Name: 細菌クリアランスの測定による 線虫 の食物摂取量の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学ぶ細菌クリアランスアッセイによるCaenorhabditis elegansの食物摂取量定量化法。神経科学と行動生物学の研究に適し、薬物処理による摂食行動と寿命の関連を解析できます。

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Xiaolan Ye氏に感謝したいと思います。このプロトコルは、彼女が最初に行った観察の結果として開発されたものです。このプロトコルの開発と最適化にご協力いただいたPetrascheck Labの過去および現在のすべてのメンバーに感謝します。この作業は、R21 AG080376 (to M.P.) によって資金提供されました。一部の株は、NIH研究インフラストラクチャープログラム局(P40 OD010440)が資金提供するCGCによって提供されました。

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig01.jpg"> 図1:バクテリアクリアランスアッセイの概略図。プロトコルの主要セクションのグラフ概要(上から下へ):細菌の調製、線虫集団の同期、96ウェルプレートへの播種、線虫の滅菌、薬剤の追加、1日目と4日目のOD600の測定。これらの具体的な手順の詳細な説明は、各図の左側に示されています。略語:OD =光学密度;FUdR = フルオロデオキシウリジン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
1.バクテリアの準備
注:このセクションでは、このアッセイで使用される摂食細菌の調製について詳しく説明します。アッセイで使用される特定の 大腸菌 株はOP50と呼ばれます。OP50は、 C.エレガンスの餌として最も広く使用されている株です。使用されるOP50株はカルベニシリン/アンピシリン耐性であり、これにより、ワーム培養物と他の細菌との交差汚染を防ぎます9。
<ol><li>OP50は4〜5日前に準備し、使用前日にX線を照射してください。OP50に遭遇するすべての材料が無菌であることを確認してください29,30。</li>
	<li>-8日目:水曜日(第1週):<ol><li>5 mLのLBに100 μg/mLのアンピシリンと0.1 μg/mLのアムホテリシンB、および単一のOP50コロニーを接種して、プレイノキュラムを調製し、バクテリアシェーカーで37°Cで約6時間インキュベートします。培養物が濁るのに十分な成長を遂げるために、早めに接種してください。</li>
		<li>培養物が曇ったら、100 μg/mL のアンピシリンを含む 250 mL の TB で OP50 の preinoculum 培養物を 1:2,000 に希釈します。培養物をバクテリアシェーカーで一晩、37°Cで17〜19時間インキュベートします。 注:培養物が19時間を超えて成長することは許されません。</li>
	</ol></li>
	<li>-7日目:木曜日(第1週)<ol><li>17-19時間のインキュベーション後、OP50液体培養物を滅菌遠心チューブに移し、4°Cの卓上遠心分離機で3,100 × g で15分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を捨て、OP50ペレットを滅菌水で再懸濁し、再遠心分離します。このウォッシュを2回繰り返します。</li>
		<li>2回目の洗浄後、上清を捨て、OP50ペレットを滅菌水に再懸濁して50mLの容量にし、事前に秤量した50mLコニカルチューブに移します。OP50を4°Cの卓上遠心分離機で3,100 × g で20分間遠心分離してペレット化します。</li>
		<li>3回目の洗浄後、チューブに水が残らないように、残っているすべての上清を慎重に取り除きます。ペレットの入った遠心分離管の重量から空の遠心分離管の重量を差し引いて、ペレットの重量を計算します。 注:ペレットの重量は通常3〜3.5gの範囲です。</li>
		<li>OP50ペレットをS-completeバッファーに100 mg/mLの濃度まで完全に再懸濁し、凝集物が存在しないことを確認します。</li>
		<li>100 mg / mLでのOP50の濃度が2 × 1010 bacteria / mLに対応していることを確認してください。.光学密度と mL あたりの細菌数との関係がわかっている場合は、分光光度法で mL あたりの細菌濃度を決定します。必要に応じて、S-コンプリートバッファーを使用して、OP50供給溶液の濃度を2 × 1010 bacteria/mLに調整します。</li>
		<li>寒天プレートでOP50をテストして、汚染されているかどうかを判断します。</li>
		<li>OP50をS-completeバッファーに懸濁して4°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>
<ol start="4"><li>-3日目: 月曜日(第2週)<ol><li>X線照射で細菌を死滅させ、アッセイ中の細菌の増殖を防ぎます。</li>
	</ol></li>
</ol>2.同期ワーム培養の準備
注: このセクションでは、同期ワーム集団の準備について説明します。ワームの個体群と接触するすべての材料は無菌です。すべてのプレートは、特に断りのない限り20°Cに保たれます。
<ol><li>-6日目:金曜日(第1週)、午後4:00<ol><li>動物を新しい皿に移します。<ol><li>例えば、NGMプレートでは、ほとんどの寄生虫が飢餓状態のL1幼虫で構成されています。 注: 母集団が混在している場合でも結果が生成されます。長期間飢餓状態にあるL1線虫を使用すると、飢餓が少なくとも3世代にわたってエピジェネティックなマークを残す可能性があるため、現在または将来の世代の摂食行動に影響を与える可能性があります。</li>
			<li>ワームは1mL以下の滅菌水で洗い流してください。洗い流された線虫集団の~300 μLを、濃縮OP50(~300 mg/mL)を播種したNGMプレートに分注します。プレートをプレートドライヤーまたはブンゼンバーナーで乾かします。プレートを20°Cでインキュベートし、母集団の多くが妊娠した成虫を含むまで(月曜日)。 注:この時間枠は、野生型のN2線虫の集団に最適化されており、株ごとに異なる場合があります。発生が遅れている線虫は、試験されたすべての株が同時に成虫になるまで、早期にチャンクおよび/または播種することを考慮に入れる必要があります。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>-3日目:月曜日(第2週)午前10:00<ol><li>同期母集団の確立 注意！漂白剤は皮膚や目に腐食性があります。取り扱いには手袋と安全メガネが必要です。<ol><li>ワームは、最大10mLの滅菌水でプレートから洗い流して収集します。このワーム/水溶液を15mLのコニカルチューブに移します。</li>
			<li>ベンチトップの重力シンクで約4分間ワームを洗浄します(逆に、310 × gの卓上遠心分離機で2分間遠心分離して洗浄します。</li>
			<li>小さな先端を使用して吸引して上清を捨て、滅菌水を最大15mL追加します。.3回繰り返します。</li>
			<li>上清を取り除き、新たに調製した漂白剤/ NaOH溶液5 mL(家庭用漂白剤1.8 mL、10 N NaOH0.5 mL、dH2O7.7 mL)を加えます。.</li>
			<li>室温で5分間、または線虫が開くまでインキュベートします。少なくとも10秒間、毎分穏やかに渦を巻きます。解剖顕微鏡で進行状況を監視します。 注:ワームをこじ開けるのに必要な時間は、ひずみごとに異なる場合があります。ワームを漂白剤溶液に長時間放置すると、生存不能な卵子が発生する可能性があります。</li>
			<li>M9バッファーを添加して、すべての成虫が割れるか溶解したら反応を中和し(最終容量は15 mL)、1,300 × gで2分間遠心分離します。</li>
			<li>卵を13mLのM9バッファーで3回洗浄します。</li>
			<li>卵子を10 mLのS-complete bufferで1,300 × gで2分間遠心分離し、1回洗浄します。</li>
			<li>上清を吸引し、10 mLのS-completeを加え、懸 ?? 液を新しい15 mLコニカルチューブに移します。.チューブを室温で一晩中ゆっくりと回転させます。</li>
			<li>オプション:S-コンプリートバッファーでの最終遠心分離後に成体死体が存在する場合は、40 μmのセルストレーナーでワーム溶液をろ過します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>-2日目:火曜日(第2週)、13:00<ol><li>動物を皿に播種する<ol><li>解剖スコープを使用して、ワームが孵化したかどうかを確認します。S-コンプリートバッファー中の線虫の濃度を測定するには、解剖スコープを使用して10 μL滴中の線虫の個体数をカウントします。各サンプルについて5〜10滴を数えます。各10 μL滴中の線虫の濃度が1滴あたり30線虫を超える場合は、計数を容易にするために、全ストックをS-completeで1滴あたりの線虫密度を低く希釈してください。</li>
