Name: 卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ 卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略。組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性に対処し、長期培養と予測バイオマーカー発見を可能にする方法です。

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この研究は、DKFZとミュンヘン大学病院LMUのパートナーシップであるドイツがん研究センターDKTK、パートナーサイトミュンヘンから資金提供を受けています。この研究は、ドイツのがん援助助成金(#70113426および#70113433)によっても支援されています。組織とオルガノイドのパラフィン包埋は、ミュンヘンのLMUミュンヘンにある医学部解剖学研究所のコア施設で実施されています。共焦点イメージングは、バイオメディカルセンター(BMC)のコア施設であるバイオイメージングで実施されています。著者は、技術的な支援をしてくれた Simone Hofmann、Maria Fischer、Cornelia Herbst、Sabine Fink、Martina Rahmeh に感謝します。

卵巣がんオルガノイドバイオバンキングの標準化

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<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expansion+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids+requires+a+low-Wnt+environment%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment.</a> EMBO J. 39 (6), e104013(2020).</li>
<li>Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+and+Wnt+pathways+regulate+stemness+and+differentiation+in+human+fallopian+tube+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids.</a> Nat Commun. 6, 8989(2015).</li>
<li>Trillsch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+optimize+the+biobanking+of+ovarian+cancer+organoids+by+accommodating+patient-specific+differences+in+stemness+potential%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102484(2023).</li>
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<li>Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf">https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf</a> (2021).</li>
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<li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Sci Rep. 10 (1), 12581(2020).</li>
</ol>

M.K.は、卵巣がんオルガノイドの培地に関する特許の発明者として登録されています。F.T.は、アストラゼネカ、クロービス、エーザイ、イムノジェン、メダック、MSD、ファーママー、ロシュ、SAGAダイアグノスティックス、テサロ/GSKから研究資金、アドバイザリーボード、謝礼、旅費を受け取りました。S.M.は、研究資金、アドバイザリーボード、名誉または旅費を受け取りました:アッヴィ、アストラゼネカ、クロービス、エーザイ、グラクソ・スミスクライン、Hubro、メダック、MSD、ノバルティス、ナイコーデ、オリンパス、ファーママー、ファイザー、ロシュ、センサーキネシス、テバ、テサロ。

