Name: げっ歯類モデルにおける神経筋接合部伝達を評価するための刺激単繊維筋電図法 (SFEMG) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: 学ぶ単繊維筋電図法（SFEMG）を用いたげっ歯類モデルの神経筋接合部伝達評価法。ラット腓腹筋でジッターとブロッキングを定量化し、加齢や神経筋疾患の前臨床研究に応用できます。

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すべてのプロトコルは、ミズーリ大学の動物管理および使用委員会によって定められた規則に従って承認され、実施されました。
1.動物の準備と麻酔投与
<ol><li>適切な個人用保護具を着用してください。</li>
	<li>手順の前に、ラットの体重を測定して、体重ベースの薬と人工呼吸器の設定に適した用量を決定します。</li>
	<li>3%〜5%の吸入イソフルランで麻酔を誘発します。.適切なレベルの麻酔が確立されたら、ラットを腹臥位に置き、1%〜3%の吸入イソフルランで麻酔を維持します。</li>
	<li>鉗子で後肢のフットパッドをそっと押して、離脱反応がないことを観察することにより、麻酔の深さの適切性を確認します。</li>
	<li>体温を37°Cに保ちます。</li>
	<li>獣医師が認めた石油系の軟膏を目に塗り、乾燥を防ぎます。呼吸数を観察し、鉗子を使用してフットパッドに圧力を加えるときの離脱反応を評価することにより、麻酔の深さを監視します。</li>
	<li>バリカンを使用して評価する後肢を剃ります。適切な脱毛後、粘着テープを使用して、足首を約90°背屈に固定し、膝を伸展させ、股関節を外転させた状態で、研究する手足を配置します。</li>
	<li>実験全体を通してラットの呼吸と心拍数を継続的に監視します。 注:心拍数の増加は、麻酔薬の深さが不十分であることを示す指標として一般的に使用されます。</li>
	<li>イソフルランを投与してラットを安楽死させます。5%以上の用量で、少なくとも3分間呼吸が止まるまで。斬首による安楽死を確認します。</li>
</ol>2. 電極の配置とセットアップ
注:坐骨神経と腓腹筋のNMJ伝達は、筋電図(EMG)システムを使用して評価されます。 資料の表を参照してください。
<ol><li>陰極で坐骨神経を近位後肢の領域に刺激するための一対の絶縁された28G単極針を挿入しますが、陽極は仙骨を覆う皮下組織内に近位にあります。</li>
	<li>坐骨神経や他の隣接する構造への直接的な害を避けるために、刺激電極が坐骨神経のすぐ近くに、または過度に深く配置されていないことを確認してください。</li>
	<li>反対側の後肢または尾に使い捨ての接地電極を置きます。</li>
	<li>プラチナイリジウム材料で作られた記録面を特徴とする、単繊維筋電図用に特別に設計された27ゲージ、25mmの針電極を右の腓腹筋に慎重に配置します。無菌性を維持するために、各使用前にSFEMG電極がオートクレーブされていることを確認してください。</li>
	<li>SFEMG針電極を腓腹筋線維と平行に挿入して、単一線維活動電位(SFAP)を捕捉します。</li>
	<li>SFEMG針を筋肉内に挿入して操作する間は、筋肉の損傷を避けてください。</li>
</ol>3. 刺激型シングルファイバー筋電図法(SFEMG)の手技
<ol><li>0.3〜10 mAの強度範囲と0.1 msのパルス持続時間を使用して、10 Hzの周波数で右の坐骨神経に定電流刺激を加えます。</li>
	<li>1 kHzの低周波フィルターと10kHzの高周波フィルター内でフィルター設定を構成します。ゲインを分割あたり200μVから1000μVに調整して、電位の視覚化を容易にします。掃引速度を分割あたり500μsに設定します。</li>
	<li>刺激強度を調整して、記録とその後の分析のためにSFAPをトリガーおよび分離します。<ol><li>応答をSFAPとして識別および解析するには、以下の特定の基準が満たされていることを確認してください:ベースラインピークから負の相までの立ち上がり時間が500 μs未満であること、最小振幅(ベースラインピークから負)が少なくとも200 μVであること、および応答が一貫してオールオアナッシングの動作(応答間の安定したサイズと形状)を示すことを確認してください。 注:繰り返し発生する応答は、ノッチや変曲点のない一貫した上向きのフェーズを示すことが不可欠です。最後の基準は、高品質の信号と複数の信号の合計を区別するために重要であることに注意してください。</li>
	</ol></li>
	<li>少なくとも 50 回の刺激 (50 から 100 回の刺激) に続く連続放電間の SFAP 遅延 (刺激と SFAP の負のピークの上昇フェーズとの間の時間) の変動性であるジッターを計算し、ブロッキングを評価および定量化します。 注:ブロッキングは、各シナプスでの有無、または単一繊維の活動電位生成をトリガーしない刺激の割合として評価できます。ジッターは、次の式7 を使用して計算されます(ジッターは通常、クリニックの筋電図システムによって自動的に計算されます)。 <img alt="MCDジッター式図;パルス間間隔を用いてジッタをマイクロ秒単位で計算する方法" src="/files/ftp_upload/66452/66452eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> MCD = 連続差の平均値 IPI = インターポテンシャルインターバル</li>
	<li>追加の SFAP 応答に対してこのプロセスを繰り返します。平均して、各動物の 10 個のシナプスを評価してジッターを計算し、その後、動物あたりの平均値を決定します。</li>
	<li>ジッターが4μs未満のSFAPを解析から除外して、直接的な筋肉刺激11によって誘発された可能性のある電位を含めるのを防ぎます。</li>
	<li>断続的なブロッキングを示す電位を記録する場合は、刺激強度を上げて、SFAPの失敗が最大以下の刺激に起因していないことを確認します。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>げっ歯類のSFEMG:健康と疾患におけるNMJ機能の評価