			<li>液体ワーム混合物を96ウェルプレートの各ウェルに120 μLの容量で次のように播種します(最終濃度):S-コンプリートに60匹のワーム/mL、50 μg/mLのカルベニシリン、0.1 μg/mLのアムホテリシン、およびセクション1で調製したOP50の6 mg/mL。 注:調製する総量は、プレートの数によって異なります(96ウェルプレートあたり~12mL)。各ウェルには6〜12匹のワームがいるはずです。あるいは、Union BiometricaのCOPAS FPなどの大きな粒子フローサイトメトリーを使用して、10匹の線虫を各ウェルに正確に選別することもできます(クラウディング効果のセクションを参照)。</li>
			<li>また、セクション1で調製した50 μg/mLのカルベニシリン、0.1 μg/mLのアムホテリシン、および6 mg/mLのOP50のワー ムを含まない 液体混合物も含みます。</li>
			<li>120 μLの線虫混合物を96ウェルプレートのH列に入れ、前述のように自己溶解値を決定するために使用されます。列A〜Gのワームとの混合物のウェルあたり120μLを入れます。 注:ピペッティング中は、ワームが懸濁状態にあることを確認してください( 図2A、Bを参照)。底が平坦な透明な96ウェルプレートを使用しています。私たちのプレートレイアウトは、プレートを分割して4つまたは6つの条件を生成し、列の各ペアが異なる薬物処理または線虫株になり、下の行が「線虫なし」コントロールとして機能します(図2A、B)。</li>
			<li>汚染や蒸発を防ぐために、プレートをテープシーラーで密封します。動物がL4線虫になるまで、プレートを20°Cで約65時間インキュベートします。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>0日目:木曜日(第2週)の正午前。<ol><li>フルオロデオキシウリジン(FUdR)の添加によるワーム集団の滅菌。<ol><li>0.6 mM FUdRストック溶液30 μLを添加して、各ウェル内の動物を滅菌します。テープシーラーを使用してプレートを再シールし、マイクロタイタープレートシェーカーでプレートを800rpmで20分間振とうします。プレートを20°Cインキュベーターに戻します。 注:このステップでは、最終OP50濃度を6 mg/mLから5 mg/mL(1 × 109 bacteria/mL)に減らし、各ウェルの最終容量は150 μLです。動物が成体になる前に、FUdRをL4ステージに追加することが重要です。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>1日目:金曜日(第2週)<ol><li>文化に薬物を追加します。<ol><li>午前9:00までに、ほとんどの動物が妊娠しており、各井戸にいくつかの卵が含まれていることを確認します。必要に応じて、任意の薬物を希望の濃度まで追加します(ディスカッションを参照)。</li>
			<li>薬剤を添加した後、テープシーラーでプレートを密封し、プレートシェーカーでプレートを800rpmで20分間振とうします。 注:振とうすると、シーラーに触れることなく、すべての細菌の塊が溶解します。シーラー上の細菌の塊または液体の両方がOD600 の読み取り値を歪めます。シーラーに液滴が付着している場合は、310 × gで10〜20秒間短時間回転させます。シェーカーでもう一度5分間振って測定します。</li>
			<li>マイクロタイタープレートシェーカーで20分間振とうした後、蓋とシールを取り外し、プレートリーダーでOD600を測定します。これは1日目のOD600の測定です。プレートを密封し、20°Cのインキュベーターに戻します。 注:バクテリアはすぐに落ち着くため、プレートを振ってから10分以内に読み取りが行われます。</li>
			<li>倒立顕微鏡を使用して、薬剤が追加されている場合は、ワームの集団に汚染や毒性の兆候がないか確認します。プレートを20°Cインキュベーターに戻します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>4日目:月曜日(第3週)<ol><li>4日目のOD600 を読んでみてください。<ol><li>1日目(ステップ2.5.1.3)から読み取り手順を繰り返して、 4日目 のOD600値を取得します。 OD600 を測定する前に、マイクロタイタープレートシェーカーでプレートを800rpmで20分間振とうします。</li>
			<li>倒立顕微鏡では、理想的には2倍の対物レンズを使用して、各ウェル内の線虫の個体数をカウントし、スプレッドシートに記録します。カウント後、プレートを20°Cインキュベーターに戻します。 注:補足資料に記載されているスコアリングシートのサンプルをご覧ください。</li>
			<li>4日目の読書の後、食物摂取量の測定は完了です。必要に応じて、寿命分析のためにこれらのプレートを保管してください。 注:このプロトコルは、SolisおよびPetrascheck31と互換性があります。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>
3. 食物摂取データの分析
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig2_v1.jpg"> 図2:設計と解析 (A, B) 列Hに「ウォームなし」の制御井がある4および6条件での可能なプレート設計。これらの井戸は、自己溶解率を決定するために必要です。各プレートには、常にN2未処理のコントロール集団を参照として含めてください。(C)提供されたスプレッドシートに収集されたサンプルデータで、線虫の数(緑のボックス)、1日目と4日目の2つのOD600測定(オレンジのボックス)、自己分解値(青のボックス)、および式(2)((OD600 -selflysis)を使用した評価)赤のボックス。ここで示す具体例では、(B)に示すプレートデザインを使用しています。略語:OD =光学密度;X0 = 井戸あたりのワームの数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig2large_v1.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
注:このセクションでは、このプロトコルのセクション2からの食物摂取データがどのように分析されるかについて説明します。最初に計算される値は、 自己溶解 制御値です。細菌は、虫がいなくても、液体中で時間の経過とともに溶解します。この 自己分解 値は、多くの化学物質の影響を受ける可能性があり、ワームの食物摂取量と比較して比較的大きいため、制御する必要があります。ステップ2.3.1.4で説明し、 図2A、B のプレートレイアウトに示されているように、行Hには、ワームを除いて同じ溶液が含まれています。 図2Bに示すプレートセットアップでは、条件ごとに14のウェルがあり、それぞれ2つの 自己分解制御ウェル(行H、「ワームなし」)があります。
<ol><li>式(1)を使用して、各条件でワームなしの制御井戸の自己溶解制御値を計算します。ウェルのレプリケートグループごとに、ステップ 2.3.1.4 で説明したように、少なくとも 2 つのワームなし制御ウェルがあることを確認します。すべての no-worms 制御井戸の平均を、レプリケート グループの自己溶解値に使用します。 Selfysis = mean(OD600 Day 1 - OD600 Day 4) (1) 注:図2Bに示すプレートセットアップでは、行Hの2つの自己分解制御ウェルの平均を計算することにより、6つのグループごとに1つずつ、6つの自己分解値を計算します。</li>
	<li>方程式を使用してワームあたりの食物摂取量を計算します <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66422/66422equation2v2.jpg">     (2). 注:スプレッドシート(赤いボックス、 図2C)で使用されている式で、X0はウェルあたりのワームの数です。</li>
	<li>各ウェルのワームあたりの食物摂取量を決定した後、条件全体の平均と標準偏差を計算します。 注: 図2Bに示すプレートセットアップでは、統計的な比較には、条件ごとに14のレプリケートウェルで十分です。</li>
	<li>各条件を、それぞれの N2 未処理のコントロール集団に正規化します。送りの変化を折り畳み変化またはN2送りの割合で示します。 注:正規化が行われるのは、式(2)のOD600/X0の絶対値が、異なる日に実施された実験間で異なる可能性があるためです。</li>
</ol>