設計されたプロトコルは、オルガノイド形成と長期継代の可能性に関する卵巣がんオルガノイドバイオバンキングの以前の課題に対処し、固形腫瘍沈着物の大部分から完全に拡張可能なラインの生成を保証します。オルガノイドの生成に使用される腫瘍サンプルの外科的収集プロセスは、収量と増殖の可能性に大きく影響します。腫瘍組織サンプルは、多臓手術、診断的腹腔鏡検査、生検など、さまざまな手順で採取できます。経験豊富な婦人科腫瘍外科医は、腹膜位置からきれいな腫瘍サンプルを取得することを優先する必要があります。特に、大きな腫瘍沈着物内の肉眼的に壊死した領域は、オルガノイド培養の成功にはあまり適していないことが観察されています。サンプルの純度は、ダウンストリームアプリケーション用の分子および表現型特性を反映するために重要であるため、最適なバイオバンキングのためには、臨床チームと検査チームの両方が同期して取り組み、腫瘍の最も関連性の高い領域からラインが作成されるようにする必要があります。
このプロトコルは、バイオバンキングの2年間に観察された成長因子依存性の変動をカバーしていますが、症例の20%でオルガノイドの成長が観察されず、限られた拡張の可能性を示した系統の数が幹細胞性の最適ではない維持を示唆していたため、有効性をさらに高めるためにさらなる改良が必要であることは明らかです。現在、オルガノイドバイオバンクには漿液性組織学(HGSOCおよびLGSOC)の卵巣がんサンプルのみが含まれていますが、構造化バイオバンキングプログラム以前のさまざまな上皮性卵巣がん組織型からのサンプルを使用した経験では、特定の違いなしに同等の成功率が示されました。特に、上皮性卵巣がんのサブタイプの大部分は、ミュラー管(卵管、子宮、子宮頸部)から発生した組織と同様の円柱状の偽層状形態を共有していますが、対照的に、卵巣上皮自体は生殖尖尾と中腎から発生し、直方体上皮の単層で覆われています。上皮の恒常性を調節する発生経路は、成体幹細胞の電位の制御において中心的な役割を果たすため、オルガノイドのバイオバンキングのプロトコルを開発する際には、胚起源の違いを考慮する必要があります。したがって、卵巣表面からの前駆細胞は、長期にわたって安定した成長を維持するために、臓器特異的な培養条件を必要とする可能性が高いと考えています。
特に、私たちの研究室では、ネオアジュバント化学療法は細胞の生存率と組織の表現型に影響を与えますが、ネオアジュバント後の卵巣がんサンプルに対してもプロトコルが成功することが証明されています。これらのサンプルは、オルガノイド形成の可能性に影響を与える可能性のある一次減量手術の化学療法未経験組織に由来するサンプルと比較して、より多くの破片および細胞外組織凝集体を示します。これらのケースでは、ネオアジュバント後のサンプルはより感度が高い可能性があるため、オルガノイドの作製を成功させるには、適切な量の手術組織と推奨される輸送条件の厳守が重要であることが分かりました。
新たに単離された前駆細胞の2Dにおけるプラスチック上の短時間の膨張がその後のオルガノイド増殖に及ぼす有益な効果の非常に興味深い現象は、繰り返し観察され、したがって標準化された実験手順に含まれていますが、 癌オルガノイド研究分野の方法論、主に直接播種戦略に依存しています。酵素消化後の前駆細胞の感受性と、それらを適切に呼び起こす成長因子の能力が、この違いの背後にある根本的なメカニズムである可能性があると推測したくなります。ただし、明確な依存関係を確立するには、さらなる研究が必要です。
消化が困難な3D卵巣がんオルガノイドの高い細胞接着性と機能的接合部がもたらす課題に対処するために、針とシリンジによる機械的および酵素的解離の組み合わせは、トリプシン処理後に大きな塊が残る場合に役立つ可能性があります。さまざまな酵素条件で実験することで、さらなる改善につながる可能性があります。
長期保存後、オルガノイド株を融解し、実験デザインに従って培養し、その後の用途に使用することができます。これにより、特定の研究目的ですでに生成されたオルガノイド株にいつでもアクセスでき、患者の疾患進行に照らして特定のオルガノイド株の長期的な挙動を調査するために特に興味深いものです。しかし、卵巣がんオルガノイドの凍結保存は依然として課題です。凍結および融解サイクル中の温度変化は、オルガノイドの生存率、機能性、および増殖能に悪影響を与える可能性があります。液体窒素では長期保存がより安定しており、非常に低い温度で分解のリスクが最小限に抑えられ、オルガノイドの完全性を維持できます。ただし、凍結、保管、融解の一貫した手順を確立し、これらのプロセスをさらに改善するには、継続的な最適化が必要です。
前述の未解決の問題にもかかわらず、このプロトコルは、卵巣がん患者の固形腫瘍サンプルから安定したオルガノイド株を一貫して生成する能力を示しています。当研究室では、これまでに120件の原発性卵巣がん組織検体を解析し、原発性減量術、再発性、術前補助術後の手術標本など、幅広い組織学的サブタイプや病期を含む約50%の症例で成功を収めています。このプロトコルは、さまざまな患者サンプルに由来するオルガノイドの生成、異なる培地での並行播種、および異なる播種戦略の実施のための構造化されたフレームワークを提供することにより、幹細胞電位の個人差を評価する機会を提供し、腫瘍生物学に関する追加情報を提供します。私たちの知る限り、大多数の研究は通常、少数のサンプルで培地成分をテストし、簡単にするためにほとんどが最適な培地を1つ選択するという逆のアプローチに従います。HER1βの効果、RSPO1とFGF10の補給の効果、および2D/3D播種の系統的試験は、卵巣がん組織が幹細胞性特性にある程度の患者間変動性を持ち、最適な培地が実際に患者特異的であることを決定的に示しています。したがって、異なる外因性パラクリンシグナル伝達環境を提供する異なる培地組成の体系的な並行試験が不可欠です。
さまざまな卵巣がん患者に由来するオルガノイドの広範なパネルと、前向きに収集された臨床情報を備えた生きたバイオバンクを確立することは、幅広い研究用途にとって貴重なリソースとして機能し、より多くの患者集団に適用できる可能性のある不均一な臨床状況を反映しています17。.長期培養と凍結保存により、実験の一貫性と、同じオルガノイド株を経時的に繰り返し入手することができ、腫瘍株の細胞特性が変わらない縦断的実験デザインの基礎となります。
オルガノイド株は、上皮構造と分極を保持することにより、パラクリンシグナル伝達経路によって媒介される細胞間コミュニケーションと状況依存的な細胞運命決定を研究するための適切なモデルです。組織学的ゲルへのオルガノイドの包埋は、固定後の材料の損失を回避するための実用的で効率的な中間ステップであり、下流の処理(パラフィンへの包埋と切片化)を組織サンプルと並行して実行できるようにします。固定手順中のオルガノイドの損失は、オルガノイドの数が非常に限られている場合に重大な問題です。しかし、この損失は、冷たい基礎培地で洗浄し、固定前に24ウェルフォーマットプレートの少なくとも2つの成熟ウェルをプールすることによって、細胞外マトリックスからオルガノイドを完全に除去することによって打ち消すことができます。免疫蛍光染色プロトコルは、卵巣癌オルガノイドの分子的および表現型的特徴を親の腫瘍組織と対応させる高解像度共焦点イメージングを可能にしますが、化合物に対する細胞応答や遺伝子組み換え株の特性評価を研究するための貴重なツールでもあります。この方法は、特定の修正を伴わない組織学染色にも適しています。研究の目的に応じて、ミクロトーム(2〜3μm)で切断されたより薄い切片を検討する必要があります。
重要なことに、安定した長期培養は、新規および標準治療に対する薬物反応および耐性に関する遺伝子編集実験および機能アッセイの前提条件である17,21。特に、疾患の進行および再発時に実施される再生検から生成されたオルガノイドは、治療歴のない元の腫瘍と、再燃中に観察された新たに獲得された特徴との間の直接比較分析の可能性を提供します。患者固有の治療反応の特定とin vitroでの治療抵抗性の形成は、卵巣がん研究における精密医療の分野を前進させます21。

