Name: 光熱オフレゾナンスタッピングを用いたDNA三点星モチーフ自己組織化の高速原子間力顕微鏡イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ光熱オフレゾナスタッピングを用いた高速原子間力顕微鏡イメージング法。DNA三点星モチーフの自己組織化をナノスケールで観察し、生体分子相互作用の動的プロセスを詳細に解析する革新的計測技術です。

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<meta charset="utf8"></head><body>PORT高速原子間力顕微鏡によるDNA星モチーフのイメージングの改良

<ol><li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+and+its+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy and its future prospects.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).</li>
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<li>Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+for+high-speed+atomic+force+microscopy+optimized+for+low+phase-lag%5BTitle%5D)+AND+%222017+IEEE+International+Conference+on+Advanced+Intelligent+Mechatronics+%28AIM%29%22%5BJournal%5D)">Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag.</a> 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).</li>
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<li>Open Hardware. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/</a> (2023).</li>
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<li>BioLever. AppNano. , Available from: 
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<li>Python Scripting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html">http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html</a> (2023).</li>
<li>Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cantilever+actuation+for+fast+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).</li>
<li>Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+feedback+performance+in+off-resonance+AFM+modes+through+pulse+train+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling.</a> arXiv. , (2023).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>AC10DS</td><td>オリンパス</td><td>BL-AC10FS-A2</td><td>販売終了&nbsp;</td></tr><tr><td>Biometra Compact XS/S</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-025-199&nbsp;</td><td>電気泳動&nbsp;ユニット</td></tr><tr><td>Biometra TRIO</td><td>Biometra GmbH</td><td>207072X</td><td>アニーリング用サーモサイクラー</td></tr><tr><td>カスタムAFMセットアップ</td><td>バイオナノ計装用研究室、インターファカルティバイオエンジニアリング研究所、工学部、エコールポリテクニークF&eacute;d&eacute;ローザンヌ</td><td></td>は<td>、バイオナノ計装</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ITW試薬</td><td>A5097</td>の研究所を通じて入手でき、<td>アニーリングバッファーレーザー</td></tr><tr><td>パワー</td><td>メーターThorlabsPM100D</td><td></td><td>デジタルハンドヘルド光学&nbsp;パワー&エネルギーメーターコンソール</td></tr><tr><td>活気ある 3AP 電源, MP-310</td><td>メジャーサイエンス</td><td>MP-310</td><td>電気泳動電源</td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB544692</td><td>インアニーリングバッファー</td></tr><tr><td>TBE</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>327330010</td><td>電気泳動用ランニングバッファー</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>インアニーリングバッファー</td></tr></tbody></table>

光熱オフレゾナンスタッピングを用いたdna三点星モチーフ自己組織化の高速原子間力顕微鏡イメージング

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-Point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping

本研究では、HS-PORT AFMの能力を利用して、DNAの3点星モチーフの安定な島への動的集合過程を観察することに成功しました。この技術により、これらの構造の組み立てをリアルタイムでキャプチャすることができました。 図2A、Bでは、100 kHz PORTレート(800 nm x 800 nmスキャンサイズ)で、それぞれ100 Hzと200 Hzのラインレートで鮮明な画像スキャンが行われています。これは、ピクセルあたりそれぞれ3.9回と1.95回の発振サイクルに相当します。ただし、PORTレートを同時に増加させずに高速でイメージングすると、ピクセルあたり最低1回の発振サイクルが可能になるため、 図2C (ピクセルあたりの発振サイクルは0.78)に見られるように、画質が大幅に低下します。イメージング速度は、カンチレバーが適切なチップサンプル力制御で表面をプローブする速度によって制限されます。これは、地形の変化速度が速すぎて表面サンプリングレートで追跡できなくなるためです。
十分に高いPORTレートを設定することに加えて、PORT曲線に力を制御するために必要な情報が含まれていることが重要です。特に流体力学的抗力と低い検出帯域幅は、加えられた力を不明瞭にする可能性があります。 図3 は、サンプルの表面からさまざまな距離でのカンチレバーのたわみと励起周波数率を、ノイズを低減するための平均4096曲線を使用して示しています。 図 3A (100 kHz PORT レートの場合) と 図 3D (500 Hz PORT レートの場合) の青い曲線は、カンチレバーが表面から離れて自由に振動する(1 回の振動サイクル中に表面に触れない)場合のカンチレバーの動きを表しています。赤い曲線は、カンチレバーが表面の近くで振動し、断続的に表面に接触してサンプルをプローブするときのカンチレバーのたわみを示しています。真の交互作用曲線、つまりチップとサンプルの交互作用を求めるために、赤の曲線から青の曲線を差し引いて、 それぞれ図3B、Eを求めます。非破壊バイオサンプルイメージングに必要な明確な相互作用曲線の例を 図3Bに示します。この構成により、 図 3C に示す良好なイメージング品質が得られ、PORT レートは 100kHz です。カンチレバー共振に近づくにつれて励起周波数を上げると、励起レーザー出力を上げた後にカンチレバーが表面から離れるほどの振幅振動を示しても、ある時点でフィードバック制御が劣化します(図3E)。PORT周波数がカンチレバー共振周波数に近すぎると、カンチレバー共振によりカンチレバーダイナミクスの時間応答が制限されます。したがって、カンチレバーの曲がりは、チップとサンプルの相互作用を正確に表さなくなり、得られる相互作用曲線が不明瞭になります。これにより、 図3Fに示すように、画質が低下します。
より高いPORT周波数での相互作用曲線の低下は、現在商用高速AFMカンチレバーの制限要因の1つである高周波数33での作動効率の低下によっても発生する可能性があります。この減少は、最終的にロールオフの閾値レベルに達し、適切なイメージングが妨げられます:振動振幅が表面から離れるには不十分であり、先端が常に接触しているため、サンプル構造が損傷する可能性があります。PORTレートが高くなると発生する振幅の減少を打ち消すために、レーザー出力の増加を検討しました。この効果をよりよく観察するために、より高いレーザー出力に到達できるPORTヘッドを使用しました。励起レーザーのレーザー出力は、パワーメーターで測定し、DC成分とAC成分に分けました。総電力は、レーザーダイオード制御回路に送られるピークtoピーク電圧(ピークtoピークAC入力)とDC電圧(DCオフセット入力)をソフトウェアで調整することにより制御されます。 図4A は、ピークtoピークAC入力の増加に起因するピークtoピークカンチレバー発振振幅を示しています。予想通り、発振振幅はAC入力値とよく相関しています。これらのピークツーピーク振幅は、PORTイメージングで通常使用される振幅よりも大きいことに注意することが重要です。壊れやすいサンプルをイメージングする場合、AC振幅は10〜30nmのオーダーです。 図4B は、DCオフセット入力が増加した場合のピークtoピークのカンチレバー発振振幅を示しています。ピークtoピーク発振振幅は、DCオフセット電圧範囲にわたってほぼ一定に保たれます。この小さな変動は、検出の非線形性に起因すると考えています。 図4C は、ピークtoピークACの増加によるACおよびDCレーザーパワーコンポーネントの増加を示しています。 図4D は、DC入力オフセットの増加によるACおよびDCレーザーパワーコンポーネントの増加を示しています。
ピークtoピークAC入力とDCオフセット入力の増加による影響を別々にテストして、総電力と発振振幅に対するそれぞれの影響を決定しました。レーザー出力の増加は、おそらく温度上昇によってサンプルを混乱させますが、振動振幅の増加はサンプル5への衝撃力を増加させます。 図4Cに示すように、ピークtoピークAC入力のみを増加させると、レーザー出力の合計増加への影響が少なくなり、 図4Aに示すように、カンチレバー振動の振幅(ひいては衝撃力)が主に増加します。DCオフセット入力を増やすと、 図4Dに示すように、レーザー出力の増加に大きな影響を与え、サンプルを加熱しますが、 図4Bに示すように、たわみ振幅への影響はごくわずかです。イメージング結果を 図4E、Fに示します。 図4E は、最も低いピークtoピークAC入力(左の画像、青丸で囲んだ部分)と最も高いピークtoピークAC入力(右の画像、赤丸で囲んだ部分)のDNA 3PSを示しています。これは、おそらくより高い力によってサンプルが損傷する結果です。 図4F は、構造が損傷している最小のDCオフセット入力(左の画像、青の丸で囲んだ部分)と最も高いDCオフセット入力(右の画像、赤の丸で囲んだ部分)のDNA 3PSを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig01.jpg"> 
図1:HS-AFMのセットアップ(A)スキャナーとAFMのベースのPORTヘッド、(i)カンチレバーの読み出しレーザーフォーカスを調整するためのノブ、(ii)カンチレバー上の読み出しレーザー位置を調整するためのノブ、(iii)フォトダイオード上のレーザーの水平位置を調整するためのノブ、(iv)フォトダイオード上のレーザーの垂直位置を調整するためのノブ、 (v)カンチレバー上の光熱駆動レーザーの位置を調整するためのノブ。(B)サンプルステージのあるヘッドの断面図でのカンチレバーのクローズアップ、(vi)はカンチレバーを保持しているスプリングクリップです。液体注入用のチャネルは赤でマークされています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig02.jpg"> 
図2:AC10を使用して100 kHz PORTレートで、異なるラインレートで画像化されたDNA 3PSサンプル(A)100 Hz(ピクセルあたり3.9振動サイクル)、(B)200 Hz(ピクセルあたり1.95振動サイクル)、および(C)500 Hz(ピクセルあたり0.78振動サイクル)。画像は350pN以下の設定値で撮影されました。スケールバー200nm。たわみ感度を求めるための力曲線を撮像後に撮影しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig03v3.jpg"> 
図3:100KHzおよび500kHzのPORTレートでのカンチレバーのたわみ、相互作用曲線、および画質。 (A)カンチレバーのたわみ(カンチレバーが表面に接近しているが表面に接触していない状態のカンチレバーの自由な振動を青色で、カンチレバーが表面に断続的に接触しているときのカンチレバーの振動を赤色)、(B)相互作用曲線、(C)100kHz PORTレートでのそれぞれの画質。(D)カンチレバーのたわみ(カンチレバーの自由な振動が表面に近いが接触していない青色、カンチレバーが表面に断続的に接触しているときのカンチレバーの振動を赤色)、(E)相互作用曲線、(F)500kHzポートレートのそれぞれの画質。画像は100Hzのラインレートで撮影されました。たわみ感度を求めるための力曲線を撮像後に撮影しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig03largev3.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig04.jpg"> 
図4:ピークツーピークAC入力電圧DCオフセット入力電圧の影響。 カンチレバーのピークtoピーク発振に対する(A)ピークtoピークAC入力電圧と(B)DCオフセット入力電圧の増加の影響。(C)ピークツーピークAC入力電圧と(D)DCオフセット入力電圧の増加がACおよびDCレーザー出力に及ぼす影響。最小(青丸)と最大(赤丸)の画像品質(E)ピークツーピークAC入力電圧と(F)DCオフセット入力電圧。ピークtoピークAC入力電圧を増加させると、DCオフセット入力電圧は600mVに維持されました。DCオフセット入力電圧を増加させると、ピークtoピークAC入力電圧は200mVに維持されました。高出力構成では、サンプルの完全性が損なわれます。PORTレートは100kHz、ラインレートは100Hzに保たれ、スケールバーは200nmに保たれました。たわみ感度を求めるための力曲線を撮像後に撮影しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