線虫の食物摂取量と寿命を測定するためのハイスループットアッセイ

<ol><li>Taormina, G., Mirisola, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+in+mammals+and+simple+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction in mammals and simple model organisms.</a> Biomed Res Int. 2014, 308690(2014).</li>
<li>Cunningham, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amp-activated+kinase+links+serotonergic+signaling+to+glutamate+release+for+regulation+of+feeding+behavior+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Amp-activated kinase links serotonergic signaling to glutamate release for regulation of feeding behavior in C.</a> elegans. Cell Metab. 16 (1), 113-121 (2012).</li>
<li>You, Y. J., Kim, J., Raizen, D. M., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2C+cgmp%2C+and+tgf-beta+signals+regulate+food+intake+and+quiescence+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans%3A+A+model+for+satiety.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin, cgmp, and tgf-beta signals regulate food intake and quiescence in C.</a> elegans: A model for satiety. Cell Metab. 7 (3), 249-257 (2008).</li>
<li>Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age-1+and+daf-2+genes+function+in+a+common+pathway+to+control+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 141 (4), 1399-1406 (1995).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+nonautonomy+of+C.+elegans+daf-2+function+in+the+regulation+of+diapause+and+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell nonautonomy of C. elegans daf-2 function in the regulation of diapause and life span.</a> Cell. 95 (2), 199-210 (1998).</li>
<li>Srinivasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+control+of+lipid+metabolism%3A+Lessons+from+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine control of lipid metabolism: Lessons from C.</a> elegans. J Neurogenet. 34 (3-4), 482-488 (2020).</li>
<li>Calculli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+regulation+of+mitochondria+by+germline+proteostasis+prevents+protein+aggregation+in+the+soma+of%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Systemic regulation of mitochondria by germline proteostasis prevents protein aggregation in the soma of.</a> elegans. Sci Adv. 7 (26), eabg3012(2021).</li>
<li>Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+feeding+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of feeding in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 133 (4), 897-917 (1993).</li>
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</ol>