上皮性卵巣がん患者の臨床管理は、進行期における臨床症状の不均一性および再発率の高さにより、依然として困難である1。卵巣がんの発生と生物学的挙動の理解を深めるには、疾患の経過中の患者固有の変動性、治療反応、病理組織学的および分子的特徴に対処する研究アプローチが必要です2。
バイオバンキングは、卵巣がん患者に由来する腫瘍サンプルとその臨床情報を体系的に収集し、長期保存することを特徴としており、一次減量手術、ネオアジュバント化学療法後、再発性疾患からの腫瘍サンプルなど、さまざまな疾患ステージの大規模な患者コホートの保存を提供します。がん研究を前進させる貴重な可能性を秘めており、有望な予後バイオマーカーや治療標的のリソースとして機能します3。しかし、ホルマリンの固定や凍結などの従来のバイオバンキング法は、生存率の喪失と天然の3次元組織構造の破壊のために、元の腫瘍サンプルの機能研究を行うのに適していません4,5。
腫瘍学およびそれ以外の分野における分子メカニズムの研究は、疾患の生物学を忠実に反映し、in vivoで観察された組織のin vitro特性を維持する適切な実験モデルの使用に決定的に依存しています。患者由来のオルガノイドは、再生能の保存に基づいて、上皮の元の構造と機能を実験室で再現し、患者固有の状況での検査を可能にします。したがって、それらは癌研究と個別化医療のための非常に有望なツールとして浮上しており、臨床的多様性と実験室研究の間のギャップを埋めています6,7,8,9。オルガノイド株の個々の薬物反応と分子プロファイルの機能的関連性の試験に基づいて調整された治療戦略は、患者ケアに直接適用できる可能性があります10,11。患者固有の特性を含む長期的な培養の可能性と、関連する前向き臨床データの収集は、疾患の進行と耐性メカニズムに関与する新しい予後および予測因子を特定する上で大きな期待を寄せています3,9。
それにもかかわらず、異なる腫瘍サンプルからのオルガノイドを含むバイオバンクを構築するには、複雑な方法論の厳守と、メンテナンスを容易にするためのプロトコルの設定を組み合わせる必要があります12。プロセスの標準化により、高い離職率でも訓練を受けたスタッフがバイオバンクを効率的に確立および維持できると同時に、最高の品質基準を順守することができます13。いくつかの研究で、元の腫瘍の突然変異および表現型プロファイルに対応する安定した卵巣がんオルガノイド株の作製に成功したことが報告されているが、効率はさまざまである。しかし、日常的なバイオバンキングは、特に大規模な拡大やゲノム編集の成功の前提条件であるラインの長期安定的な成長のためには、実際には依然として課題となっています。
特に、拡張性の問題は、成長が遅く、限られた成長の可能性を示すオルガノイドが確立された系統としてカウントされることがあるため、この分野では曖昧なままです。Hoffmannらによって最初に実証されたように、その主要な発見がこのさらに開発されたプロトコルの基礎を提供した研究、卵巣癌組織の最適な取り扱いには、不均一性に対応するための独自の戦略が必要です14。この方法によって得られたオルガノイドの表現型特性評価および親腫瘍組織との密接な類似性は、成熟培養物(4〜10か月の培養)のパネルDNAシーケンシングおよびトランスクリプトミクス分析によって確認され、モデルの安定性が実証されました8,9,12,14。
健康な卵管の恒常性を調節するパラクリン環境とは対照的に、高悪性度漿液性卵巣がん(HGSOC)、がん再生能、およびオルガノイド形成能力をもたらす可能性が高い上皮層は、外因性Wnt補給への依存度が低い。さらに、オルガノイド培地にノギンが存在しないことを特徴とする活性骨形態形成タンパク質(BMP)シグナル伝達は、卵巣癌の固形組織沈着物からの長期培養の確立に有益であることが証明されました14,15。卵巣がんの固形沈着物の体系的なバイオバンキング中に、私たちはこれらの発見を確認し、パイプラインを設定し、このプロトコルで詳細を概説することで、大部分の症例で持続的な長期拡大を保証します。一次単離株を扱う場合、異なる培地組成と播種モダリティの並行試験は、長期安定オルガノイド株の確立を改善し、収率を高め、下流の実験に必要なマルチウェルフォーマットへの堅牢な増殖と増殖を可能にするために不可欠であることがわかりました16。
さらに、手術中に採取されたサンプルの純度と品質は、基礎研究や分子診断における卵巣がんオルガノイドのトランスレーショナルポテンシャルにとって非常に重要です。HGSOCの臨床症状は複雑であるため、外科医、腫瘍医、およびラボの科学者が緊密に協力して、関連する材料を正しく識別し、輸送条件を一定に保ち、各患者の疾患の最も重要な特徴を表すオルガノイド株を高効率で生成する必要があります。このプロトコルは、卵巣がんを特徴づける不均一性を考慮して、卵巣がんオルガノイドの可能性を最大限に引き出すための標準化された適応可能なフレームワークを提供します16,17。特に、このプロトコルは、さまざまな組織型(高悪性度および低悪性度卵巣がん、LGSOC)、幹細胞性調節に違いを示す同じ患者からの異なる沈着物、ネオアジュバント後の手術からの組織、生検材料、および疾患進行の再発期の手術からのサンプルを含む、幅広い卵巣がんの臨床症状の信頼性の高いバイオバンキングを可能にします。

