Name: 顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 学ぶ、顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュのI期卵子を迅速に単離する改良プロトコルです。ゲノム・エピジェネティクス研究における正確な解析を可能にし、発生生物学の理解を深めます。

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<meta charset="utf8"></head><body>無細胞顆粒膜のステージIゼブラフィッシュ卵母細胞を得るための改良された手順

<ol><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanism+of+long-term+bisphenol+S+exposure+disrupted+ovarian+lipids+metabolism%2C+oocytes+maturation%2C+and+offspring+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish.</a> Chemosphere. 277, 130304(2021).</li>
<li>Hau, H. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Larp6+controls+oocyte+development%2C+chorion+formation+and+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation.</a> Development. 147 (4), 187385(2020).</li>
<li>Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+ski7+tunes+RNA+levels+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition.</a> PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+reveals+insights+into+the+development+and+function+of+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary.</a> Elife. 11, 76014(2022).</li>
<li>Li, C. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+expression+of+bone+morphogenetic+protein+family+ligands+and+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+A+potential+paracrine-signaling+mechanism+for+oocyte-follicle+cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication.</a> Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).</li>
<li>Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+proteins+F-actin+and+tubulin+distribution+and+interaction+with+mitochondria+in+the+granulosa+cells+surrounding+stage+III+zebrafish+%28Danio+rerio%29+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes.</a> Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).</li>
<li>Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+teleosts%3A+How+eggs+are+formed%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in teleosts: How eggs are formed.</a> Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).</li>
<li>Song, Y., Hu, W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+models+expressing+fluorescence+proteins+in+the+oocytes+and+somatic+supporting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).</li>
<li>Sousa, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+hormones+affect+follicular+cells+and+ooplasm+of+stage+I+and+II+oocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish.</a> Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).</li>
<li>Yan, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+soma+controls+ovarian+follicle+proliferation+through+Gsdf+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish.</a> Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, R. A., Selman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+aspects+of+oogenesis+and+oocyte+growth+in+fish+and+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians.</a> J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).</li>
<li>Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+analysis+of+early+oogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish.</a> Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).</li>
<li>Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+oocyte+and+follicle+layer+for+gene+expression+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).</li>
<li>Zhan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explorations+of+the+optimal+method+for+isolating+oocytes+from+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+B+Mol+Dev+Evol%22%5BJournal%5D)">Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary.</a> J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).</li>
<li>Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals">https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals</a> (2020).</li>
<li>Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction">https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction</a> (2015).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>キンガーの細胞解離液</td><td>PlantChemMed</td><td>PC-33689</td><td>キンガーの細胞解離液は、-20°Cで安定して保存することができます。Cは包装後、低温(4°C;ゼブラフィッシュの卵巣の解離に直接使用できます。最適な温度は28.5°Cです。C、約2〜3時間。持続時間は、特定の解離条件に応じて、短縮または延長(https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689</td></tr>)のいずれかで調整できます。<tr><td>セルストレーナー(100 &mu;m )</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管針</td><td>/</td><td>/</td><td>ライターで燃焼して鈍化</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Yesen</td><td>40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>低吸着ピペットチップ (10 &mu;l)</td><td>Labsellect</td><td>T-0010-LR-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 ミディアム メディウム (L-グルタミン付き)</td><td>Hyclone</td><td>SH30525.01</td><td></td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>/</td><td>/</td><td>氷冷水はゼブラフィッシュの安楽死に使用されます</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>WIGGENS</td><td>WH-01</td><td></td></tr><tr><td>幼魚</td><td>/</td><td>/</td><td>5&ndash;受精後6週間、標準の長さ[SL]は10&ndashです。15 mm</td></tr><tr><td>プラスチック皿 (35 mm)</td> <td>SORFA</td><td>230101</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Motic</td><td>SMZ-161</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート (6ウェル)</td><td>SORFA</td><td>0110006</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 春鋏</td><td>Fine Science Toosl</td><td>#15000-00</td><td></td></tr></tbody></table>

顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるi期卵子の迅速な単離

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

図1 は、ゼブラフィッシュの成体と幼魚の両方で観察された卵巣の形態を示しており、参照として役立つさまざまな発生段階の卵子を示しています。 図1A は、一次成長段階(I期)から始まり、排卵卵子(V期)まで、各発生段階における卵子の形態とサイズをグラフで表したものです。 図1Ai-vは 、卵子のI期からV期に対応する直径を示しています。 図1B (左パネル)は、稚魚(SL = 1.5 cmで6 wpf)の卵巣画像を示しています。特に、幼若卵巣は明確な小葉状の外観を示し、主に透明なステージIの卵子が豊富にあり、ステージIIの卵子の集団が少ないことを特徴としています。このステージIの卵子の有病率は、卵子の観察と回収を非常に容易にします。右のパネルは、成魚の卵巣(6か月)の形態を示しており、さまざまな発生段階の卵子が観察できます。しかし、卵巣では不透明な後期卵子(II期からIII期)が優勢です。
図2 は、解剖からきれいなステージIの卵子を得るまでの代表的なプロセスを示しています。 図3 は、参照法と改変法の両方を使用して得られたI期の卵子を示しています。ヘキスト染色後、卵母細胞と顆粒膜細胞の核は紫外線下で青色の蛍光を示しました。参照方法(図3A)を使用して得られた画像では、卵母細胞の表面は多数の染色された顆粒膜細胞核によって密に囲まれていました。対照的に、改変法(図3B)によって分離されたI期の卵子は、完全な曝露と清浄度を示し、顆粒膜細胞核の染色は存在しません。
私たちの調査結果は、ステージIの卵子を単離するための提案された方法の有効性を実証しました。魚類の卵子の発生過程は、いくつかの共通の特徴を示している7。その種間の適用性を評価するために、他の魚種についてさらなる分析が行われました。雌の池のドジョウは地元の市場から入手し、初期卵子(直径&lt;100μm)も同様の手順で単離しました。また、ドジョウの卵巣組成は、複数の発生段階で卵子の混合物を示し、卵子の形態と大きさが同じ段階のゼブラフィッシュと驚くほど似ていることを特徴としていました。 図4Aに示されているように、成体の雌の池ドジョウの卵巣は、透明な初期卵子が点在する不透明な後期卵子によって優勢でした。卵母細胞の表面に顆粒膜細胞の透明な単層が観察されました。ゼブラフィッシュでの観察結果と同様に、直径が100 μm未満のドジョウ卵母細胞は、ジプロテン期の前の段階に対応していました。 図4B は、改変法によって得られたきれいな池のドジョウ(Misgurnus anguillicaudatus)の卵子を示しています。ゼブラフィッシュの卵巣と比較して、池のドジョウの卵巣は解離するのがより困難です。消化の6〜7時間後、より多くの初期卵子が解離します。それにもかかわらず、この調整されたアプローチにより、望ましい清潔で裸の卵子が得られました。ゼブラフィッシュはコイ科に属し、ドジョウはコビ科に分類されます。これら2つの科は分類学的には遠い関係を示していますが、卵巣の発達段階と形態は著しく類似しており、この方法は一般的にさまざまな魚種の卵子の分析に利用できることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig01v2.jpg"> 図1:ゼブラフィッシュの卵巣と卵子の異なる段階の代表的な画像(A)各発生段階における卵子の形態と大きさ(St)。i-vは、ステージIからVまでの卵子の画像と直径を表し、スケールバー= 200μm。 (B)成体および幼体のゼブラフィッシュの卵巣形態。スケールバー = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig02v2.jpg"> 図2:解剖からクリーンなステージI卵子の獲得までの単離手順の代表的な画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig03.jpg"> 図3:2つの方法によって得られたステージIの卵子 (A)参照された方法によって単離されたステージ(St)Iの卵子。(B)改変法により単離されたI期の卵子。卵子と顆粒膜細胞の核をHoechstで染色し、UV光で励起しました。スケールバー = 100 μm. BF = 明視野。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig04.jpg"> 図4:改変法で得られた池のドジョウの初期卵子 (A)卵巣の代表的な画像と池のドジョウの卵子。I、IIはさまざまな倍率でイヌドジョウの卵巣を表し、III-IVはイヌドジョウの初期卵子を表しています。スケールバー:i(500μm);ii(200μm);III、IV(100μm)。(B)池のドジョウから分離された初期卵子。卵子と顆粒膜細胞の核をヘキストで染色し、UV光で励起しました。スケールバー = 100 μm. BF = 明視野。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

半ばから後半ショウジョウバエ濾胞の段階特異的分離は、様々な目的に有用である。このような卵胞は、in vitroの開発アッセイとライブイメージングと結合される遺伝的および/ ​​または薬理学的な操作を可能にする、文化の中で開発しています。さらに、毛包には、mRNAおよびタンパク質を単離するなどの分子的研究のために使用することができる。...

ステージ固有の半ばから後半のユーティリティ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵胞の分離

ここでは、核小体の組織に基づいて、マウス胞状卵母細胞の特徴付けのためのプロトコルを提示します。...

核小体クロマチン組織に基づいてマウス洞卵母細胞の単離とキャラクタリゼーション

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を分離する方法、目的の細胞を濃縮する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムでゼブラフィッシュ細胞を捕捉する方法、および単一細胞からの遺伝子発現を評価する方法を説明しています。...

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

母方の遺伝子産物の操作に使用ゼブラフィッシュの卵母細胞の体外成熟のために最適化されたプロトコルは、ここに示されています。...

母親の遺伝子産物の機能操作の使用<em&gt;インビトロ</emゼブラフィッシュにおける&gt;卵成熟

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全体の睾丸針によるゼブラフィッシュを精原細胞の凍結保存に超急速冷却浸漬

ここでは、ゼブラフィッシュの卵巣卵胞で濾胞細胞と卵母細胞を分離するための簡単な方法を提示し、ゼブラフィッシュにおける卵巣の発達の調査を容易にする。...

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ダウンストリームアプリケーションのための鳥類の排卵前卵胞顆粒膜およびテカ細胞層の分離

ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。...

大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

学ぶ、顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュのI期卵子を迅速に単離する改良プロトコルです。ゲノム・エピジェネティクス研究における正確な解析を可能にし、発生生物学の理解を深めます。

顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

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