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

提示されたプロトコルは、96ウェルマイクロタイタープレートでのC.エレガンスの食物摂取量の読み出しとして細菌クリアランスを測定します。代表的な結果セクションの用量反応曲線は、アッセイが食物摂取量を定量的に測定することを示しており、この概念は同位体標識細菌11を用いて独立して確認された。このアッセイを用いて、抗精神病薬などのFDA承認薬をヒト代謝副作用が知られている試験に成功し、これらの薬剤が線虫10,26の摂食を増加させることを示しました。このアッセイは、摂食の遺伝学または薬理学の研究に有用であり、C.エレガンス研究のための新しいツールを追加して代謝を研究します。このアッセイは、他のほとんどの生物では不可能な、スケーラブルで時間にやさしい方法で摂食を研究するための低コストの方法を提供します。FDA承認薬に関する私たちの研究は、ヒト患者に見られる多くの副作用がC.エレガンスでも観察されることを示しており、進化的保存を明らかにしています24,26,32。
アッセイは、OD600測定の線形範囲内で測定できる細菌の濃度によって制限されます。その結果、アッセイできる線虫の数と細菌濃度の範囲が限られています。寄生虫が多すぎると、細菌の消費が速すぎるため、線状OD600から細菌濃度が「食べられる」ため、OD600に影響を及ぼします。私たちの経験では、細菌調製物のばらつきは、実験ごとに結果が異なる原因となる重要なパラメーターです。大量のバクテリアを凍結したり、凍結乾燥バクテリアを使用したりしようと試みましたが、失敗に終わりました。これらの場合、自己分解率が高すぎたか、細菌の質がC.エレガンスの発達を遅らせたかのどちらかでした。ただし、私たちのテストは網羅的ではなく、この問題は解決できる可能性があります。
一般に、細菌の 自己分解 速度を制御するのが最も困難であり、かなりの変動を引き起こす可能性があります。一部の薬剤は、アッセイでは食物摂取量を確実に決定できないレベルまで 自己溶解率を高めることができることがわかりました。アッセイでは 自己溶解 率が時間とともに増加するため、成人期の5日目以降の食物摂取量は測定していません。その年齢までに、細菌は培養に~10日かかります。成人期の5日目を過ぎた食物摂取量を測定するには、古い細菌を洗い流して新しい細菌と交換する必要があります。
提示されたアッセイは、当社の96ウェルマイクロタイタープレートベースの寿命アッセイ31の拡張です。この組み合わせにより、同じ集団の寿命と食物摂取量を測定できます。ここで紹介する細菌クリアランスアッセイでは、細菌の自己分解により、C.エレガンスの生涯にわたる食物摂取量を決定することはできませんが、食物摂取量が最も多い成人期の最初の4日間については確かなデータを提供します。特に低分子創薬では、食物摂取のコントロールが不可欠です。要約すると、提示されたアッセイは、C.エレガンスコミュニティにとって有用であり、老化と寿命の研究の文脈で代謝を研究したり、それを制御したりするためのツールセットを拡大すると予想しています。
企画： 
食物摂取量の測定を計画する前に、いくつかの考慮事項を考慮する必要があります。
バクテリアを殺す:
50mLのコニカルチューブ(160.0kV、25.0mAで900Grayを4時間設定)にX線を照射することで細菌を死滅させます。照射にはRad SourceのRS2000を使用しています。施設によっては、具体的な時間や放射線量が異なる場合があります。細菌の完全な死滅は、放射線照射後に細菌をめっきして生存者を成長させることによって決定する必要があります。アッセイ中の増殖を防ぐためには、すべての細菌を殺すことが不可欠です。これは、摂食値の過小評価やマイナスの摂食値を引き起こす原因となります。重要なことは、C.エレガンスがまだそれらを食べるように、バクテリアを殺さなければならないということです。私たちの経験では、大量の細菌を確実に殺すには、(i)X線による照射、(ii)γ線による照射、(iii)ホルムアルデヒドの添加、29,30の3つの方法があります。これら 3 つの方法の自己溶解率は同等であり、図 3B に示す実験の自己溶解速度間の変動係数は 8% です。私たちの手の中で確実に機能しなかった方法は、UV照射、抗生物質カクテル、熱不活化、およびアジ化ナトリウムでした。これらの方法は、バクテリアを完全に殺すことができない(UVと抗生物質)、C.エレガンスが食べないバクテリアを生成する(熱)か、食物摂取量を変更する(アジ化ナトリウム)かのどちらかです。
反復数: 
私たちの経験では、摂食の倍率変化は、観察された変動と比較して一般的に小さいです。したがって、食物摂取量の変化を測定するには、いくつかの複製ウェルが必要です。図2A、Bは、4つまたは6つの異なる条件用に設計された96ウェルプレートを示しており、21または14の複製ウェルと2つのワームのない自己分解制御ウェルがあります。大きな変動性と予想される比較的小さな変化を考えると、摂食の0.5〜2.5倍の変化が下限と上限になる傾向があります。各条件に対して 14 から 21 のレプリケートウェルと、次に説明する 2 つ以上の自己分解制御ウェルを推奨します。これらの反復は、摂食11,26を変更する薬物の定量的用量反応曲線を生成するのに十分である。
Selflysisコントロール: 
OD600は、溶液中の粒子の数を測定し、主に粒子サイズとは無関係です。ただし、死んだバクテリアは溶解し、粒子の性質を失います。これを自己溶解と呼び、これはワームの存在下で独立して発生し、ワームが食べずにOD600測定値を低下させます。自己溶解はアッセイ中に起こり、条件ごとに少なくとも2つのウェルで独立して測定する必要があります。これらの井戸は、ワームが含まれていないことを除いて、同じ条件内の他の井戸と同じ治療を受けます。また、多くの薬剤が自己溶解率を変化させることもわかりました。したがって、各条件には、それぞれの濃度で独立した自己分解制御井戸が必要です。図2は、行Hのプレートの下部にあるすべての自己分解制御ウェルを備えた4つまたは6つの条件のプレートセットアップを示しています。
N2参照母集団: 