<table><tbody><tr><td>100 Sterican 26 G</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>100 Sterican 27 G</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>293T HA Rspo1-FC</td><td>R&D systems, Minneapolis, USA</td><td>3710-001-01</td><td>Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111</td></tr><tr><td>A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>616454</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 Medium&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>抗p53抗体 (DO1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX8 antibody</td><td>Proteintech, Manchester, UK&nbsp;</td><td>10336-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>ボトルトップ真空フィルター 0.2 & マイクロ;m</td><td>コーニング、ベルリン、ドイツ&nbsp;</td><td></td><td></td>430049</tr><tr><td>CELLSTAR細胞培養フラスコ、175 cm2</td><td>Greiner Bio-one、Kremsm&uuml;nster, Austria</td><td>661175</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 細胞培養フラスコ, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml;nster, Austria</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml;nster, Austria</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well Clear TC-treated&nbsp;</td><td>コーニング、ベルリン、ドイツ&nbsp;</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>クライオ SFM</td><td>プロモセル &ndash;Human Centered Science, Heidelberg, Germany</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear</td><td>R&Dシステム、ミネアポリス、米国</td><td>3533-005-02</td><td>代替案:マトリゲル、成長因子減少基底膜マトリックス&nbsp;コーニング、356231&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG Jackson</td><td>Immuno</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAKO&nbsp;Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt,</td><td>Germany C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32814</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&急性;リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>Epredia HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-well Polystyrene&nbsp;</td><td>コーニング、ベルリン、ドイツ&nbsp;</td><td></td><td></td>351447</tr><tr><td>フェザーメス&nbsp;</td><td>Pfm medical, Cologne, Germany</td><td>200130010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Formalin 37% acid free, stabilized</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Germany</td><td>1019205000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td></td><td></td>156630080</tr><tr><td>ヒト EpCAM/TROP-1 抗体</td><td>R&D systems, Minneapolis, USA</td><td>AF960</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF10</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant BMP2</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHC7146</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant EGF</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant Heregulin beta-1</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>LAS X core Software</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td>https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/</td></tr> <tr><td>Leica TCS SP8 X&nbsp;白色光レーザー共焦点顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント (100倍)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>3570519</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Omnilab, Munich, Germany</td><td>5170002</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Germany</td><td>1176201000</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>P4333-100</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 400 &micro;m</td><td>PluriSelect, Leipzig, Germany</td><td>43-50400-01</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Toulouse, France</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Roticlear</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>A538.5</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cryovials</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>375418PK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt,</td><td>Germany T8154</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany</td><td>A4974-0100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

