Name: 好酸球性食道炎における上皮バリアを調べるための三次元細胞培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 23 s
Description: 学ぶ好酸球性食道炎における上皮バリア障害のメカニズム。気液界面培養を用いた三次元食道オルガノイドモデルで、IL-20サブファミリーサイトカインとMAPキナーゼ経路の関与を解明する方法です。

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SNSFのJ.H.N.への助成金310030_219210は、この原稿の出版を制限なく支援しました。 図 1 は、BioRender.com の助けを借りて作成されました。

この手続きは、北西および中央スイスの倫理委員会(EKNZ;Project-ID 2019-00273)。すべての患者は、内視鏡検査の前に生検の実験的使用について書面によるインフォームドコンセントを提供しました。この試験で使用された試薬および機器は、 材料表に記載されています。
1. 患者由来の食道オルガノイドの細胞単離
注:ヒト食道オルガノイドを培養するための培地成分のリストを 表1に示します。
<ol><li>生検を取得します。 注: 本研究では、2.8 mm のワーキング チャネルを備えた胃鏡を使用して、生検鉗子を使用した食道胃十二指腸内視鏡検査中に、1 つの食道セグメントから 2 つの生検が取得されます。</li>
	<li>生検を市販のケラチノサイト無血清培地(KSFM;Ca2+ 0.09 mM、1 ng/mL EGF、50 μg/mL BPE)。 注:生検は、使用まで数時間氷上に保存できます。</li>
	<li>KSFM培地を1 mLのディスパーゼI(10 U/mL)と交換し、生検を室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>生検を室温で300 x g で2分間遠心分離します。</li>
	<li>1000 μLピペットを使用して、生検や細胞破片ペレットに触れずにディスパーゼを吸引します。</li>
	<li>生検を1mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)ですすいでください。</li>
	<li>生検を室温で300 x g で2分間遠心分離します。</li>
	<li>1000 μLピペットを使用して上清を吸引します。</li>
	<li>800 rpmで振とうしながら、500 μLのトリプシン-EDTA(0.05%)と37°Cで10分間、生検をインキュベートします。</li>
	<li>単一細胞懸濁液が得られるまで、ピペッティングの上下を繰り返すことにより、機械的な破壊を行います。</li>
	<li>ツベルクリンシリンジのゴム製プランジャーヘッドを使用して、70 μmのセルストレーナーで細胞をろ過します。</li>
	<li>ストレーナーを2〜4 mLの大豆トリプシン阻害剤(250 μg / mL)で洗浄します。.</li>
	<li>5 mLの丸底ポリスチレンチューブにスナップオンキャップを取り付けた35 μmセルストレーナーで細胞をろ過します。</li>
	<li>シングルセル溶液を15 mLのコニカルチューブに移します。</li>
	<li>300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>1000 μLピペットを使用して上清を吸引します。</li>
	<li>細胞を100 μLのKSFM培地に再懸濁します。</li>
	<li>10 μLのトリパンブルーと10 μLの細胞懸濁液を混合します。</li>
	<li>自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。</li>
</ol>2. 患者由来のオルガノイド培養
<ol><li>カウント後、1〜2 mLのKSFMを細胞懸濁液に加えます。</li>
	<li>300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>細胞ペレットを乱さずに1000μLピペットで上清を吸引します。</li>
	<li>細胞ペレットを基底膜抽出物(BME)ハイドロゲルマトリックス(20,000細胞あたり40μLのBME)に再懸濁します。 注:BMEを追加した後は、BMEの早期固化を防ぐために、セルを氷上に保ちます。</li>
	<li>200 μLのピペットチップを切り取り、粘性のあるBME細胞懸濁液混合物を吸引します。</li>
	<li>予熱した(37°C)浮遊細胞培養プレートで40μLの液滴を形成します。</li>
	<li>培地なしでプレートを37°Cで20〜30分間インキュベートし、BME液滴が固まるようにします。</li>
	<li>培養の最初の2日間、10 μMのY27632(ROCK阻害剤)を添加した予熱したKSFM-C培地を添加します。</li>
	<li>1日おきに、培地を新しいKSFM-C培地(Y27632および目的の+/-サイトカインを含まない)と交換してください。</li>