光熱オフレゾナンスタッピングを用いたDNA三点星モチーフ自己組織化の高速原子間力顕微鏡イメージング

High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) is a popular molecular imaging technique for visualizing single-molecule biological processes in real-time due ...

high-speed-atomic-force-microscopy-imaging-dna-three-point-star-motif

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

プラスミドDNA、細胞質タンパク質、およびDNA...

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

この動画では、特定の遺伝子座におけるDNA分子上の融合タンパク質凝縮物の集合を、1分子イメージングを用いて可視化する方法を説明しています。これらの凝縮物は、LCD-LCDおよびLCD-DBDの相互作用によって形成され、RNAポリメラーゼIIの動員と遺伝子転写の促進を可能にします。...

DNAカーテン上の融合タンパク質凝縮物の集合を可視化するための1分子イメージング

このビデオでは、組み立てられたヌクレオソームを視覚化するための静的原子間力顕微鏡法を実演します。この高解像度イメージング技術により、ヌクレオソーム構造の研究が可能になります。...

アセンブルされたヌクレオソームを可視化し、特性評価するための静的原子間力顕微鏡

このビデオでは、ヌクレオソーム複合体のダイナミクスを研究するための高速タイムラプス原子間力顕微鏡、AFM、イメージング技術を実演します。AFMチップがヌクレオソームの表面を走査すると、ヌクレオソームの高さの変化が検出され、DNAの経時的な解き放たれが記録されます。...

ヌクレオソームダイナミクスを捉える高速タイムラプス原子間力顕微鏡

ここでは、二枚の光学トラップされたマイクロスフェアの間に懸架単一のDNA分子と相互作用する単一の蛍光標識タンパク質分子を検出するための機器および方法が記載されている。...

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

セミフレキシブル高分子は、生きているシステムで広く適用されているユニークな力学特性を表示します。ただし、ポリマーの剛性などのプロパティにはアクセスできませんので、生体高分子に関する体系的な研究は制限されます。本稿では、プログラム可能な DNA...

セミフレキシブル高分子を研究する多目的ツールとして DNA ナノチューブ

本稿では T4 結紮およびアニール小さな環状 dna の変性のページ浄化のための詳しいプロトコルとゲルの円形タイル、組立およびアガロースと同様、1 D および 2 D の DNA ナノ構造の原子間力顕微鏡イメージングのネイティブのページの分析有限の DNA...

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

ここでは、静的および時間経過の原子間力顕微鏡 (AFM)...

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

ここでは、力に敏感な生体分子を最大1.2kHzの速度でナノメカニカル測定を行う高速磁気ピンセットのセットアップについて説明します。モデル系としてDNAヘアピンやSNARE複合体への応用を紹介しますが、メカノバイオイベントに関与する他の分子にも応用できます。...

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

この記事では、単一分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のためにヌクレオソーム含有DNAテザーを再構成するための詳細な実験手順を示します。さらに、クロマチン相互作用タンパク質の結合挙動を視覚化し、ヌクレオソームの物理的特性の変化を解析するために実施できるいくつかの下流実験についても説明します。...

単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

このプロトコルは、CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しのライブ可視化のための単一分子アッセイの実施を示しています。(1)DNA基質の調製、(2)蛍光標識 されたDrosophila melanogaster...

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

学ぶ光熱オフレゾナスタッピングを用いた高速原子間力顕微鏡イメージング法。DNA三点星モチーフの自己組織化をナノスケールで観察し、生体分子相互作用の動的プロセスを詳細に解析する革新的計測技術です。

光熱オフレゾナンスタッピングを用いたDNA三点星モチーフ自己組織化の高速原子間力顕微鏡イメージング

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