Name: 熱可塑性マイクロ流体チャネルの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-03T23:56:00.000+00:00
Duration: 16 min
Description: 学ぶマイクロホットエンボスと熱圧着を用いた熱可塑性マイクロ流体デバイスの作製法。シリカ粒子を用いた固相抽出による核酸分離技術も含み、PCR増幅や診断への応用が可能です。

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マイクロ流体チャネルは、環状ポリオレフィン（ゼオネックス® 690R、ゼオンケミカル（株）、ルイビル、ケンタッキー州）で製造されています。ゼオネックスは、多孔質モノリスの形成に使用される光の指示化学に不可欠である、136 ° Cのガラス転移温度（T g）を持ち、透明なUVです。マイクロチャネルは、マイクロ流体プラットフォームの負の（逆）機能を持っているニコ電鋳マスターモールドとのマイクロホットエンボス加工によって製造される。ホットエンボス加工は、次のとおり行われます。 <ol><li>金型およびポリマー基板は、2つの平行な金属のプラテンの間に配置されています。 </li><li>プラテンは、ゼオネックスのT gを上記の30 º Cであるエンボス加工温度（166℃）、まで加熱されています。 </li><li>プラテンは、その後約5分間一緒に押され、圧力は250 psiで維持されます。 </li><li>モールドと基板は、その後1〜2分のために冷却し、加熱されたプラテンから削除し、手動で互いに分離される。 </li><li> 1.5 mm径の井戸は、サンプル導入および収集のためのチャネルの両端で掘削されています。 </li><li>エンボス加工プラスチック基板は、熱的に同封のマイクロ流体チャネルを形成するために、ゼオネックスの別の部分で接着されている。エンボス加工基板とカバー部分は、UV -オゾンやシール効率を向上させ、密閉チャネル構造（はなはだとKlapperich、2007）の再現性を保証するために、前に熱接合にプラズマ処理することができます。 </li></ol>プラスチック製マイクロ流体チャネル内の固相抽出（SPE）カラムの作製固相の作製は、2段階のプロセスです。最初は、製造されたマイクロチャネルは、プラスチック製のデバイスにSPEカラムの密着性を向上させるために表面修飾される。表面の光重合を経由してグラフト重合する高分子マイクロチャネルの壁を官能化するために使用されます。 移植の手順は以下の通りです： <ol><li>マイクロチャネルは、水素抽象化する光開始剤である3％のベンゾフェノン、とエチレンジアクリレート（EDA）とメチルメタクリレート（MMA）の1:1混合物で充填される。 EDA、MMA及びベンゾフェノンはSigma - Aldrich、セントルイス、MOから購入されています。 </li><li>チップは、紫外線露光器（CL - 1000 UV架橋剤、UPV社、アップランド、カリフォルニア州）で254 nmの紫外波長と200ミリジュール/ cm 2のエネルギーで10分間後、UV照射です。接ぎ木は、H -抽象化重合と第二段階におけるモノリスの調製に用いられる重合混合物内に取り込まなくては表面テザーポリマー鎖、の結果を介して行われます。 </li><li>過剰のモノマーを真空吸引を使用して、メタノールの15μLを洗浄することによりチャネルから削除されます。 </li></ol>グラフトプロセスの後、微孔質ポリマーモノリスは、DNAの抽出のための捕捉シリカ粒子そのマイクロチャネル内に形成される。 多孔質モノリスは、以下のように その場で調製されています。 <ol><li>表面改質されたチャンネルはBuMA（15重量％）、EDMA（10％重量）、1 - ドデカノール（52.5重量％）、シクロヘキサノール（22.5重量％）、DMPAPから成るモノリス前駆体の混合物に関して、（1重量％で充填される単量体）と0.7μmのシリカ粒子（プレポリマー混合物の合計量に対して15％）まで。 MO、セントルイス、シリカ微小球はPolysciences社（ウォリントン、PA）から購入し、モノマーとporogenic溶剤はSigma - Aldrichから購入されています。 </li><li>チップは、重合を開始、1.1分、200ミリジュール/ cm 2でUVクロスリンカーでUVを照射され、そして過剰のモノマーを真空吸引を使用して、メタノールの15μLを洗浄することによりチャネルから削除されます。 </li><li>流体接続（NanoPorts TM接続、アップチャーチ科学、オークハーバー、ワシントン州）は、その後、マイクロ流体チャネルの導入と収集井戸の上に貼付されています。 </li><li>多孔質モノリスは、100mL/hourの流量でシリンジポンプを使用して少なくとも30分間、メタノールで再び洗浄した。 </li></ol>プラスチック製マイクロ流体チャネル内のCNT溶解モノリスの作製 CNT（カーボンナノチューブ）溶解モノリスの作製は、2段階のプロセスです。最初に、作製したマイクロチャネルは、プラスチック製のデバイスでのSPEカラムの場合と同じ方法で表面改質（接木）です。 グラフトプロセスの後、微孔質ポリマーモノリスは、多層カーボンナノチューブを含浸されるマイクロチャネル内に形成される。 多孔質モノリスは、以下のように その場で調製されています。 <ol><li>多層ナノチューブは、2.27Mの濃度でシクロヘキサノールに再懸濁する。この再懸濁は、超音波処理細胞内分泌かく乱（超音波処理S - 250と振幅の50％と50％のデューティサイクルで30分間超音波処理され超音波ブランソン、ダンベリー、コネチカット州）製D、。超音波処理は、CNTの効果的かつ安定した0.5Mサスペンションを提供した。 CNTはNanolabs（ブライトン、MA）から購入した。 </li><li>表面改質されたチャネルは、シクロヘキサノールのその今のソリューション+ CNTが使用されているを除いて同様のモノリス前駆体の混合物で充填される。モノリスの混合物はBuMA（15重量％）、EDMA（10％重量）、1 - ドデカノール（52.5重量％）、およびシクロヘキサノール+カーボンナノチューブ（22.5重量％）で構成されています。この溶液に、光開始剤のDMPAPは（モノマーに対して重量1.13パーセント）が追加されます。モノマー、porogenic溶剤とDMPAPAはSigma - Aldrich、セントルイス、MOから購入されています。 </li><li>チップは、重合を開始するために0.9分、120ミリジュール/ cm 2でUVクロスリンカーでUVを照射する。デバイスはcrosslikerで180度反転、120 MJ / cm 2の別の0.9分間照射する。過剰のモノマーを真空吸引を使用してメタノール50μLで洗浄することによりチャネルから削除されます。 </li><li>流体接続（NanoPorts TM接続、アップチャーチ科学、オークハーバー、ワシントン州）は、その後、マイクロ流体チャネルの導入と収集井戸の上に貼付されています。 </li></ol> CNT溶解モノリスで使用するための細菌サンプルの調製細菌のサンプル用のサンプル調製には、チャネルの目詰まりを避けるために、サンプルが極端にそう集中されていないことを確認するために600nmの光学濃度の測定を行う伴います。 <ol><li>メディアの中の細菌と600nmの時のODの読み値を取得、これは暗順応計（エッペンドルフ暗順応計、エッペンドルフサイエンティフィック社、ウェストベリー、ニューヨーク州）で行われます。 ODの測定値が範囲0.18〜0.25 Aの内に収まるまで、サンプルを希釈する</li><li> 5分間6500 rpmでサンプルを遠心し、上清をデカントする。 </li></ol>溶解<ol><li> GuSCN * + 0.01パーセントSDS + 4％プロテイナーゼK（0.8mg/ml）で再懸濁します細菌。軽くボルテックスして（メディアの中の細菌1mlの1ミリリットルGuSCNに再懸濁しする必要があります）。プロテイナーゼKは、細菌のDNAに接続されているとDNAasesとRNAasesを抑制するタンパク質を変性を支援するために溶液に添加した。プロテイナーゼKの別の利点は、それはまた、グラム陰性細菌は、通常より多くのタンパク質を持っているものの、グラム陽性菌およびグラム陰性細菌の細胞壁の両方がタンパク質を大量に（含まれているため、望ましい細胞壁のタンパク質を分解することで助けることです。 ）。カオトロピックバッファは、さらに界面活性剤は細胞壁を破壊しながらタンパク質を変性とプロテイナーゼKを助けます。プロテイナーゼKとグアニジンチオシアネート（GuSCN）はキアゲン社（バレンシア、カリフォルニア州）から購入した。 SDSは、（ドデシル硫酸ナトリウム）ピアース（ロックフォード、IL）から購入した。 </li><li>すぐにPEEKチューブに接続してシリンジでサンプルをロードする。空気がシステムに存在しないようにシリンジを吸引除去する。 nanoportとチャネルにチューブを接続します。 </li></ol> KDS100シリンジポンプ（KDサイエンティフィック、ホリストン、MA社製）を実験に使用され、使用される流量は、すべてのステップを450μL/時間ですされました。 450ul/hrでのサンプル溶解のチャネルを流れる。 <ol><li>サンプルを収集し、SPEを経由してDNAの抽出（DNA抽出プロトコールを参照）に進みます。注意：懸濁液をGuSCNされているため、この細菌のサンプルは、負荷ステップ2を実行する必要はありません* </li></ol> DNA抽出プロトコル抽出操作は3ステップで構成されています： <ol><li>負荷。 </li><li>ワシントン州</li><li>溶出。 </li></ol> KDS100シリンジポンプ（KDサイエンティフィック、ホリストン、MA社製）を実験に使用され、使用される流量は、すべてのステップのための300μL/時間であった。 負荷<ol><li>条件の実験を開始する前に1〜2分間カオトロピックバッファ（GuSCN *、グアニジニウムチオシアネート）を使用してチャネル。 </li><li> 1:1の比率でカオトロピックバッファーでサンプルを混ぜる。 </li><li> 3分間チャネルを介してフローサンプルの混合物。 </li></ol>洗う<ol><li> 2分間70％エタノールを使用してチャネルを洗ってください。 </li><li> 2分間100％エタノールを使用してチャネルを洗ってください。 </li></ol>溶出する<ol><li> 3分間ミリポア水で抽出したDNAを溶出する。精製、PCR用DNAの15μLを収集する。 </li></ol> *キアゲンのキット（バッファRLT）からGuSCNが使用されました。

<ol><li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+chemical+analysis+of+plasma+and+ultraviolet-ozone+surface+treatments+for+thermal+bonding+of+polymeric+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7, 876-882 (2007).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

熱可塑性マイクロ流体チャネルの作製

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

私たちの研究室では、我々が正常に直接ポリマー/ナノ粒子複合材料のマイクロ溶解し、固相抽出カラムを用いて、ヒト血液、尿や便のマイクロリットルとsubmicroliterボリュームから核酸を単離した。回収したサンプルは、追加のクリーンアップを行わず、PCRableな集中、少量のサンプルです。ここでは、ホットエンボス加工とヒートシールを使用して熱可塑性マイクロ流体チップを作製する方法を示します。その後、我々は複合固相カラムを形成するために密封されたチップを介してその場の光監督接ぎ木面や重合で使用する方法を示します。私たちは、細菌の細胞溶解のために移植し、カーボンナノチューブ/ポリマー複合列の重合を実証。私たちは、その後、シリカ/ポリマー複合カラムを用いてチップ上のサンプルからの核酸の固相抽出に続いて溶解処理を示しています。添付のプロトコールは、溶解し、固相抽出カラムの両方を作成する方法に関する詳細な指示が含まれています。

ここでは、ホットエンボス加工とヒートシールを使用して熱可塑性マイクロ流体チップを作製する方法を示します。その後、我々は、複合固相カラムを形成するために密封されたチップを介してその場の光監督接ぎ木面や重合で使用する方法を示します。

当研究室では、...を用いることにより、マイクロリットルおよびサブマイクロリットル量のヒト血液、尿、および糞便から核酸を直接分離することに成功しました。

こんにちは。私はAida Priaです。BUにあるKatherine KLAS博士の研究室で博士号を取得しました。本日は、マイクロホットエンボス成形と熱接合を用いた熱可塑性マイクロ流体デバイスの作製について実演します。さらに、シリカ粒子を含む固相を用いた核酸の抽出方法を実演します。抽出された核酸は、PCR増幅検出やその他の診断モジュールに使用することが可能です。こんにちは、ボストン大学のバイオメディカル・マイクロデバイス・マイクロエンバイロメント研究室の大学院生、ドミニカ・カリンスキです。ここでは、カーボンナノチューブ溶解モノリスの作製とマイクロ流体デバイスについて、また、DNA抽出のための固相抽出モノリスの作製とマイクロ流体デバイスについてお話しします。本日は、熱可塑性マイクロ流体チャネル内におけるマイクロスケールの溶解カラムおよび固相抽出カラムの製造とその応用に関する実験を実演します。これらのカラムは、細菌細胞の溶解および細胞溶解液からの核酸の単離に使用できます。プロセスの最初のステップは、マイクロ流体デバイスの作製です。環状ポリオレフィンには、商標名 xx XX six 90 R として提供されるポリマーを使用しており、これはガラス転移温度が 136 °C であり、UV透過性を備えています。マイクロ流路内での多孔質モノリス作製に用いられる光指向性化学反応において、UV透過性は非常に重要です。