また、消費される細菌の絶対量は実験間で変動する可能性があり、おそらく細菌の品質に関連している可能性が高いことにも注目しました。毎回まったく同じ方法で準備するために最善を尽くしても、変動があります。例えば、細菌は対数成長期の分裂状態で採取できるため、固定期に採取される細菌よりもはるかに大きなサイズになります。したがって、これらの細菌サイズの単純な違いは、OD600の測定値がサイズを区別しないため、消費される細菌の数や異なるOD600値の変化につながる可能性があります。このため、実験グループがN2コントロールよりも多く食べるか少ないかを判断するために、参照値として機能する未処理のN2コントロール動物の集団を常に1つ含めます。この方法により、OD600の値が異なる場合でも、実験間の比較が可能になります。
時間間隔: 
OD600 値を使用して食物摂取量を測定するには、細菌濃度が測定可能なほど低下する必要があります。培養量は線虫よりもはるかに大きいため、検出可能な違いを生じさせるには、かなりの量の細菌を食べる必要があります。OD600 値の線形範囲にとどまるには、細菌濃度が ~1 mg/mL から 10 mg/mL の間にとどまる必要があり、それを検出するにはかなりの量の細菌が消失する必要があります。ワームは、産卵のためにL4後期から成虫期の4日目に最も多く食べます。したがって、この間隔は理想的です。24時間のような短い間隔は11時間測定できますが、それはかなり難しく、条件ごとに~40ウェルが必要です。幼虫の食物摂取量を測定する別のオプションは、井戸あたりの動物の数を2倍にすることです。ただし、このアプローチの問題は、成長したときに OD600 の読み取り値に影響を与え始める線虫が多すぎることです。
試験対象の医薬品のストックソリューション: 
セロトニンなどの薬物が摂食を調節する能力について試験される場合は、ストック溶液を調製する際に次の点を考慮してください。通常、水溶性医薬品には50倍のストックを調製し、各ウェルに3μL(1:50)を添加しますが、他のストック濃度(100倍、300倍)も機能します。ただし、薬物を水以外の溶媒(DMSOなど)で希釈する場合、最終濃度は0.5%を超えてはなりません。溶剤はすぐに C.エレガンに有害になります。したがって、DMSOなどの有機溶媒に溶解した薬物の原液は300倍以上でなければなりません。
生きているワームと死んだワームのスコアリング: 
生きている動物と死んだ動物の判断は、ワームの動きに基づいています。強い光、特にブルーライトは動物を動かしてしまうため、使われます。さらに、井戸あたりの動物の数をスコアリングすると、超過死亡があるかどうかが明らかになります。過剰死亡は、有毒物質や高濃度(>0.5%)のDMSOを含むいくつかの溶媒で発生する可能性があります。一般的に、死んだ動物は1:100(1%)未満である必要があります。プレートは、食品が落ち着き、個体数を数えるのが難しくなった場合、マイクロタイタープレートシェーカーで800rpmで30秒間振とうすることができます。オスまたは16匹以上のワームがいる井戸は無視してください(問題を参照)。
潜在的な問題:
不適切な振とう: 
液体培地では、バクテリアは簡単に凝集してウェルの底に定着します。私たちの経験では、20分未満振とうすると、細菌の凝集体が分解されて再懸濁されず、OD600 の測定が不正確になる可能性があります。細菌の塊の存在下でのOD600 測定は、細菌濃度を過小評価します。シェーカーの設定が多すぎると、液体がシーラーに付着する可能性があります。OD600 の読み取りのためにシーラーを取り外すと、シーラーに付着した液体により、OD600 の読み取り値が低くなります。シーラーに液体が付着している場合は、プレートを低速(500〜1,000 rpm)ですばやく回転させ、再度5分間振とうします。さらに、 1日目 と 4日目 の測定値で述べたように、細菌が落ち着かないように、プレートを振ってから10分以内に読むようにしてください。
実験間で異なる絶対食物摂取量値: 
細菌製剤を標準化するための最善の努力にもかかわらず、それらはしばしば線虫の食物摂取に影響を与える方法で異なります。例えば、細菌は分裂状態であるため、対数成長期と固定相のどちらで採取されたかによって大きさが異なり、対数菌の方が大きくなります。OD600 の測定ではサイズが区別されないため、バクテリアが収穫された段階によるバクテリアのサイズの違いにより、バクテリア製剤間の基礎食品摂取量に明らかな違いが観察される可能性があります。実験間を比較する最善の方法は、常に未処理のN2コントロール集団を含め、結果をこのN2母集団に正規化することです。
混雑効果: 
このプロトコルの細菌濃度は、OD600 をウェルあたり2〜16本の線虫に対して~72時間直線的範囲に保つのに十分です。目的の薬剤によっては、16を超える線虫を含むウェルでは、2回目の測定前に細菌濃度が枯渇する可能性があります。また、1匹の動物がいる井戸は信頼性が低い傾向があることもわかりました。溶解因子は、1匹のワームが食べるものよりも重要です。したがって、溶解因子を決定する際の小さなエラーは、ワームが少ない井戸に不釣り合いに影響を及ぼします。
以下の条件のいずれかが満たされる場合は、統計分析から井戸を除外することをお勧めします。井戸の中にはオスがいます(オスと雌雄同体の食物摂取量を比較したデータはありません)。井戸には2匹未満のワームがいるか、井戸には16匹以上のワームがいます。ワームは2回目の読み取りで死んでいます。または、FUdRが失敗したために井戸に子孫がいるかどうか。FUdRは熱に敏感で、37°Cという低い温度でも不活性化されます。 FUdRは常に室温の水で解凍してください。
ネガティブな食物摂取量:
食物摂取量は時折マイナスであり、1日目よりも4日目の方が食物が多いことを示唆しています。食物摂取量のマイナス値は、次の要因のいずれかを示している可能性があります:自己 分解 率が高い(おそらく細菌に作用する薬物が原因)、または食物摂取量がマイナスで、井戸が汚染されており、ワーム以外の何かが成長していることを示唆している可能性があります。 自己分解 率も、細菌が年をとるにつれて増加します。したがって、生後1週間以内の細菌を使用することをお勧めします。時間の経過とともに沈殿する薬剤が追加され、OD600 値に影響を与えます。1日目の振とうが不十分だと、細菌の塊によりOD600 の読み取り値が低下する可能性があります。線虫は低酸素ストレスを受けました。これは、地表と空気の比率が酸素交換を可能にするのに十分でない場合に発生します。材料には特定の96ウェルプレートを使用し、ウェルあたり150 μL(120 μL + 30 μLのFUdR) を超えないようにしてください 。井戸の表面とワームが生息する底との間の距離によって、酸素濃度が決まります。
制限：
このアッセイは液体培養に限定されています。食品の芝生に出入りするなど、固体プレートで観察される摂食行動は、このアッセイでは評価できません。