	<li>培地を吸引し、ピペットチップで液滴を掻き取りながら、1 mLのディスパーゼII(1.5 U/mL)をウェルに連続的に加えます。</li>
	<li>BMEディスパーゼ混合物を15 mLの遠心分離チューブに移し、37°Cで20分間インキュベートし、BMEを消化します。</li>
	<li>250 x g で4°Cで3分間遠心分離し、ディスパーゼIIを吸引します。</li>
	<li>目的の読み出しのプロトコルに従って進行します(例:RNA単離、タンパク質単離、または組織学のための4%PFAによる固定)。</li>
</ol>3. 患者由来の気液界面(ALI)培養のための細胞単離
<ol><li>生検を取得します。2.8 mm のワーキング チャネルを備えた胃鏡を使用した食道胃十二指腸内視鏡検査では、生検鉗子を使用して 1 つの食道セグメントから 2 つの生検が行われます。</li>
	<li>生検を市販のケラチノサイト無血清培地(KSFM;Ca2+ 0.09 mM、1 ng/mL EGF、50 μg/mL BPE)を使用し、使用するまで数時間氷上に保存します。</li>
	<li>KSFMを1 mLのディスパーゼ(10 U/mL)と交換します。その後、生検を室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>生検を室温で300 x gで2分間遠心分離します。</li>
	<li>1000 μLピペットを使用して、生検や細胞破片ペレットに触れずにディスパーゼを取り出します。</li>
	<li>生検を1mLのDPBSで洗浄します。</li>
	<li>室温で、生検を300 x g で2分間スピンダウンします。</li>
	<li>上清を1000μLのピペットで吸引します。</li>
	<li>生検を500 μLのトリプシン-EDTA(0.05%)で37°Cで10分間インキュベートし、インキュベーション中に800 rpmで連続的に混合します。</li>
	<li>単一細胞懸濁液が得られるまで、ピペッティングを繰り返して生検を機械的に中断します。</li>
	<li>解離した細胞を、ツベルクリンシリンジのゴム製プランジャーヘッドを備えた70μmのセルストレーナーに通し、細胞を50mLのコニカルチューブに集めます。</li>
	<li>ストレーナーを2〜4mLの大豆トリプシン阻害剤(250μg / mL)で洗浄し、残りの細胞をストレーナーから取り出します。</li>
	<li>35 μmのセルストレーナースナップキャップで細胞を5 mLの丸底ポリスチレンチューブにろ過します。</li>
	<li>細胞を15mLのコニカルチューブに移します。</li>
	<li>300 x g 、4°C、5分間遠心分離します。</li>
	<li>1,000 μLのピペットで上清を取り除きます。</li>
	<li>細胞ペレットを10 μM Y27632を含む4 mLのKSFM培地(Ca2+ 0.09 mM)に再懸濁します。</li>
	<li>細胞をT25細胞培養フラスコに移します。</li>
	<li>初代ケラチノサイトを増殖させるために、細胞を60%〜80%のコンフルエント度になるまで約1週間培養します。 注:継代(P)0は膵島様の細胞コングロマリットを形成し、単層ではありません。初代ケラチノサイトは、P1以降に単層を形成します。</li>
	<li>60%-80%のコンフルエントで継代し、2-3 T25または1-2 T75細胞培養フラスコでP1を再播種します。</li>
	<li>ケラチノサイトが60%〜80%のコンフルエントで単層を形成するときに、再びP1を通過します。</li>
</ol>4. 患者由来の気液界面(ALI)培養
<ol><li>P2初代ケラチノサイトをALI培養用のトランズウェルインサートに播種します。 注:500 μLのKSFM(Ca2+ 0.09 mM、1 ng / mL EGF、50 μg / mL BPE)中の12ウェルインサート(0.6 cm2あたり200,000ケラチノサイト)に400,000細胞を播種します。<ol><li>100 μL の KSFM (Ca2+ 0.09 mM、1 ng/mL EGF、50 μg/mL BPE) 中の 24 ウェルインサート (0.5 cm2 あたり 155,000 ケラチノサイト) に 150,000 個の細胞を播種します。</li>
		<li>あるいは、KSFM培地(Ca2+ 0.09 mM + 10% DMSO)で-80°Cで24時間凍結し、凍結した細胞を液体窒素に移して後で使用します。 注:凍結バイアルを使用する場合は、解凍後にもう一度継代してから、ALI培養用の細胞を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>トランズウェル培養プレートのインサートの下の下部ウェルに培地を加えます。 注:12ウェルプレートの場合:1.5 mLのKSFM(Ca2 + 0.09 mM、1 ng / mL EGF、50 μg / mL BPE)。24ウェルプレートの場合:600 μLのKSFM(Ca2+ 0.09 mM、1 ng/mL EGF、50 μg/mL BPE)。</li>