このマイクロ流体プラットフォームは、マイクロホットエンボス加工と熱接合を用いて作製されます。まず、マイクロホットエンボス加工のプロセスについて説明します。まず、ニッケルコバルト電解成形によるマスターモールドから開始します。このモールドには、マイクロ流体プラットフォームに必要な構造のネガ、つまり反転した形状が形成されています。プラスチック基板上で必要となる構造の上に、Zion Nexパレットを配置します。その後、モールドをホットプレスに入れ、ポリマーのガラス転移温度より30°C高い温度まで加熱します。その後、別の金属プレートで覆い、約50〜500 PSIの範囲で加圧します。5分後、圧力を解放してPLAを取り除きます。これを少し冷却した後、2枚のプレートを手動で分離し、基板からモールドを剥離させます。これが基板の外観です。モールドから取り出した後、チャネルの両端に直径 1.5 mm の穴を開け、導入ウェルおよび回収ウェルとして使用します。その後、このエンボス加工された基板を別の平坦なプラスチック片と熱接合し、マイクロ流体構造を形成して密閉します。2つのピースをこのようにホットプレート上に貼り付けます。温度をポリマーのガラス転移点である136 °Cまで下げます。熱接合プロセスのため、再び金属プレートをホットプレスに設置します。ホットプレスをガラス転移点である136 °Cに加熱し、250 PSIで2分間圧着させます。ガラス転移点に達すると、ポリマーが溶融して互いに融合し、これにより密閉されたマイクロ流体構造が形成されます。2分後、圧力を解放します。これが、密閉チャネルとサンプル導入および回収用のアクセスポートを備えた最終的なマイクロ流体デバイスの外観です。次に、多孔質ポリマーモノリスを形成するためのマイクロチャネルの準備を行います。このプロセスの最初のステップはグラフト工程です。マイクロチャネルおよびXan X six 90 Rプラットフォームの表面化学性を変化させます。これは、マイクロチャネル内に多孔質ポリマーモノリスを共有結合させるために必要です。この表面修飾はグラフト化プロセスであり、EDAとMMAを1:1の比率で用い、光開始剤としてベンゾフェノンを使用します。ここでは、MMAとEDAを1:1の濃度で溶液に調製しています。また、チャネル内でこのモノリスを架橋させるために、3%のベンゾフェノンを添加します。グラフト溶液を混合した後、それをマイクロチャネルに注入すると、毛細管現象によってチャネル内が満たされます。チャネルが満たされたら、これをUVクロスリンカーに配置し、エネルギーレベル 200 mJ/cm² で10分間架橋させます。10分間のUV照射後、グラフト溶液とマイクロチャネルをメタノールで洗浄し、この操作には真空吸引を用います。ここでは、チャネルの一端にメタノールを配置し、真空を用いてチャネル内をメタノールで洗浄します。これは、重合しなかった過剰な溶液を除去するためです。これは、カーボンナノチューブの濃度をすべて 2.27 molar としたときの、cyclo、ethanol、および cyclin の比較です。カーボンナノチューブを含むCyclinは、溶液中でカーボンナノチューブを均一に分散させるために撹拌されます。グラフト工程の後、表面化学性が修飾され、マイクロチャネル内へのモノリスの強固な固定が可能になります。それでは、カーボンナノチューブVICISモノリスの作製について説明します。これは、遺伝子、溶媒、およびモノマーで構成されています。このプロセスに関与する4つの要素は、al to ecol、メタクリル酸ブチル、およびEDMAです。さらに、UV重合を用いてその場でモノリスを形成できるように、光開始剤を添加します。100 µLのサンプルを作製します。ecolを52.5 µLピペッティングします。ecolは粘性が高いため、ゆっくりと行う必要があります。ecolの後、シクロアノールと共にカーボンナノチューブを添加します。適切に分散させるため、数分間激しくボルテックスする必要があります。この溶液は粘性があるため、シクロアノールとカーボンナノチューブはゆっくりとピペッティングしてください。次に、15 µLのブチルメタクリレート（butyl meth Aly）を加えます。最後に、10 µLのEDMAを加えます。これを短時間ボルテックスし、光開始剤を加えてから、超音波処理を行います。溶解用モノリスに添加する光開始剤はDM PAPです。これを100 µLの溶液全量に対して1.13の濃度で添加します。添加後、これは光開始剤であるため、超音波処理を行う間、光にさらされないよう溶解用モノリス溶液を遮光してください。これを振幅50%、デューティサイクル50%で30分間処理します。デューティサイクルを50%にするのは、溶液の過熱を防ぐためです。超音波処理後、速やかに溶液を取り出して作業を行うことが極めて重要です。これは、溶液をマイクロチャネルにピペッティングするため、カーボンナノチューブを溶液中に均一に分散させる必要があるためです。