<ol><li>Stalberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+velocity+in+human+muscle+fibers+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Propagation velocity in human muscle fibers in situ.</a> Acta Physiol Scand Suppl. 287, 1-112 (1966).</li>
<li>Stålberg, E., Trontelj, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+normal+and+abnormal+neuromuscular+transmission+with+single+fibre+electromyography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The study of normal and abnormal neuromuscular transmission with single fibre electromyography.</a> J Neurosci Methods. 74 (2), 145-154 (1997).</li>
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<li>Meekins, G. D., Carter, G. T., Emery, M. J., Weiss, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+in+the+trembler-j+mouse+demonstrated+by+stimulated+single-fiber+electromyography%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration in the trembler-j mouse demonstrated by stimulated single-fiber electromyography.</a> Muscle Nerve. 36 (1), 81-86 (2007).</li>
<li>Gooch, C. L., Mosier, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+single+fiber+electromyography+in+the+mouse%3A+Techniques+and+normative+data%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Stimulated single fiber electromyography in the mouse: Techniques and normative data.</a> Muscle Nerve. 24 (7), 941-945 (2001).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>&nbsp;27 G再利用可能な単一繊維針電極</td><td>Technomed</td><td>202860-000</td><td>単一繊維記録電極</td></tr><tr><td>2 mLガラス注射器ケン</td><td>トサイエンティフィックコーポレーション</td><td>SOMNO-2ML</td><td></td></tr><tr><td>取り外し可能なケーブル</td><td>Technomed</td><td>202845-0000</td>レコーダー<td>電極を電気診断機に接続する</td></tr>ために使い捨て2<tr><td>インチ×2インチのリード線付きディスク電極</td><td>Cadwell</td><td>302290-000</td><td>接地電極</td></tr><tr><td>使い捨てモノポーラ針 28 G</td><td>Technomed</td><td>202270-000</td><td>陰極および陽極刺激電極</td></tr><tr><td>EMG 針ケーブル (アンプ/刺激スイッチ ボックス)</td><td>Cadwell</td><td>190266-200</td><td>モノポーラ電極を電気診断刺激装置に接続する</td></tr><tr><td>鉄ベースのワニ口クリップ</td><td>ラジオ シャック</td><td>64-079</td><td>記録電極の配置の維持&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルラン(250mLボトル)</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>単射湾曲先端灌漑シリンジ</td><td>Covidien</td><td>81412012</td>電極<td>ゲルのアプリケーションに利用</td></tr><tr><td>RightTemp Homeothermic Warmingを備えた生理学的モニタリングシステム</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>PS-RT</td><td>赤外線加温パッド、直腸プローブ、パッド温度プローブ</td></tr><tr><td>が含まれています プロトリマーペットグルーミングキット</td><td>オスター</td><td>078577-010-003</td><td>脱毛用バリカン</td></tr><tr><td>ラット気管内チューブ (16 G)</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロコロニウムブロマイド</td><td>シグマ</td><td>PHR2397-500MG</td><td>神経筋ブロッカー剤</td></tr><tr><td>Sierra Summit 筋電図システム</td><td>Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA</td><td>NA</td><td>ポータブル電気診断システム</td></tr><tr><td>SomnoSuite Low-Flowデジタル麻酔システム</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>SOMNO</td><td>には、こぼれ防止、蒸気防止ボトルトップアダプターが含まれています。Yアダプターチューブ;炭掃気フィルター</td></tr>獣<tr><td>医師用石油ベースの眼科用軟膏&nbsp;</td><td>Puralube</td><td>26870</td>は<td>、角膜の損傷を避けるために麻酔中に適用されます</td></tr></tbody></table>