	<li>2日後に中程度から高カルシウムKSFM(Ca2+ 1.8 mM、1 ng / mL EGF、50 μg / mL BPE)を交換します。.</li>
	<li>高カルシウムKSFM培地は、7日目まで隔日で交換してください。</li>
	<li>7日目に上部チャンバーから培地を吸引し、下部チャンバー内の培地を10 ng/mL KGF(= FGF7)、75 μg/mL アスコルビン酸(AA)を含む高カルシウムKSFM(Ca2+ 1.8 mM、1 ng / mL EGF、50 μg / mL BPE)に交換して空輸を行います。<ol><li>オプション:目的のサイトカインを目的の濃度で培地に加えます。</li>
	</ol></li>
	<li>14日目まで2日おきに媒体を交換してください。</li>
</ol>5. 経上皮電気抵抗(TEER)測定
<ol><li>TEERメーターの電極を5%次亜塩素酸ナトリウムを入れた24ウェルプレートのウェルに10〜15分間浸して滅菌します。</li>
	<li>滅菌ddH2Oで電極を4つのサブシーケンシャルウェルに浸し、電極を空気乾燥させて、5%次亜塩素酸ナトリウムを洗い流します。</li>
	<li>1つの電極をウェルに、もう1つの電極をトランズウェルインサートに配置し、PBSを充填してTEERを測定して、ブランクをセットします。 注:TEER測定の推奨容量:12ウェルプレートの場合(ウェルに1900μL、インサートに900μL)。24ウェルプレート用(ウェルに750-1000μL、インサートに250μL)。</li>
	<li>ALI培養液を室温滅菌PBSと交換します。 注:培地を下のウェルから取り出し、2番目のステップでトランズウェルインサートから取り出します。同様に、最初にPBSをインサートに加え、次に下部ウェルにPBSを添加して、ALI培養物がトランズウェル膜から剥離するのを防ぎます。</li>
	<li>ALI培養物を用いた実験井戸にTEERメーター電極を配置し、TEER測定1を行います。 注意: 媒体を交換する前に、2日おきにTEER測定を実行してください。</li>
</ol>6. 高分子フラックス
<ol><li>FITC-デキストラン(3-5 kDa)ストック溶液を1 mg/mLの濃度に希釈します。 注:FITC-Dextranは常に光にさらされないように保護してください。.</li>
	<li>読み出しの標準試料として、FITC濃度を減少させる(1000 μg/mL〜0.25 μg/mL)希釈列を調製します。</li>
	<li>500 μL の FITC-デキストラン溶液 (1 mg/mL) をトランズウェルの上部チャンバーに加え、1.5 mL の培地 (+/- 目的のサイトカイン) を下部コンパートメントに加え、プレートをインキュベーターに入れます。</li>
	<li>下部コンパートメントからそれぞれの時点(0分、15分、30分、60分、90分、120分、150分、180分など)で120μLの培地を回収します。</li>
	<li>ピペットは、各タイムポイントを黒色の96ウェル透明平底プレートに複製(50 μL/ウェル)します。</li>
	<li>FITC-デキストランを490 nmで励起し、プレートリーダーを使用して520 nmの波長で発光を読み取ります。</li>
	<li>標準に従って高分子フラックスの量を計算します。</li>
</ol>

人間の食道オルガノイドおよび気液界面の培養のプロトコール

著者は何も開示していません。

提供される手順により、患者由来のオルガノイドとALI培養の培養が可能になり、成功の見込みが高いです。オルガノイドプロトコルは、ヒト食道オルガノイド26の生成を報告した最初に公開されたプロトコルから、および最近発表されたプロトコル32から適応された。Sherill氏らは、ALIモデル22について説明しました。オルガノイドとALI培養モデルは、EoE 5,26などの食道疾患の状況におけるサイトカインやその他のメディエーターが食道上皮バリアに及ぼす影響を研究する際に互いに助け合います。
オルガノイドプロトコールの利点の1つは、培養プロセスと細胞培養培地の組成がシンプルであることです。他のASCおよびPSCベースのプロトコルとは異なり、主に複数の高価なサプリメントおよび成長因子24,25,27,28,33の追加を必要とするが、KSFM培地は比較的安価である。ヒト組換え上皮成長因子(hEGF)とウシ下垂体抽出物(BPE)の添加のみが必要です。KSFMは、ケラチノサイト培養に最適化されたベース培地であり、線維芽細胞フィーダー層34の必要性を排除する。オルガノイド培養に使用するKSFM-C培地を得るためには、CaCl2を用いてKSFMのCa2+濃度を0.09 mMから0.6 mMに滴定する必要があります。ALI培養には、オルガノイドモデルよりも高い1.8 mMのCa2+濃度が必要です。高いCa2+濃度は、ケラチノサイトの分化を開始するために不可欠であり、その後、食道オルガノイド26,34,35内に存在する多層扁平上皮の典型的なタマネギ様構成の形成とALI培養における上皮の成層化を促進する22。