患者由来のオルガノイドとその臨床的背景情報から卵巣がんバイオバンクを確立することは、研究と患者ケアの進歩を約束しますが、この致死的な悪性腫瘍の不均一性とオルガノイド技術の固有の複雑さが組み合わさったため、標準化は依然として課題です。この適応可能なプロトコルは、前駆細胞の患者固有の変動性を考慮して、卵巣がんオルガノイドの可能性を最大限に引き出すための体系的なフレームワークを提供します。最適な培養条件と播種方法を選択するための構造化された実験ワークフローを実装し、直接3D播種と2D/3Dルートの並列試験を行うことで、ほとんどの場合、幅広いダウンストリームアプリケーションに適した堅牢な長期増殖ラインが得られます。 
特に、このプロトコルは、高悪性度および低悪性度の卵巣癌や、一次減量、再発性疾患、および術前補助術後の手術標本を伴う疾患の病期など、非常に不均一な出発物質の多数の症例(N = 120)でテストされ、有効であることが証明されています。低Wnt、高BMPの外因性シグナル伝達環境内では、前駆細胞がヘレグリン1β(HERβ-1)経路の活性化に対して異なる感受性を示し、HERβ-1がオルガノイド形成を促進するものと阻害するものがあることが観察されました。患者のサンプルのサブセットでは、最適なオルガノイド形成と長期増殖のために、線維芽細胞増殖因子10およびR-Spondin 1を培地に添加する必要があります。 
さらに、組織消化と前駆細胞の単離の重要なステップを強調し、プラスチック上での2Dでの短時間の培養が、基底膜抽出物2型マトリックスにおけるその後のオルガノイド形成に有益である例を指摘します。全体として、最適なバイオバンキングには、個々のラインの適切な成長環境を特定するために、すべての主要な条件を並行して体系的にテストする必要があります。また、このプロトコルでは、包括的な表現型解析に必要なオルガノイドの高解像度画像を取得するための効率的な包埋、切片化、染色の処理手順についても説明しています。