げっ歯類モデルにおける神経筋接合部伝達を評価するための刺激単繊維筋電図法 (sfemg)

Stimulated Single Fiber Electromyography (SFEMG) for Assessing Neuromuscular Junction Transmission in Rodent Models

NMJ伝送障害の状況でジッターとブロッキングの増加を実証するために、ロクロニウムの静脈内投与の有無にかかわらず、刺激SFEMGを実施しました。ロクロニウムは、手術や医療処置中に筋肉麻痺を誘発するために臨床現場で広く使用されている、中作用型の非脱分極性神経筋遮断薬です。これは、NMJ19でニコチン性アセチルコリン受容体に競合的に結合することによって動作します。ロクロニウムの投与に先立ち、成体野生型ラット(Sprague Dawley)を調製し、セクション1に記載したように麻酔をかけた。ロクロニウムによって誘発される麻痺のため、代表的なデータを取得するために侵襲的な換気サポートが使用されました (セクション 1 で説明した SFEMG 記録中の麻酔の典型的なアプローチとは対照的です)。気管内チューブを留置し、17mmHgの圧力と3cmH2Oの呼気終末陽圧の圧力制御モードを使用して、換気を60回/分に維持し、2%〜3%のイソフルランを送達しました。換気サポートと麻酔が達成されると、ロクロニウム(0.05 mg / kg臭化ロクロニウムのボーラス静脈内投与)による治療の有無にかかわらず、単一線維活動電位が記録されました。. 図1 は、成体ラットの同じNMJからの3つの代表的な単繊維活動電位記録を示しています。 図1A は、ベースラインから負のピークまでの立ち上がり時間が500 μs未満で、最小振幅(ピークtoピーク)が少なくとも200 μVの単一ファイバー活動電位(1回の刺激後)の典型的な形態を示しています。 図1B は、ロクロニウムの注入後にジッターが増加し、断続的なブロッキングの特徴を示しています。 図 1C は、NMJ ブロックの解決後の同じシナプスからのジッターとブロッキングの正規化を示しています。見やすくするために、 図1B、C は9回の連続した刺激後の応答のみを示しています。さらに、理解を深めるために、 図2 は、10回の連続した刺激後に観察された3つの単繊維活動電位の重ね合わせの追加の例を示しており、ジッターとブロッキングの増加が明らかになりました。
刺激SFEMGを用いてNMJ伝送に対するロクロニウムの影響を定量化するために、無処理の5つのNMJとロクロニウム送達後の5NMJから記録を行い、ジッターとブロッキングについて分析しました(図3)。ロクロニウムに続いて、ジッター(図3A)とブロッキング(図3B)が大幅に増加しました。
<img alt="遅延と振幅の傾向を示す単一ファイバー活動電位グラフ。ジッタ解析結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66452/66452fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:同じ神経筋接合部(NMJ)からの3つの代表的な単繊維筋電図記録。 (A)単一神経刺激後の単一線維活動電位の例は、振幅(ベースラインから少なくとも200μVの負のピーク振幅)と立ち上がり時間(ベースラインから負のピークが500μs未満)の基準を示し、単一繊維電位として受け入れられます。(B)ロクロニウム投与後のNMJ伝送障害を示すジッターとブロッキングの増加を示す9連続刺激後の重ね合わせた単一繊維活動電位の例(ジッター:68.35μs)。(C)9回の連続刺激後に単繊維活動電位を重ね合わせた例で、ジッターが減少し、ブロッキングがないことを示しており、ロクロニウム処理の解消後のNMJ伝送の正常化を示しています(ジッター:21.7μs)。代表的なSFEMGトレースは、重ね合わせたビューでブロッキングや正常なジッターのない健康なシナプスから記録された単一の筋線維活動電位を明らかにします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66452/66452fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="単繊維活動電位振幅グラフ。レイテンシーと振幅。ブロックされた刺激イベント。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66452/66452fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:ロクロニウム投与中の連続刺激後に記録された3つの重ね合わせた単繊維活動電位(SFAP)。 ロクロニウム投与中に10回連続して刺激を行った後、3つの重畳した単一繊維活動電位(SFAP)が記録され、ジッターとブロッキングの増加が示されました。A、B、Cのジッタ値は、それぞれ24.3μs、46.9μs、88.7μsでした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66452/66452fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="NMJジッターと伝送ブロッキングの棒グラフ。平均遅延、刺激率;研究データ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66452/66452fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:非脱分極性NMJブロッキング剤による治療後の神経筋接合部伝達(NMJ)の単繊維筋電図検査評価 (A)ロクロニウム投与中(0.05 mg / kg)、SFEMGは、健康な状態(未治療:12.9 μs、95% CI [7.2-16.9 μs]対ロクロニウム:40.70 μs、95% CI [34.7-70.7 μs])に対する伝達(ジッター)の変動性の増加を示しました(マンホイットニー検定:p = 0.0079)。(B)SFEMG上の各シナプスからのNMJブロッキングによる刺激の割合は、健康な状態と比較して増加しました(未治療:0%、95%CI [0-0%]対ロクロニウム:31%、95%CI [14.0-59.0%)(マンホイットニー検定:p = 0.0079)。すべての測定値(ジッターとNMJブロッキングによる刺激の割合)は、1匹のラット、未処理のn = 5シナプス、およびロクロニウム処理後のn = 5シナプスから得られた。データは中央値±95%信頼区間で示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66452/66452fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