ケラチノサイトの早期分化、オルガノイド、およびALI培養の生成を防ぐには、細胞単離中の高濃度Ca2+を避ける必要があります。早期分化はコロニー形成を減少させ、オルガノイドの自己組織化形成と、ALI培養の基礎としての未分化ケラチノサイトのコンフルエント単層の形成を妨げます。細胞単離中にトリプシンの酵素活性を停止するために血清含有培地を使用すると、細胞単離中にCa2+が濃縮された培地を使用するのと同様に、早期分化を引き起こすことによりオルガノイド生成の成功が損なわれる36。代わりに、大豆トリプシン阻害剤または他の無血清トリプシン阻害剤は、トリプシンによる生検消化後の酵素反応を停止するために推奨されます。培養液には、培養の最初の2日間にRho-キナーゼ(ROCK)阻害剤Y27632を添加して、コロニー形成率を高めます。ROCKの阻害は、抗アポトーシス効果を有し、ケラチノサイトの老化を防ぎ、したがってオルガノイド形成率を改善する37,38。
40 μLのBME液滴に約20,000個の細胞を播種することは、活発なオルガノイド培養とALI培養用の150,000〜400,000個の細胞を確保するための推奨です。適切な細胞播種数があれば、その後のトランスクリプトミクス、プロテオミクス、および組織学に十分な材料が保証されます。ヒト食道上皮細胞株EPC2-hTERTなどの細胞株を利用する場合、この細胞株26が示すオルガノイド形成速度の増加により、播種細胞数を減少させることができる。この現象は、生検由来の初代細胞と比較して、細胞株が示す均質性と優れた細胞周期の同期性に起因すると思われます。不死化したEPC2-hTERT細胞株は、その増殖能力も保持し、オルガノイドの無限の継代を可能にします。
逆に、食道生検に由来するヒトオルガノイドは、長期培養では維持できない26,28。完全に発達した食道オルガノイド内の分裂可能な生存細胞の減少と、継代ごとにオルガノイド形成の速度が減少していること26は、初代細胞由来オルガノイドにおける増殖能の喪失が、前駆細胞の末端分化と角質化によるものであることを示している。培養培地にNoggin、Wnt3a、またはA83-01を補充することによって増殖能力を維持しようとする以前の試みは失敗に終わった26,28,32。したがって、患者由来の食道オルガノイドの長期的なバイオバンキングは、将来の研究で対処しなければならない課題として残っています。
オルガノイド培養の出現は、EoE 5,39,40,41,42における上皮変化に関与する主要な炎症メディエーターと環境因子の発見を大いに可能にした新たな実験的可能性をもたらしました。それにもかかわらず、ASCおよびPSC由来の食道オルガノイドは、食道のすべての細胞コンパートメントを完全に再現するわけではないため、制限があることに注意することが重要です。ASC由来オルガノイドは上皮コンパートメント24,26,27,33を再現し、PSC由来オルガノイドは上皮、内皮、および間葉系コンパートメント28,43,44を再現する。しかし、現在のオルガノイドモデルはすべて免疫学的微小環境を欠いています。最近の研究では、ヒト食道オルガノイドとALI培養物をIL-20サイトカインファミリーのサイトカインで刺激し、EoE5における上皮バリア機能障害の新たな側面を解読しました。両方の3次元培養モデルの組み合わせにより、上皮バリア完全性の間接的および直接的な測定値が評価されました。さらに多くの論文が、食道オルガノイドとALI培養物を組み合わせて使用し、定義されたサイトカインが上皮に及ぼす影響を解明する可能性が高いでしょう。このアプローチは、免疫系と上皮との間のクロストークの複雑さを軽減し、上皮上の特定のメディエーターの機能を明らかにする一方で、他の多くの潜在的に関与する要因を無視します。オルガノイドとOrgan-on-a-chip技術を組み合わせることで、この制限に対する解決策が得られる可能性があります。マイクロ流体工学に基づくOrgan-on-a-chip技術は、管状臓器の管腔および基底外側の微小環境を再現することができ、免疫細胞やその他の循環器および管腔成分の流入および排出を可能にします。これにより、恒常性と疾患における上皮と免疫細胞との間の相互作用の調査が可能になります45,46。Organ-on-a-chipプラットフォーム上で、無傷の上皮バリアおよび機能的な経上皮イオン輸送を示す生理学的に分極された腎尿細管オルガノイドの培養が成功した47は、患者由来のオルガノイド・オン・チップ技術の利用拡大を支持する。さらに、オルガノイド・オン・チップ技術の利用の別の進歩は、管状オルガノイドの頂端側のマイクロ流体チャネルを介して管腔流を実施し、上皮細胞の脱落を排除することにより、初代細胞に由来するオルガノイドの拡張培養を通じて実証されている46。このような進歩は、この技術がin vivo環境をin vitroで再現する可能性を浮き彫りにしています。
上皮コンパートメントからほとんどの細胞タイプでほぼ完全なミニ臓器まで、あらゆるものに似た3Dオルガノイドを培養する能力は、臨床応用の可能性を促しています5,26,46。近年、大きな進歩が見られましたが、オルガノイドを臨床現場で使用できるようになるには、さらなる障害を克服する必要があります。オルガノイドの臨床実装における大きなハードルは、培地と足場ECM製品中の動物由来タンパク質の存在です。ケラチノサイト培養用の動物性タンパク質フリー培地はすでに利用可能であり、BPEフリーのKSFMバリアントが最近登場していますが、従来のECM製品と同様の特性と培養結果を持つ動物性タンパク質フリーECM代替品を製造することはより困難であるように思われます。最近、潜在的に有望な完全に化学的に合成された代替品が報告されています48。それにもかかわらず、現在、市販の動物由来のECM製品はありません。