最初の組織解離、濾過、およびカウントの後、細胞は、上記で説明したように、3Dフォーマットで直接並行して播種され、フラスコ内の懸濁液で短時間の2D増殖が行われます。場合によっては、一過性の2D増殖がオルガノイド形成にプラスの影響を与え、この経路を介して長期的なラインが正常に確立されますが、比較並行3Dシーディングは成長停止をもたらす可能性があります(図1)。処理された各ドナー組織について、細胞は培地マトリックスに従って検査されます。この戦略に従って、当社のバイオバンクには、 図2に示すように、各標準生育条件を代表するラインが含まれています。さまざまな培地と播種モードをテストするこのミニスクリーニングプラットフォームを厳密に実施することにより、卵巣がんのさまざまな組織学的タイプと疾患発症段階(図3)から、一次高悪性度漿液性、ネオアジュバントインターバル手術後、および再発性疾患からオルガノイド株を生成することに成功しました。親組織と比較した主要マーカーの免疫蛍光染色によるオルガノイド株の表現型特性評価は、上皮腫瘍区画の特徴がオルガノイドモデルに保持されていることを説得力を持って示しています:上皮構造と接着(EpCAM)、系統同一性(PAX8)、および核への蓄積につながるHGSOCに特徴的な典型的なTP53点変異(図4)。
オルガノイドバイオバンキングにおける効率的な意思決定のためには、いくつかの重要な方法論的ポイントも考慮する必要があります。オルガノイドの成長ポテンシャルは、オルガノイド直径の増加によってのみ決定されるわけではありません。さらに、表現型特性は、色、暗さ、輪郭の完全性などの膨張電位を決定します。細胞質ストレス液胞の形成は、最適ではない状態を示します。増殖およびオルガノイド形成能に関する最初の問題は、不適切な輸送条件および組織行列の遅延により発生する可能性がある。腫瘍株内では拡大電位の個人差が大きいため、増殖能について最終決定を下す前に少なくとも14日間待つことをお勧めします。異なる培地で類似した増殖パターンが最初に観察される場合は、複数の条件を展開する必要があります。私たちの経験から、長期安定的な成長の可能性を明確に区別することは、数週間または数か月の栽培後にのみ可能になることがよくあります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig01.jpg"> 図1:その後のオルガノイド生成のための一次分離株の2Dでの短時間の播種の利点。 (A)4つの異なる培地での2D/3Dおよび直接3Dシーディングの2ウェイパラレルシーディング戦略を示す実験レイアウトのスキーム。(B)トリプシン処理および3D転写前の接着一次分離株の画像。(C)パラレルシーディングが実施された一次堆積物の例では、最初にプラスチック上で単離された前駆細胞からのみ長期的なオルガノイド増殖が可能であるため、2D/3Dルートの明らかな利点が明らかになりました。左上の画像は、左下の写真の継代0(P1)後のオルガノイド形成が不十分で、継代0(P0と呼ぶ)で単離してから7日後の3D培養を示しています。プラスチックへの2D播種( 図1Bを参照)に続いて3D培養物に移した後、P0でより良好なオルガノイド形成がすでに明らかであり、継代4(P4)で長期的な増殖能が確認されています。スケールバー = 200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig02.jpg"> 図2:患者固有の培地要件。 4つの異なる長期安定拡張線の例は、それぞれ異なる培地で成長する。スケールバー = 500 μm。略語:OCM =卵巣がん培地;her = ヘレグリン 1β;HGSO = 高悪性度漿液性卵巣がん。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig03.jpg"> 図3:疾患のすべての段階からのオルガノイド生成。 原発性疾患の高悪性度漿液性および低悪性度漿液性卵巣癌、中間手術(術前補助化学療法後)、および再発癌組織からの長期安定な拡大線の画像。スケールバー = 500 μm。略語:HGSOC = 高悪性度漿液性卵巣がん;LGSOC = 低悪性度漿液性卵巣がん;NACT = ネオアジュバント化学療法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig04.jpg"> 図4:オルガノイドの表現型と親がん組織の密接な一致。 (A)がん組織と(B)対のオルガノイド株の免疫蛍光染色の共焦点画像は、すべてのマーカー、EpCAM(緑)、PAX8(赤)、TP53(マゼンタ)の染色パターンと発現レベルにおいて非常に高い類似性を示しています。スケールバー = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
表1:このプロトコルで使用される培地と消化混合物の組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467_Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、さまざまな病期からの卵巣がんオルガノイドを確立するための体系的なフレームワークを提供し、患者固有の変動性の課題に対処して、収量を増やし、その後のアプリケーションのための堅牢な長期拡張を可能にします。これには、組織処理、播種、培地要件の調整、および免疫蛍光染色の詳細な手順が含まれています。

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...

当院では、進行卵巣がん患者に対する最先端のトランスレーショナルリサーチにおける最良の臨床管理が最優先事項となっています。患者由来オルガノイドのバイオバンキングにより、私たちは個々に合わせた管理に向けて大きな進歩を遂げました。これにより、患者固有の特性を評価し、予測バイオマーカーを特定することができます。近年、進行卵巣癌患者に対する根治的多臓外科手術、化学療法、抗血管新生療法、さらにはPARP阻害剤療法の改善と生存率の向上において大きな進歩を遂げています。さて、次の大きなステップは、どの患者がどの特定の治療から利益を得るかをより正確に予測することです。現在、臨床治療の決定は、一般的な病理組織学的特徴および相同推奨欠乏症に関する情報に基づいているか、パラフィン包埋腫瘍組織で検査されている。化学療法および標的治療に対する特異的反応を評価する生物学的モデルは、臨床ルーチンにはまだ実装されていない。私たちは、卵巣がん組織の重要な特徴、特にin vitroでその再生能を維持するために必要な培養要件を特定し、この知識を使用して、オルガノイド株の堅牢な長期増殖を達成し、疾患のさまざまな段階のサンプルからバイオバンクを確立します。卵巣がんオルガノイドのバイオバンキングにおける私たちの日々の経験は、この悪性腫瘍の生物学における顕著な不均一性を効果的に示しており、新しい分類への道を開いたり、STEMIの可能性を標的とする新しい治療ソリューションの基礎を提供したりする可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

我々は、確立するための方法論を記述する...