線虫は老化研究に広く使用されてきました。 これは、食事制限、ミトコンドリア活性の低下、またはインスリンシグナル伝達の減少によって引き起こされる代謝媒介性の長寿の根底にある遺伝学を研究するための強力なモデルです。1、2、3、4、5、6、7。しかし、C.エレガンスでは、動物3,8,9,10,11,12,13,14,15のサイズが小さいため、長寿の文脈での摂食の測定が困難であることが証明されています。
摂食は生存に必要な基本的な生物学的行動であり、その厳格な規制は、代謝の健康、生殖、および老化の維持の中核にあります。摂食行動は、神経系と末梢の両方で複数のシグナル伝達経路によって制御されているため、in vivoでしか研究できません16,17,18,19。摂食は、(i)エネルギー摂取、(ii)エネルギー貯蔵、(iii)生物のエネルギー恒常性を支配するエネルギー消費の3つの柱の最初のものを表しています。C.エレガンスの摂食は、主に咽頭の収縮率によって定義される咽頭ポンプを測定することによって調査されてきました。このアプローチは、C.エレガンスの摂食行動3,4,8,12,13,20,21;ただし、咽頭ポンプは、特に短い数分間隔で測定され、必ずしも食物摂取と相関しているわけではありません。
食物摂取量は、咽頭のポンプ速度だけでなく、摂食発作の期間や頻度、食物細菌の密度などのパラメーターによっても決定されます。動物は咽頭のポンピングが非常に高い場合がありますが、摂食発作の長さが短くなり、増加率が相殺される可能性があります。別の交絡因子は、ポンピングがバクテリアを摂取して粉砕する場合としない場合の効率です。咽頭ポンプから食物摂取を切り離す極端な例は、食物(細菌)を存在させないセロトニンの追加です。外因性セロトニンの存在下では、動物は高い速度でポンプしますが、バクテリアが存在しないため、高いポンプ速度は食物摂取につながりません2,6,13,22,23。
ここで紹介するバクテリアクリアランス法は、個々のウェルにおける線虫集団の食物摂取量を、時間の経過とともに細菌濃度が減少する様子として測定します(図1)。このアプローチは、食物の消失が食物摂取量の尺度を表す他の種で使用されるものと似ています10,11,24,25,26,27,28。元の出版物では、C.エレガンスに15N同位体標識細菌11を与えることにより、食物摂取量を測定するこの方法を検証しました。その後の質量分析法による測定では、細菌の消失の測定は同位体標識の発生と強く相関していることが示され、細菌の動物への実際の取り込みが明らかになった11。したがって、バクテリアクリアランスアッセイは、ほとんどの状況で食物摂取量を表していると確信しています。このアッセイの目的は、咽頭ポンプアッセイを置き換えることではなく、C.エレガンスの摂食と代謝、およびそれが老化と長寿にどのように関連しているかを研究するためのアッセイのツールボックスに追加することです。

<table><tbody><tr><td>アムホテリシンB</td><td>RPIの</td><td>A40030-0.1</td><td>溶媒:EtOH</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP176025</td><td>溶媒:水</td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>211677</td><td>NGMプレートの製造に使用</td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>46-100-RG</td><td>溶媒:水</td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22363547</td><td>40 & マイクロ;m は大人を削除します</td></tr><tr><td>コレステロール&nbsp;</td><td>MPバイオメディカルズ</td><td>02101380-CF</td><td>5 mg/mL ストック</td></tr><tr><td>Difco、寒天、細菌学</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>214510</td><td>NGMプレートの製造に使用</td></tr><tr><td>フルオロデオキシウリジン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F0503</td><td>L4 でワームを滅菌するには</td></tr><tr><td>ルリアブロス</td><td>RPIの</td><td>L24045-1000.0</td><td>カプセルを開き、1 Lの水と混合し、オートクレーブします</td></tr><tr><td>M9バッファー&nbsp;</td><td>実験室で準備</td><td></td><td>室温で無菌状態で保管してください 1 L: &nbsp;15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) &nbsp;5 g NaCl (FW: 58)、0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) &nbsp;オートクレーブ</td></tr><tr><td>マイクロプレートシーラー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>236707</td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>Caenorhabditis 遺伝学センター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレート96ウェル&nbsp;</td><td>隼</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>テカン</td><td>30016056</td><td>600nmフィルターレンズを使用</td></tr><tr><td>クエン酸カリウム、1 M、pH 6</td><td>実験室で準備</td><td></td><td>室温で無菌状態で保管します 1 L: 268.8 g クエン酸カリウム三塩基性一水和物 (FW: 324) 26.3 g クエン酸一水和物 (FW: 210) 900 mL の dH2O pH を 5 M KOH オートクレーブ&nbspを使用して 6 に調製します。</td></tr><tr><td>リン酸カリウム、1 M、pH 6&nbsp;</td><td>実験室で準備</td><td></td><td>室温で無菌状態で保管してください 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O &nbsp;5 M KOH オートクレーブを使用したpHから6まで</td></tr><tr><td>S-基礎</td><td>実験室で準備</td><td></td><td>室温で無菌状態で保管してください 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) &nbsp;50 mL 1 Mリン酸カリウム(pH 6) 900 mL dH2O オートクレーブを加え、55°Cに冷却します。C</td></tr><tr><td>Sコンプリート</td><td>実験室で準備</td><td></td><td>室温で無菌状態で保管する 1 L: 1 LのS-basal(55°Cに冷却;CまたはRT) &nbsp;10 mLの1 Mクエン酸カリウム &nbsp;pH 6、微量金属溶液10 mL &nbsp;3 mL 1 M CaCl2 3 mL 1 M MgSO4</td></tr><tr><td>セロトニン塩酸塩</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>AAB2126309</td><td>5 mMで使用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S7653-5KGの</td><td>バッファーやNGMプレートを作る</td></tr><tr><td>素晴らしいスープ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>J75856-A1</td><td>250 mLの水に12.5 g、オートクレーブ</td></tr><tr><td>力価プレートシェーカー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>88880023</td><td>800rpmで振とう、シェーカーによる</td></tr><tr><td>微量金属ソリューション&nbsp;</td><td>実験室で準備</td><td></td><td>室温で無菌状態で保管してください 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) &nbsp;0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) &nbsp;0.016 g CuSO4 (FW: 158) オートクレーブ アルミホイルで包んで暗所で保管</td></tr></tbody></table>

