮を0.1%の滅菌綿で繰り返し拭きます。トゥイーン20。微生物を含む綿の各部分、エピセティックサンプルを、摂氏マイナス80度の滅菌1.5ミリリットル遠心分離管に保管します。茎の表面を拭いた後、滅菌メスで樹皮を切り開き、樹皮をはがして四角いペトリ皿に入れます。茎から剥がした樹皮を滅菌メスで約1センチメートルのセグメントに切ります。70%アルコールに2分間浸してセグメント表面を滅菌し、次にセグメントを0.1%の次亜塩素酸ナトリウム、トゥイーン80に5分間浸します。最後に、セグメントを70%アルコールで30秒間滅菌します。次に、すべてのサンプルを滅菌蒸留水で3回洗浄し、クリーンなベンチに置いて自然乾燥させます。滅菌された各茎皮内生サンプルを、摂氏マイナス80度の滅菌2ミリリットル遠心分離管に保管します。茎の樹皮切片を滅菌された5ミリリットルの硬いチューブに入れ、各チューブに3つの滅菌スチールビーズを追加します。サンプルの入った硬いチューブを液体窒素で10分間凍結します。樹皮サンプルをビードビーターで5分間粉砕します。次に、ハードチューブを液体窒素で1分間再度凍結し、ビーズ叩きステップを5分間繰り返します。ポプラス・トリコカルパの砕いた茎皮と綿に付着した上胚細菌群集をそれぞれ0.25グラムずつビーズチューブに加え、市販のキットから供給される60マイクロリットルの溶液C1を加え、反転で穏やかに混合します。次に、ビーズビーターを使用して、内生サンプルと上生サンプルを1分間の4回のランで均質化します。各実行後、サンプルを氷の上に30秒間置きます。チューブを重力10,000倍で1分間遠心分離し、製造元の指示に従ってキットを使用して内生サンプルとエピセティックサンプルを抽出し、30マイクロリットルの溶液C6を白色フィルターメンブレンの中心に加え、摂氏25度で5分間インキュベートします。室温で重力10,000倍で1分間遠心分離します。微量分光光度計を使用して、エピセティックおよび内生サンプルから抽出されたゲノムDNAの濃度を測定します。各DNAサンプルを滅菌ddH2Oで1マイクロリットルあたり2ナノグラムに希釈して、PCR増幅用のDNAテンプレートを取得します。順方向プライマー799Fと逆方向プライマー1193Rを用いて細菌16S rRNA遺伝子のV5からV7領域を増幅する一方、フォワードプライマー5115Fとリバースプライマー806Rを使用して、細菌16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅します。すべてのサンプルを完全に混合し、遠心分離して気泡を除去します。 サーマルサイクラーで細菌の16S rRNA遺伝子のV5からV7またはV4領域の増幅を行います。各サンプルアンプリコンを5マイクロリットルを1%アガロースゲルにロードし、120ボルトで30分間電気泳動を行います。UVライトの下でゲルを観察して、PCR増幅の成功を検証します。各サンプルについて、PCR増幅産物をPCRチューブに3回繰り返し混合します。増幅された製品の濃度は、製造元の指示に従って市販のキットを使用して測定します。マイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定します。標準的なDNA曲線をプロットし、それを使用して増幅された産物のDNA濃度を計算します。測定された濃度に従って、Populus trichocarpaの樹皮から得られた内生体または着生サンプルのPCR産物を等しい濃度で混合して、Ampliconライブラリを構築します。電気泳動装置を用いてアガロースゲル電気泳動を行う。1.3%アガロースゲル、1.3グラムのアガロース粉末を100ミリリットルの1倍TAEバッファーに簡単に調製します。ゲル固化後にコームを取り外し、ゲルを1倍のTAEバッファーを入れた電気泳動タンクに入れます。次に、オレンジ色の6倍ローディングバッファーの1容量単位を各PCR産物の5容量単位に加え、各ウェルに100マイクロリットルのラダーをロードします。30マイクロリットルのDNAラダーを1つのウェルに加えます。プラス線とマイナス線を接続した後、80ボルトで50分間電気泳動します。清潔で鋭利なメスを使用して、アガロースゲルからDNA断片を切除します。ゲルスライスの重量を量り、無色のチューブに移します。バッファーを加えてゲルスライスを浸します。メーカーの指示に従って、ゲル抽出キットを使用してゲル抽出を実行します。シーケンシングプロファイリングのためのメーカーのプロトコルに従って、市販のキットを使用して蛍光計で精製されたAmpliconライブラリの濃度を測定します。蛍光計を使用して標準アッセイチューブとサンプルアッセイチューブを読み取り、単一のバンドを視覚化してライブラリの品質を確認します。CHAM IIを使用して16S rRNA遺伝子配列を解析し、注釈を付けます。参照配列に従ってシルバーデータベースを使用して分類学的注釈を作成します。これらの結果を R の ggplot2 パッケージを使用して視覚化します。Populus trichocarpa の樹皮の内生細菌および上生細菌マイクロバイオームの高品質のゲノム DNA が得られました。12サンプルすべてのPCR増幅により、正しいサイズの単一の強いバンドが得られました。Ampliconライブラリーは、シーケンス前の要件を満たす単一のピークでさらに構築されました。内生マイクロバイオームについては、プライマーペア799F/1193Rと515F/806Rをそれぞれ使用して高品質のリードが得られました。プライマーペア799F/1193Rは、増幅された植物リードを大幅に減らしました。Populus trichocarpaの樹皮の表皮マイクロバイオームからのASVの数は、515F / 806Rプライマーと比較して、799F / 1193Rを使用した場合有意に多かった。シャノン指数は、プライマーペア799F / 1193Rを使用して、内生細菌群集よりも樹皮の着生細菌群集で低いと推定されました。Populus trichocarpaの内生および着生樹皮部分における細菌群集の分類学的特徴は、プライマーペア799F / 1193Rを使用してさらに調査されました。Populus trichocarpaの樹皮の内生菌および上生細菌マイクロバイオームの組成と多様性を定量化するために、サンプル収集からデータ分析までの信頼性が高く効率的なワークフローが構築されました。私たちのプロトコルは、木本植物種の樹皮マイクロバイオームを研究するための道として機能し、他の木本植物に生息する細菌群集の特徴をより深く理解できるようになる可能性があります。