ここに溶解液を用意します。超音波処理の直後、速やかにこの溶液を毛細管現象を利用してマイクロチャネルにピペッティングし、チャネル内へ流し込みます。これを架橋剤に入れ、エネルギーレベル120 Millies per centimeter squareで0.9分間処理します。この0.9分後、デバイスを反転させます。この反転操作は、基本的に重合をより均一にし、チャネル内のカーボンナノチューブの分布をより均一にするためのものです。モノリスの重合が完了し、メタノールで洗浄すると、内部のモノマー溶液は透明ではなくなり、鮮やかな白色になります。そこには、モノリス中のカーボンナノチューブである小さな黒い斑点が見られます。固相抽出モノリスは、カーボンナノチューブ溶菌モノリスと同様の方法で作製されます。こちらは細菌の液体培養であり、ここに培地のサンプルがあります。サンプルの希釈後、これを遠心管に分注し、遠心分離します。次に、エプンドチューブの側壁にある細菌ペレットを乱さないように注意しながら、培地をデカンテーションで除去します。その後、グアニジン、チオシアネート、SDS、およびプロテアーゼKを含む溶液で細菌を再懸濁します。分注するグアニジンチオシアネートの量は、細菌を懸濁させた液量と同量にします。ここでは、細菌が1 mLに懸濁されているため、細菌を1 mLのグアニジウムチオシアネートに再懸濁します。次にプロテアーゼKを添加します。45 µLのプロテアーゼKとRNA添加剤を加えます。最後に添加する溶液はSDSです。その後、溶液をボルテックスで攪拌します。攪拌後、細菌サンプルを使い捨てシリンジにピペットで移します。ここでは、3 mLのExcel使い捨てシリンジを使用しています。ここにはピークチューブに接続可能なルアー継手があり、ナノポートを介してデバイスに接続します。次に、使い捨てシリンジに溶液をピペットで注入します。システム内に気泡が入っていないことを確認するため、吸引を行います。反対側から1、2滴出てくるまでこの操作を繰り返します。デバイスに接続するための溶液が準備できたら、使い捨てシリンジをKDSシリンジポンプにセットし、フィッティングの端をデバイスに接続します。このデバイスの両端にはナノポートが配置されており、これによりデバイスへの確実な接続が可能になります。これらはネジ継手であり、通常はデバイスをテープで固定して、反転しないようにします。ここでは、流量を1時間あたり4〜5 mLに設定します。これはディスプレイスメントポンプであり、溶液をシリンジ、チューブ、そしてこの接続部を経由してチャネルへと強制的に流します。そして、この出口ナノポートを通してサンプルを回収します。ピペットを用いて汚染物質を回収し、この汚染物質を次の段階である固相抽出工程にかけ、核酸分離のための細菌DNAを単離します。シリカ粒子を含む固相は、グアニジンチオシアネートを含む溶菌バッファーでコンディショニングされます。これは、シリンジに溶解バッファーを満たしてシリンジポンプに取り付け、300 µL/hの流速でチャネル内にバッファーを流すことで行われます。続いて、サンプルをロードします。ここでのサンプルは、前の溶解ステップで得られた細菌細胞溶解物です。再び、このサンプルを流速 300 µL/hr で3分間ロードします。その後、チャネルを 70% エタノールで、同様に流速 300 µL/hr で洗浄します。この洗浄ステップにより、吸着したタンパク質と不純物がすべて除去され、廃棄物は回収容器に回収されます。洗浄ステップ後、ピペットを使用して、すべての不純物を除去します。その後、シリカに結合していたDNAを水で溶出させます。こちらにあるシリカシリンジには、純水が入っています。チップに接続し、再び300 µL/hの流量で水を流して、反対端からサンプルを回収します。この操作を3分間行い、15 µLの流出液を回収します。これは水に溶解した純粋なDNAであり、熱可塑性デバイスの作製に向けたPCR準備が整った状態です。最大の課題は熱接合の工程です。接合はポリマーのガラス転移温度付近の非常に高い温度で、圧力を加えて行われます。圧力や温度がわずかに変動するだけで、チャネルが完全に潰れたり、2つのプラスチック部品間のシール不良が生じたりする可能性があります。したがって、最適な温度と圧力を維持することが非常に重要であり、それは少々困難な場合があります。このプロセスにおいて困難な主要要素は、in situ UV重合させるモノマー溶液中にカーボンナノチューブを均一に分散させることです。これは、固相抽出用の多孔質ポリマーモノリスにおいてシリカ粒子を均一に分散させることと同様の課題です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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