食道オルガノイドとALI培養は、EoEを研究するための重要な装置です。ここで提供されたプロトコルによるオルガノイドとALI培養の培養は、好酸球性食道炎5,26,39,41,42,49,50における上皮コンパートメントの関与に関する新たな発見の基礎として機能しました。これらのプロトコルの簡単な実装と三次元細胞培養技術の継続的な進歩により、in vivo環境への実験的近似が容易になり、発見の翻訳性が向上し、動物実験が徐々に減少する可能性があります。

食道の炎症は、Th2優位の食道の慢性炎症性疾患である好酸球性食道炎(EoE)で観察されるように、上皮バリアの完全性1,2,3,4,5を損なう6。EoEは1990年代に初めて報告され7,8、主に食物抗原9,10,11,12,13によって誘導されます。成人集団で最も頻繁に発生するEoEの症状は、嚥下障害と食物宿便です14。小児では、EoEは通常、成長の失敗、食物拒否、嘔吐、および腹痛を伴って現れます15。ゲノムワイド関連解析(GWAS)により、上皮バリアの完全性に関与するEoEリスク遺伝子が特定され、上皮がEoE研究の焦点となっている16,17,18。さらに、EoEトランスクリプトミクスは、分化過程の障害と反応性基底帯過形成が食道上皮のバリア機能の低下を引き起こすことを明らかにしました3,5,19,20,21,22。EoEがTh2媒介性疾患であるという初期の理解6は、上皮の完全性を乱すことによる駆動メディエーターとしてのIL-13の発見につながった3,4,21,23。遺伝的素因を通じて、内因性バリア障害から上皮の完全性に対するサイトカイン媒介性の影響を解剖できる実験システムは、EoEにおける免疫細胞と上皮との間の複雑な相互作用を研究する可能性を提供します。ヒト食道オルガノイドと気液界面(ALI)培養物は、サイトカイン刺激が上皮完全性に及ぼす影響を分析するための貴重なツールとして提案されています5。
成体組織特異的幹細胞(ASC)由来の食道オルガノイドを作製するための最初のプロトコルは、2009年に腸オルガノイドの最初の発表報告から5年後に確立され、腸内Lgr5+ ASCを使用して小腸の上皮コンパートメントを再現した24。DeWardらは、マウスの食道上皮細胞からオルガノイドを作製する先駆者となった25。2018年、笠木らは、不死化ヒト食道扁平上皮細胞株EPC2-hTERTおよび初代患者由来細胞からヒト食道オルガノイドを作製した26。同年、Zhangらは人工多能性幹細胞(iPSC)由来の食道オルガノイドの作製に成功しました。彼らは、食道前駆細胞(EPC)の発生に対するTGFβおよび骨形態形成タンパク質(BMP)阻害の重要性と、層状扁平上皮の分化におけるNotchシグナル伝達の重要な役割を描写しました26,27。Trisnoらは、Sox2を、発生の運命を食道分化に導くWnt阻害剤として同定することで、これらの知見を補完した28。その後のプロトコル、培地組成、および培養条件の改良により、オルガノイドの形成速度が増加し、凍結保存後のオルガノイドの継代および回収が可能になりました26,29,30,31,32。これらのオルガノイドは、サイトカインによる刺激後の組織構造と潜在的な標的遺伝子の発現を研究するための強力なツールですが、食道オルガノイドは、バリア完全性の直接的な尺度として経上皮耐性(TEER)または高分子フラックスを測定する可能性を提供しません。Sherrillら22が以前に述べたように、上皮分化をモデル化するALI培養4は、上皮の完全性を直接評価することを可能にする。患者由来オルガノイドとALI培養物を組み合わせることは、EoEにおける組織構造と上皮バリアの完全性を研究するための強力なツールです。
ここでは、食道生検から生存細胞を単離し、サイトカインがバリアインテグリティに及ぼす影響をさらに研究するために使用できる食道オルガノイドおよびALI培養を確立するための手順を示します。

<table><tbody><tr><td>1250 &マイクロ;Lグリップチップ - フィルター</td><td>インテグラ</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>300 & マイクロ;L グリップチップ - フィルター</td><td>インテグラ</td><td>4435</td><td></td></tr><tr><td>70 & マイクロ;M細胞ストレーナー</td><td>Sarstedt</td><td>83.3945.070</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>ウシ下垂体抽出物</td><td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td><td>3700015</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養マルチウェルプレート