細菌クリアランスの測定による 線虫 の食物摂取量の定量化

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

摂食は、生物の成長、繁殖、生存に不可欠な生物学的プロセスです。このアッセイは、老化や代謝の遺伝学を研究する際の重要なパラメータである Caenorhabditis elegans(C.elegans)の食物摂取量を測定することを目的としています。ほとんどの種では、摂食は、提供された食物の量と特定の時間間隔後に残された量との差を測定することによって決定されます。ここで紹介する方法は、 C.エレガンスの摂食を決定するために同じ戦略を使用します。 これは、C.エレガンスの食物源である細菌が72時間以内に除去された量を測定します。この方法では、96ウェルマイクロタイタープレートを使用し、他の動物モデルでは不可能な速度と深さで食物摂取を調節する能力について、数百種類の薬物のスクリーニングを可能にしました。このアッセイの強みは、摂食と寿命を同時に測定し、食物の消失を直接測定できるため、他の生物と同じ原理に基づいており、種間比較が容易になることです。

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66422/66422fig3_v1.jpg"> 図3:代表的なデータ(A)グラフは、セロトニン濃度の関数として食物摂取量の倍率変化の用量反応曲線を示しています。すべてのデータは、N2基礎摂食に正規化された非刺激的な基礎食物摂取を示しています。daf-16(mu86)動物は、セロトニンが添加されていない場合、野生型N2よりも多く食べるが、摂食を制御する能力の範囲が鈍いことを示していることに注意してください。(B)グラフは、50μMの抗精神病薬ロキサピンで処理されたが、X線、γ線、またはパラホルムアルデヒドのいずれかによって殺された細菌を与えられた線虫の食物摂取量の倍率変化のバイオリンプロットを示しています(C)グラフは、X軸に示されている遺伝子型を持つさまざまな変異体の食物摂取量の倍率変化のバイオリンプロットを示しています。これらのデータは、exc-4およびcgr-1変異体は食べる量が少なく、srp-6変異体は食べる量が多いことを示唆しています。アスタリスクは ** p &lt; 0.001、****p &lt; 0.0001 を表し、ANOVA と Brown-Forsythe-Welch によって決定され、複数の仮説検定を考慮して事後修正されます。エラーバーは±S.E.M.を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422fig3large_v1.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図1は、このプロトコルの全体的なワークフローを示しています。これは、バクテリアの作成から1日目と4日目のOD600 の読み取り値の取得までの全プロセスを示しています。さらに、インフォグラフィックでは、使用されている方法の具体的な手順を参照しています。 図2A、B は、ディスカッションセクションで説明した 自己溶解 率の計算に必要な、列Hの「ノーワーム」コントロールウェルを含む、2つの可能な実験プレートレイアウトを示しています。私たちの研究室の経験では、実験間で観察された線虫の細菌摂取量の変動性を説明するために、未処理のN2制御条件の1つが必要です(ディスカッション:計画[N2参照集団]を参照)。
図2C は、このプロトコルで生成されたデータの分析に使用されるスプレッドシートの例です。線虫の数を緑、 自己分解 を青、1日目のOD600 と4日目のOD600 をオレンジ、線虫1匹あたりの食物摂取量を赤で強調表示しています。さらに、各ウェルは、追加された菌株、薬物、濃度、実験日、およびその他の処理について追跡されます。使用される特定の方程式の詳細については、プロトコルセクション3を参照してください。全体として、これらのスプレッドシート( 補足資料として提供されるテンプレート)は、このプロトコルの効率的なデータ収集と分析を提供します。
図3A は、このプロトコルを用いて、セロトニンがN2および daf-16 変異体において摂食をどのように調節するかについての用量反応曲線の代表的な結果を示しています。この実験では、基礎的な食物摂取量(曲線の最初の点)からの倍率変化を、セロトニンの5回の増加用量にわたって計算しました。これらの結果が強調しているように、N2株は用量依存的に過食することができます。しかし、 daf-16(mu86) 変異体の場合、基礎摂食はN2よりも高いものの、変異体はN2株と同じ用量依存的にセロトニンに応答することができません。このプロトコルにより、セロトニンの濃度が用量反応曲線を生成する変数要因であった2つの株間の摂食行動を決定できます。 図3B は、抗精神病薬ロキサピンで治療されたが、X線、γ線、またはパラホルムアルデヒドのいずれかによって死滅した細菌を与えられた線虫の食物摂取量を示しています。これらの実験は並行して行われたものではなく、その違いは細菌を殺すための異なる方法を代表するものではなく、実験間の変動によるものであることに注意してください。 図3C は、N2と比較して2つの系統が減少し、1つの系統が摂食行動の増加を示している一連の遺伝系統の食物摂取量を示しています。このプロトコルの適用により、異なる遺伝的背景にわたって1つの薬物を1つの濃度で試験することができます。同じ薬剤を投与した場合に、野生型N2コントロールとは異なる食物摂取反応を示す遺伝的背景を特定するのに適しています。これは、当社のライフスパンプロトコルと組み合わせて、同じプレートセットアップ31で食物摂取量と寿命を迅速にスクリーニングすることができます。
補足資料: 図 2C に示すスプレッドシート テンプレート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66422/66422.zip" target="_blank">資料のダウンロードはこちらからお願いいたします。</a>