三次元異<em&gt; in vitroで</em卵巣がんの発生と進行中に間質相互作用の上皮&gt;モデリング

患者由来のオルガノイド(PDO)は、トランスレーショナルがん研究における強力なツールであり、疾患の遺伝的および表現型的な不均一性および個別化抗がん治療に対する応答の両方を反映しています。ここでは、表現型解析および薬物応答の評価に備えてヒト原発性膀胱癌PDOを生成するための統合プロトコールが詳述されている。...

精密医療ツールとしての膀胱癌オルガノイドの培養

バイオバンクは生物医学研究にとって重要なリソースであり、欧州腫瘍学研究所のトランスレーショナルおよびデジタルメディシンユニットのバイオバンクはこの分野のモデルです。ここでは、さまざまな種類のヒト生体サンプルを管理するためのバイオバンクの標準操作手順について詳しく説明します。...

トランスレーショナルメディシンのためのバイオバンク:最適なサンプル管理のための標準操作手順

患者由来オルガノイド(PDO)は、 in vitroで腫瘍環境を模倣できる3次元(3D)培養です。高悪性度漿液性卵巣がんにおいて、PDOは新しいバイオマーカーと治療法を研究するためのモデルです。...

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

本プロトコルは、患者由来卵巣癌オルガノイドにおけるDNA損傷修復タンパク質を評価するための方法を記載する。ここには、包括的なめっきおよび染色方法、および詳細で客観的な定量手順が含まれています。...

免疫蛍光アッセイ による 患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)

患者由来の乳房腫瘍切除術または正常な乳房組織からヒト乳房オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルがここに提供される。このプロトコルは、ヒト患者由来の乳房オルガノイドを培養、凍結、解凍するための包括的なステップバイステップの手順を提供します。...

患者由来乳房オルガノイドの確立と培養

患者由来の卵巣がんオルガノイドを用いた治療薬試験の実施に使用できるプロトコルを提示します。...

前臨床薬物検査のための卵巣癌患者由来オルガノイドモデル

腫瘍オルガノイドは、がん研究と個別化医療へのアプローチに革命をもたらしました。これらは、臨床的に関連性のある腫瘍モデルであり、研究者は診療所で腫瘍の一歩先を行くことができます。このプロトコルは、新鮮な膵臓腫瘍組織サンプルおよび膵臓腺癌起源の患者由来の異種移植片から腫瘍オルガノイドを確立します。...

膵臓癌由来腫瘍オルガノイドおよび線維芽細胞の新鮮組織からの樹立

このプロトコルは、根治的前立腺全摘除術標本からのサンプルの収集を容易にする方法を説明しています。目標は、バイオバンクに保存する前に、解剖病理学的基準に基づいて標本から組織サンプルをマッピング、特性評価、およびミクロマクロで解剖することです。...

改善されたサンプリング技術と組織学的特性評価による前立腺腫瘍バイオバンキングの信頼性の向上

このプロトコルは、初代ヒト卵巣表面上皮(hOSE)細胞からの三次元(3D)組織オルガノイドの確立を説明しています。このプロトコールには、新たに採取した卵巣からのhOSEの単離、hOSEの細胞増殖、凍結保存融解手順、およびオルガノイドの誘導が含まれます。免疫蛍光、定量分析、スクリーニングプラットフォームとしての有用性の紹介が含まれています。...

組織再生研究のプラットフォームとしてのヒト卵巣表面上皮オルガノイド

このプロトコルは、 in vitro および in vivoでの高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)マウスモデルの開発について詳しく説明しています。マウス卵管オルガノイドの誘導から,ヒトHGSOC遺伝学を再現するための遺伝子組み換え,および腫瘍の in vivo...

高悪性度漿液性卵巣癌モデリングのための卵管上皮細胞からのマウス由来オルガノイド株の開発

学ぶ 卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略。組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性に対処し、長期培養と予測バイオマーカー発見を可能にする方法です。

卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処

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