Name: バイオエンジニアリング材料の研究のための咬筋体積筋損失のげっ歯類モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 46 s
Description: 学ぶ、ラット咬筋を用いた体積筋損失モデルの作成法。バイオエンジニアリング材料を用いた治療アプローチの評価と、顔面骨格筋再生のメカニズム解明に役立つ再現性の高い実験モデルを確立します。

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<meta charset="utf8"></head><body>ラットモデルを用いた頭蓋顔面VML損傷における生体材料の評価

<ol><li>Gilbert-Honick, J., Grayson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+innervated+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Vascularized and innervated skeletal muscle tissue engineering.</a> Adv Healthc Mater. 9 (1), 1900626(2020).</li>
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<li>Greising, S. M., Corona, B. T., McGann, C., Frankum, J. K., Warren, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+approaches+for+volumetric+muscle+loss+injury%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B%3A+Rev%22%5BJournal%5D)">Therapeutic approaches for volumetric muscle loss injury: A systematic review and meta-analysis.</a> Tissue Eng Part B: Rev. 25 (6), 510-525 (2019).</li>
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<li>Pavlath, G. K., Thaloor, D., Rando, T. A., Cheong, M., English, A. W., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+among+muscle+precursor+cells+in+adult+skeletal+muscles+with+differing+regenerative+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities.</a> Dev Dyn. 212 (4), 495-508 (1998).</li>
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<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+functional+assay+of+volumetric+muscle+loss+injured+mouse+masseter+muscles+via+nanomembrane+electronics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time functional assay of volumetric muscle loss injured mouse masseter muscles via nanomembrane electronics.</a> Adv Sci. 8 (17), e2101037(2021).</li>
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<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+integration+into+3D+bioprinted+skeletal+muscle+constructs+accelerates+restoration+of+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Neural cell integration into 3D bioprinted skeletal muscle constructs accelerates restoration of muscle function.</a> Nat Commun. 11 (1), 1025(2020).</li>
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<li>Guédat, C., Stergiopulos, O., Kiliaridis, S., Antonarakis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+masseter+muscles+thickness+and+facial+morphology+with+facial+expressions+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Association of masseter muscles thickness and facial morphology with facial expressions in children.</a> Clin Exp Dent Res. 7 (5), 877-883 (2021).</li>
<li>VanSwearingen, J. M., Cohn, J. F., Bajaj-Luthra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+impairment+of+smiling+increases+the+severity+of+depressive+symptoms+in+patients+with+facial+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Specific impairment of smiling increases the severity of depressive symptoms in patients with facial neuromuscular disorders.</a> Aesthetic Plast Surg. 23 (6), 416-423 (1999).</li>
<li>Versnel, S. L., Duivenvoorden, H. J., Passchier, J., Mathijssen, I. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satisfaction+with+facial+appearance+and+its+determinants+in+adults+with+severe+congenital+facial+disfigurement%3A+A+case-referent+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plast+Reconstr+Aesthet+Surg%22%5BJournal%5D)">Satisfaction with facial appearance and its determinants in adults with severe congenital facial disfigurement: A case-referent study.</a> J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63 (10), 1642-1649 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>F1.652 ミオシン重鎖(胚性)モノクローナル抗体</td><td>DSHB</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG2b交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647</td>、<td>Invitrogen</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td>、<td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>インテグラ標準生検パンチ、使い捨て標準生検パンチ;5 mm、直径:0.19インチ、0.5 cm</td><td>Integra</td><td>12460411</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI - Aqueous, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam</td><td></td><td>ab150127</td><td></td></tr><tr><td>スルファメトキサゾール/トリメトプリム経口懸濁液、チェリー風味、473 mL</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU: RXBAC-SUSP</td><td></td></tr></tbody></table>

バイオエンジニアリング材料の研究のための咬筋体積筋損失のげっ歯類モデル

Rodent Model of Masseter Volumetric Muscle Loss for Studying Bioengineering Materials