げっ歯類モデルにおける神経筋接合部伝達を評価するための刺激単繊維筋電図法 (SFEMG)

As the final connection between the nervous system and muscle, transmission at the neuromuscular junction (NMJ) is crucial for normal motor function. ...

stimulated-single-fiber-electromyography-sfemg-for-assessing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

前部コンパートメントの筋肉への神経筋電気刺激（NMES）、安全かつ安価な治療モダリティのマウスモデルは、記載されています。このモデルは、マウスでターゲットを絞った特定の筋肉の収縮を誘発する目的のために容易に利用可能な臨床デバイスを変更できるという利点があります。...

神経筋電気刺激による筋力トレーニングのマウスモデル

この新しい方法は、単一の成体マウスの運動ニューロンとその筋線維による力の測定を同時に細胞内記録を可能にします。正常および遺伝子改変動物における運動単位の電気的および機械的特性の組み合わせ調査は、神経筋システムの研究のための画期的な製品です。...

腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録<emインビボ&gt;</em

このビデオでは、機能的な神経筋接合部を評価する方法を示します。筋肉組織と運動ニューロンを含むバイオリアクターと蛍光顕微鏡法を用いて、ニューロン内の光感受性チャネルを刺激して電気信号を生成し、筋線維の収縮を引き起こします。...

同時光刺激とビデオ録画による機能的神経筋接合部の評価

出典: Marinello, M., et al.共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組合せによるマウスの神経筋接合部の特性評価J. Vis.

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部の特性評価

神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ...

神経筋接合部機能を測定

神経伝導測定神経変性のマウス ・ モデルを評価するために有用なツールだけど、よく後肢で坐骨神経を刺激するためにのみ適用されます。ここでは、複合筋活動電位...

生体内で運動ニューロンの変性症のマウスモデルの前肢からの複合筋活動電位の電気生理学的測定

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

このプロトコルは、SMAおよびColQ関連のCMSのマウスモデルの病理学的変化を定量化するために使用される共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡の組み合わせによる神経筋接合部の形態測定分析の方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

この記事では、げっ歯類の腓腹筋に対して in vivo(表面および針電極アレイを使用)および ex vivo...

げっ歯類における in vivoおよび ex vivo 電気インピーダンス筋電視検査の実行

我々は、ヒト工学的骨格筋組織および光遺伝学的運動ニューロンを用いて神経筋接合機能を特徴付けるための、再現可能で自動化された、偏りのないイメージングシステムについて記載する。このシステムは、経時的な神経筋接続性の機能的定量化を可能にし、神経毒および重症筋無力症患者血清によって引き起こされる神経筋機能の低下を検出する。...

ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け

このプロトコールは、異なるバイオマーカー、すなわち、ニューロフィラメント200、小胞アセチルコリントランスポーター、α-バンガロトキシン、およびS100を有する蛍光免疫組織化学を用いて、ラット内側腓腹筋におけるシナプス前末端、シナプス後部受容体、およびシナプス周囲シュワン細胞間の空間的相関を調べる方法を示す。...

ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

学ぶ単繊維筋電図法（SFEMG）を用いたげっ歯類モデルの神経筋接合部伝達評価法。ラット腓腹筋でジッターとブロッキングを定量化し、加齢や神経筋疾患の前臨床研究に応用できます。

げっ歯類モデルにおける神経筋接合部伝達を評価するための刺激単繊維筋電図法 (SFEMG)

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