このプロトコルは、液体培養中の細菌のクリアランスの測定に基づいて 、線虫の 摂食速度を定量化するアッセイについて説明しています。

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

私の研究は、薬物による摂食行動の変化の根底にある転写経路と代謝経路を理解することに焦点を当てています。私は、健康的な空腹時経路を活性化することを示す、食物摂取量を減らし、寿命を延ばす薬の特定に取り組んでいます。細菌クリアランスアッセイを用いて、セロトニン誘発性食物摂取と抗精神病薬誘発性食物摂取を調節する2つの異なる経路を同定しました。私は現在、これらの経路が長命の変異体の摂食とどのように関連しているかを研究しています。このプロトコルにより、研究者は摂食と長寿の関係を研究することができます。摂食速度は通常、咽頭ポンプによって特徴付けられます。しかし、C.elegansの揚水速度は、必ずしも食べられる食物の量に比例するわけではありません。これらの以前のアッセイに加えると、このプロトコルは、線虫の個体数あたりの食物摂取量を定量化可能にします。私たちのアッセイにより、低分子を用いて摂食を定量的に調節し、その誘発された変化が同時に寿命をどのように変化させるかを決定することができます。

quantifying-food-intake-caenorhabditis-elegans-measuring-bacterial

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

このビデオでは、FITC標識デキストランを線虫に給餌することにより、線虫の腸内腔の完全性を視覚化および測定する方法を紹介しています。この例のプロトコルは、3,3'-ジインドリルメタン(DIM)処理された線虫と病原体を給餌した線虫で行われたアッセイを示しています。...

FITC-デキストラン摂食:C.エレガンスの腸管透過性を定量化する方法

出典:テイラー、MN、et.al。Caenorhabditis elegansと細菌の相互作用における不均一性を定量化するための単一ワームデータを用いたJ. Vis. 経験。(2022年)このビデオは、無菌で年齢が一致した Caenorhabditis elegans...

無菌 C.elegansにおける腸内細菌のコロニー形成の評価

出典: Le, T. A. N. , ほか、『カ エノルハブディティス・エレガンスの腸内透過性に対する細菌および化学物質の影響の測定』。 J. Vis. Exp. (2019年)このビデオでは、Pseudomonas aeruginosaに曝露されたC.

細菌曝露後の C. elegans における腸の透過性評価

大腸菌感染後のショウジョウバエ・メラノガスターにおける大腸菌の細菌負荷の測定

ここでは、遺伝子発現および寿命に関連して広範な範囲の食餌療法の制限するためのフレームワークを提案する.広い範囲の食餌療法の制限のため、このパラダイムの下での遺伝子発現の定量的影像化のためのプロトコルについて述べる。我々...

線虫の遺伝子発現レベルの間に寿命変調下広い範囲食事制限によってエンコードされた情報の定量化

ミトコンドリアの呼吸は生物の生存にとって重要ですしたがって、酸素消費量は、ミトコンドリアの健康の優れた指標です。このプロトコルでは基底を測定する市販の呼吸の使用を述べるし、最大酸素消費量のライブ、線虫そのまま・自由に運動。...

そのまま線虫の酸素消費量の測定

このプロトコルは、カエネラブディティスエレガンスの腸透過性を測定する方法を記述します。この方法は、腸内細菌とその宿主との相互作用に関連する腸の健康に関する基礎生物学的研究や、漏出性腸症候群および炎症性腸疾患を治癒するためのプロバイオティクスおよび化学薬品を同定するためのスクリーニングに役立ちます。...

ケネラブディティス・エレガンスの腸透過性に及ぼす細菌および化学物質の影響の測定

このプロトコルは、外部細菌を除去するための低温麻痺および表面漂白後の個々の細菌的にコロニー形成された Caenorhabditis elegansの...

単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

線虫Caenorhabditis elegans は、宿主とマイクロバイオームの相互作用を促進する分子決定因子を調べるための強力なモデルです。本稿では、腸内細菌叢のコロニー形成における単一動物レベルのプロファイリングを、 線虫...

線虫Caenorhabditis elegans腸内細菌叢の定量化と分析のためのフローバーミメトリーの応用

食物制限されたラットで薬物探索のロバスト増強のデモンストレーションを可能にする手順が記載されている。ヘロイン自己投与の訓練後、ラットは、彼らは穏やかに制限された食品である時に、薬物のない環境で、禁欲期間を経る。薬物探索はその後、薬物に関連した環境でテストされています。...

禁欲ラットで探しているヘロインに長期の食事制限の影響を研究するための手順

学ぶ細菌クリアランスアッセイによるCaenorhabditis elegansの食物摂取量定量化法。神経科学と行動生物学の研究に適し、薬物処理による摂食行動と寿命の関連を解析できます。

細菌クリアランスの測定による線虫の食物摂取量の定量化

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細菌クリアランスの測定による 線虫 の食物摂取量の定量化

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