生体材料を用いた頭蓋顔面VMLの評価と組織再生の結果には、定量的および定性的な結果の両方が含まれます。
図2 は、前述のモデルを用いた定性的評価の一例を示しています。当社のハイドロゲル内で のde novo 筋線維の成長の観察は、定性的な肯定的な結果であり(図2A)、生体材料が十分な建築的サポートと成長因子または栄養素の送達を提供できることを示唆しています。創傷床内のハイドロゲルの保持(図2B)は、HE染色で見ることができます。HE(図2C)およびマッソントリクローム(図2D)を使用した血管の同定など、生体材料内の他の組織の定性的評価が行われる場合があります。顔面神経の下顎枝と頬側枝は、 図 2B の画像の左上隅と右上隅に見え、VML 損傷床のハイドロゲルの正しい配置を確認し、向きを提供します。ハイドロゲルの上に筋膜の層が見られ、筋膜の閉鎖が成功し、術後期間中に無傷のままであったことが確認されています。この段階で見られる否定的な結果には、ヒドロゲルの完全な喪失 (図 2E) または筋膜閉鎖の喪失と創傷床からの押し出し (図 2F) が含まれ、HE は術後の経過時間に応じて創傷床または線維性瘢痕の証拠を示しています。
免疫組織化学分析は、頭蓋顔面VMLの治療のための生体材料の評価において、細胞レベルでの細胞タイプと分子相互作用を特定するために重要です。VMLは、骨格筋を再生できる常在細胞と構造を失うため、損傷部位でのde novo筋肉再生は、治療4およびVMLの生体材料ベースの治療における有効性の評価において重要な結果です。胚性(MYH3)および新生児ミオシン(MYH8)を含むミオシンの発生アイソフォームは、再生する骨格筋線維で再発現し、再生線維の特異的マーカーを提供する18,19。図3は、免疫組織化学を使用して目的の細胞タイプ(この場合は胚性ミオシン重鎖)を同定する方法の例を示しています。
最後に、ImageJを使用して、免疫組織化学やMassonのトリクロームなどの特殊な染色を含む組織学スライドの特徴を定量化し、線維化反応を測定できます(図4)。VML損傷で筋肉の一部を切除すると、筋肉の構造と組成が変化し、コラーゲンI沈着と肉眼的コンパートメント組織線維症が増加します2,3。VMLの生体材料ベースの治療を評価する多くの研究では、介入群と対照群の間で線維化が比較されています4。ここで説明する方法を使用すると、VML損傷を受けた動物の創傷床をMassonのトリクロームで線維性瘢痕として識別できます(図4A)。ImageJによるカラーデコンボリューションは、結合組織に対応する青色チャネルを分離して定量化し(図4B)、その後、測定のためにグレースケールに設定できます(図4C)。瘢痕の領域は、画像J(図4D)を使用して分離および測定し、正確なサイズと再現性のある領域のために画像上のスケールバーに較正できます。このアプローチを使用すると、結合組織の沈着を測定できます(図4E)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66450/66450fig01.jpg"> 
図1:手順を示す外科用概略図(A、B)外科用咬筋VML損傷。(C)生体材料の適用。(D)咬筋の収穫。(E)収穫後の筋肉の形態。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66450/66450fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66450/66450fig02.jpg"> 
図2:HEとMassonのトリクローム染色(A)ヒドロゲル-筋界面からのHE染色ラット咬筋切片と、骨格筋線維として形態学的に同定された構造を示す矢印。(B)HE染色ラット咬筋切片は、ハイドロゲル全体に骨格筋線維が豊富に存在することを実証しています。(C)HE染色された組織、および(D)血管として形態学的に識別された構造を示す矢印が付いたMassonのトリクローム染色組織。(E,F)陰性の結果は、創傷床ではなく咬筋の表面面に付着したゲルによるハイドロゲルの完全な喪失と、筋膜閉鎖の喪失を伴うヒドロゲルの不完全な喪失を示すものでした。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66450/66450fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66450/66450fig03.jpg"> 
図3:ラット咬筋断面上の胚性ミオシン重鎖(eMHC)およびラミニンの免疫組織学的染色(A)術後2週間。(B)手術後12週間。eMHCの濃度は、2週間のサンプルと比較して12週間のサンプルで増加しています。20倍の倍率で撮影された画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66450/66450fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66450/66450fig04.jpg"> 
図4:定量的線維症分析 (A)12週でのVML損傷後の創傷線維症の代理としての結合組織の沈着を定量化するためのMassonのトリクローム染色ラット咬筋切片。(B)画像Jを用いて、結合組織に対応する青色チャネルをデコンボリューションした。(C)画像は分析のためにグレースケールに変換されました。(D)線維性瘢痕に対応する領域を分離し、(E)白(背景)と黒(結合組織)に対応するフィールドの断面積とパーセンテージを計算しました。光学顕微鏡で撮影した画像、倍率10倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66450/66450fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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