光熱オフレゾナンスタッピングを用いたDNA三点星モチーフ自己組織化の高速原子間力顕微鏡イメージング

当研究室では、ナノスケールバイオロジーのための新しい計測技術を開発しています。特に、ナノメートルスケールでのダイナミックな生命過程を研究するための高速原子間力顕微鏡の開発に注力しています。そのために、私たちは最近、Photothermal Off Resonance Tapping(PORT)と呼ばれる新しいイメージングモードを開発しました。

このモードでは、専用のドライブレーザーを使用して、非常に制御されたカンチレバーを高速で作動させているため、従来のオフレゾナンスタッピングよりも最大2桁高速にデータを取得できます。高速AFMのゴールドスタンダードは、共振モードイメージングです。このモードでは、カンチレバーはこの共振周波数で作動するため、カンチレバーの位置を制御することはできず、その振動振幅のみを制御することができます。

ノーマルスピードAFMでは、オフレゾナンスモードがますます一般的になっています。ただし、ここでは作動周波数が制限されているため、このイメージングモードは非常に遅くなります。二次レーザーを使用してカンチレバーを作動させることで、より高い作動周波数を達成でき、つまりイメージング速度が速くなります。

このアプローチにより、他のオフレゾナンス人員配置モードに関連する利点を維持でき、イメージング感度と速度のバランスを最適化できます。最高のポートレートでは、イメージング速度に制限があります。ポートレートを増やしたい場合は、同じ作動振幅を維持するためにレーザー出力を増やす必要があります。

これにより、力の制御が不十分になり、サンプルが損傷する可能性があります。カンチレバーのサイズを小さくし、レーザー吸収効率を向上させることで、カンチレバーの帯域幅を拡大することで、適切なサンプルクリアランスを確保しながら、より高いポートレートを達成することができます。この進歩により、アセンブリダイナミクスの複雑さを調べるために重要なイメージング速度の高速化が促進されます。

まず、カンチレバーを清掃して準備します。カンチレバーを走査型電子顕微鏡またはSEMシステムと互換性のあるホルダーに取り付けます。次に、ガス注入システムで使用する前駆体ガスを加熱して、新しい先端を成長させます。

真空度がマイナス5ミリバールの累乗で10を下回ったら、ガス注入ラインをそれぞれ2秒間10回パージして、ノズルラインから残留空気を取り除きます。SEMを使用して、カンチレバーの端を見つけます。ホルダーを斜めに傾けて、原子間力顕微鏡イメージングのためにカンチレバーを正しく位置合わせします。

SEMの位置と焦点を調整して、カーボンナノチップが成長するカンチレバーの先端がはっきりと見えるようにします。次に、ソフトウェアで堆積パラメータを設定して、新しいチップを成長させます。カンチレバー先端に電子ビームを照射しながら先端を成長させる成膜プロセスを開始し、前駆体ガスを注入し、成膜が完了したらガス注入を停止します。

成長後のSEMイメージングを実施して、新しく成長させたチップの半径や長さなどの品質と特性を評価します。ホルダーをSEMチャンバーから取り外します。まず、高速原子間力顕微鏡を準備します。

ピンセットを使用して、カンチレバーホルダーのスプリングクリップの下に超短いカンチレバーを配置します。シリンジを使用して、左側の液体アクセスポートから50マイクロリットルの液体を追加します。次に、AFMヘッドの3つのノブを使用して、読み出しレーザーをカンチレバーに合わせます。

白い紙の上のカンチレバーの影を観察しながら、合計を最大化します。次に、2つの専用ノブを使用して、レーザースポットをフォトダイオードの中央に配置します。次に、励起VIの「励起有効」ボックスにチェックを入れて、ドライブレーザーのスイッチを入れて位置合わせし、カンチレバーを作動させて発振します。

カンチレバーの励起信号と偏向信号をオシロスコープに表示します。シャドウ方式を使用し、ドライブレーザー調整ノブで振動振幅を最大化します。ポートのカンチレバー発振振幅を調整するには、励起VIの構成ボックスにあるレーザーダイオード制御回路にDC電圧を追加し、レーザーダイオード制御回路のピークツーピークAC入力を入力します。

相互作用曲線を取得するには、ZコントローラVIを接触モードに設定し、開始をクリックしてサンプル表面にアプローチします。サーフェスに到達したら、カンチレバーのたわみ感度キャリブレーションのために、ランプVIで力対距離曲線を実行します。[引き出し]をクリックして、先端が届かない表面からZピエゾを引っ込めます。

完全にリトラクトした後、ZコントローラVIでポートモードに切り替え、励起VIで励起レーザーをオンにします。ポートモードを目的の周波数に設定します。明確な相互作用曲線は、非破壊バイオサンプルイメージングに不可欠な接触振動から自由振動を差し引くことによって得られました。100キロヘルツのポートレートで、良好な画像品質を達成しました。

しかし、励起周波数がカンチレバー共振に近づくと、フィードバック制御が悪化し、相互作用曲線が不明瞭になったり、画質が劣化したりしていました。まず、酢酸マグネシウムの10ミリモル溶液を準備します。ハミルトンのシリンジを使用して、カンチレバーホルダーの流体チャネルに50マイクロリットルの溶液を注入し、カンチレバーを包み込む液体の滴を作り出します。

スキャンVIのスキャンサイズを800 x 800ナノメートルに、ラインレートを100ヘルツに設定します。表面をスキャンするには、フレームの矢印をクリックして品質を確認します。スキャン後、ZコントローラVIの「引き出し」をクリックして、カンチレバーを表面から引っ込めます。

ハミルトンシリンジを使用して、カンチレバーホルダーから緩衝液を取り出します。次に、希釈したDNA3点スター溶液を調製し、この溶液の50マイクロリットルをカンチレバーホルダーに注入します。800 x 800ナノメートルの領域で、デフォルトのラインレートである100ヘルツでイメージングを実行します。

最初のスキャン後、イメージングサイズと速度を調整し、VIを指定された値にスキャンしてさらにデータ集録を行います ZコントローラVIセットポイントボックスの設定値の入力を、イメージングプロセス全体で正確なトラッキングに必要な最低レベルに維持します。必要なすべてのサンプル領域について、これを繰り返します。このプロトコルを用いて、DNAの3点星モチーフの安定な島へのリアルタイム集合を高速ポートAFMで観察しました。

100キロヘルツのポートレートに対して、100ヘルツと200ヘルツのラインレートで鮮明な画像が得られました。ただし、ポートレートを上げずにイメージング速度を上げると、トポグラフィーの変更が速いため、画質が低下します。最も低いピークtoピークACインプットのDNAスリーポイントスターのイメージング結果は、無傷の構造を示しましたが、最も高いピークツーピークACインプットでは、より高い力によるサンプル損傷が観察可能になりました。

同様に、最も低いDCオフセット入力は無傷の構造を示し、最も高いDCオフセット入力は構造的な損傷を引き起こしました。