Name: 新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: 学ぶ 新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための蛍光法。カルセインを用いた無細胞アッセイは、迅速かつ低コストでがん治療薬スクリーニングを支援し、代謝阻害の研究に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>新規鉄キレート剤の検出のための蛍光アッセイ

<ol><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%3A+An+essential+element+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Iron: An essential element of cancer metabolism.</a> Cells. 9 (12), 2591(2020).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+More+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: More ore to be mined.</a> Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+and+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).</li>
<li>Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer.</a> Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).</li>
<li>Welch, D. R., Hurst, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+hallmarks+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the hallmarks of metastasis.</a> Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).</li>
<li>Lehmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+defects+of+hepatocellular+carcinoma+are+already+found+in+non-neoplastic+liver+cells+from+patients+with+hereditary+haemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis.</a> Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).</li>
<li>Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer+risk--a+systematic+review+and+meta-analysis+of+the+epidemiological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).</li>
<li>Abdelaal, G., Veuger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+oncogenic+transformation+with+iron+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reversing oncogenic transformation with iron chelation.</a> Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+and+impact+in+cancer+biology%2C+metastasis%2C+and+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology.</a> Front Oncol. 10, 476(2020).</li>
<li>Menyhárt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).</li>
<li>Basu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+and+diverse+iron-chelators+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovering novel and diverse iron-chelators in silico.</a> J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).</li>
<li>Prus, E., Fibach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+measurement+of+the+labile+iron+pool+in+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells.</a> Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harb. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphate-buffered+saline+%28pbs%29%22">Phosphate-buffered saline (pbs)</a>. 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).</li>
<li>Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+development+of+deferiprone+%28l1%29+and+other+iron+chelators+for+clinical+use%3A+Targeting+methods+and+application+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects.</a> Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>硫酸アンモニウム鉄(II)、六水和物</td>、<td>シグマ-アルドリッチ</td><td>、215406</td><td>、その他の賢明なFAS</td></tr><tr><td>カルセイン</td>、<td>シグマ-アルドリッチ</td><td>、C0875</td><td></td></tr>、<tr><td>デフェリプロン</td><td>、シグマ-アルドリッチ</td><td>、</td>379409<td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&プライムとして知られています。リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>マグネシウムおよびカルシウムを含まない</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 ウェルプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812</td><td>光学的に透明な 96 ウェルプレートが機能します</td></tr></tbody></table>

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法 

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

ステップ2で示した方法では、この最初の実験(図1)により、カルセイン蛍光発光を検出する際のマイクロタイター蛍光プレートリーダーの線形範囲が確立されました。私たちの代表的な結果は、0〜100μMのカルセイン蛍光の広い線形範囲を示しています。LSDの事後分析によるANOVAは、0μMのカルセインのコントロールと比較した場合、すべてのカルセイン濃度の平均RFUに統計的に有意な差があることを示しています。さらなる実験では、0 μMコントロールと統計的に有意な差を生じ、フローサイトメトリー13でカルセインAMの形で細胞に一般的に適用される範囲内に収まるため、1 μMカルセインを使用しました(ステップ3および4)。
ステップ3で示した方法では、Fe2+ の形態の鉄を0〜1000μM(FASとして)から1μMのカルセインの範囲で添加すると、Fe2+ イオンによってカルセイン蛍光(RFU)が直線的に減少することを示しています。これにより、カルセイン蛍光のFe2+ ベースの消光を観察することができます。カルセインは弱い鉄キレート剤として鉄を結合し、これにより蛍光出力が減少します。 図2では、8.9 μM FAS以上の濃度では、1 μMのカルセイン単独と比較して、カルセイン蛍光のp&lt;0.001の有意な減少が示されました。8.9 μM の FAS を使用した場合、カルセイン蛍光 (平均 RFU) が 33% 減少しました。さらなる実験(ステップ4)では、10 μM FASがカルセインの蛍光消光範囲内に収まったため、FASを使用しました。
ステップ4で示した方法では、鉄キレート剤によるFe2+ イオンに対するカルセインの競合を 図3で観察できます。Fe2+ の形態の鉄は、1 μMコントロールからのカルセイン蛍光を減少させ、鉄キレート剤デフェリプロンはこの蛍光をピークまで増加させ、カルセインの鉄消光を放出し、蛍光を増加させます(平均RFU)。0.97〜512μMの範囲の濃度でデフェリプロン(模範として使用)すると、ANOVAおよびLSDの事後分析で観察された蛍光が統計的に有意に増加しました(p&lt;0.001)。最大の倍率変化は、1 μM のカルセイン AM と 10 μM の FAS の対照と比較した場合の、62.5 μM のキレート剤での平均 RFU が 3 倍に変化したことです。512 μMのデフェリプロンを超える場合、キレート剤と1 μMのカルセインおよび10 μMのFASのコントロールとの間に統計的に有意な差はありませんでした。.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig01.jpg"> 図1:蛍光マイクロタイタープレートリーダーを使用して測定したカルセイン濃度と蛍光(RFU)。 0-100 μMのカルセイン濃度を30分間インキュベートし、測定した蛍光(RFU)をここに示します。データは、実験ごとに8回の反復と3つの独立した実験の平均を示しており、エラーバーは平均の95%信頼区間を示しています。統計的有意性は**で表され、ここでp&lt;0.001は、ANOVAおよびLSDの事後分析(グラフパッドプリズムを使用して計算)を使用して決定されます。各濃度の平均カルセインRFUを、PBSおよび0 μMカルセインのコントロールと比較します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig02.jpg"> 図2:FASの濃度が増加すると、カルセイン蛍光が直線的に減少します。 FASの濃度は、PBSでの30分間のインキュベーション後に1μMのカルセイン蛍光の線形減少をもたらした0〜1000μMから増加した示されているデータは、実験ごとに5回の繰り返しの平均と3つの独立した実験であり、エラーバーは平均で95%の信頼区間を示しています。統計的有意性は**で表され、ここでp&lt;0.001は、ANOVAおよびLSDの事後分析(グラフパッドプリズムを使用して計算)を使用して決定されます。各濃度のFASおよび1 μMのカルセインの平均RFUを、PBS中の1 μMのカルセイン0 μMのFASの対照と比較します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig03.jpg"> 図3:デフェリプロンの濃度の増加。 デフェリプロンの濃度は、PBS中の1μMカルセイン、10μMのFASをインキュベートして0〜1000μMに増加させました。 蛍光は、マルチモーダルマイクロプレートリーダーで測定しました。示されているデータは、実験ごとに 5 回の反復と 3 回の独立した実験の平均であり、エラーバーは平均の 95% 信頼区間を示しています。統計的有意性は**で表され、ここでp&lt;0.001はANOVAおよびLSD事後分析(グラフパッドプリズムを使用して計算)を使用して決定されます。平均RFUは、PBS中の1μMカルセインと10μMのFASおよび0μMのデフェリプロンと比較した場合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>濃度(μm)</td>
			<td>ボリュームは(1 mMストック)</td>
			<td>PBSの量</td>
			<td>総ボリューム</td>
		</tr><tr><td>800</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>200μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>400</td>
			<td>400μL</td>
			<td>600μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>200</td>
			<td>200μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>100μL</td>
			<td>900μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>950μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>25μL</td>
			<td>975μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>990 μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>994 μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>998μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>999μL</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr></tbody></table>表1:カルセイン二次ストックの調製。

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

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