CELLSTAR 懸濁培養用</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.657 185</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 基底膜抽出物(BME)、タイプ2、パスクリア</td><td>R&D Systems (Bio-Techne)</td><td>3532-010-02</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td><td>Carl Roth</td><td>A994</td><td></td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&nbsp;(DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EVE Automated Cell Counter</td><td>NanoEntek</td><td>EVE-MC</td><td></td></tr><tr><td>EVE 細胞計数スライド</td><td>NanoEntek</td><td>EVS-050</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナー付き スナップキャップ</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>フルオレシンイソチオシアネート (FITC)-デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>FD4</td><td>平均分子重量3000-5000</td></tr><tr><td>ヘレウス - メガフージ&nbsp; 40R&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75004518</td><td></td></tr><tr><td>ヒト組換え上皮成長因子</td><td>Gibco(サーモフィッシャーサイエンティフィック)</td><td>3700015</td><td></td></tr><tr><td>ケラチノサイト-SFM</td><td>Gibco(サーモフィッシャーサイエンティフィック)</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco(サーモフィッシャーサイエンティフィック)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトKGF/FGF-7タンパク質</td><td>R&D Systems (Bio-Techne)</td><td>251-KG-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ、15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネル EVOLVE 100-1000 &micro;L&nbsp;</td><td>インテグラ</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネルEVOLVE 20-200 & マイクロ;L&nbsp;</td><td>Integra</td><td>3016</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 1 mL</td><td></td><td>1134950</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Glycine max からのトリプシン阻害剤 (大豆)</td> <td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>SAFC Biosciences (Merck)</td> <td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 二塩酸塩</td><td>Tocris (Bio-Techne)</td> <td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

好酸球性食道炎における上皮バリアを調べるための三次元細胞培養モデル 

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

食道の扁平上皮は環境に直接さらされ、食物抗原や微生物などの外来抗原に絶えず直面しています。上皮バリアの完全性を維持することは、感染を予防し、無害な食品由来抗原によって引き起こされる炎症を避けるために重要です。この記事では、患者の生検からヒト食道オルガノイドおよび気液界面培養物を生成するための簡略化されたプロトコルを提供し、組織の恒常性と疾患の文脈で食道の上皮コンパートメントを研究します。これらのプロトコルは、過去10年間で重要な科学的マイルストーンであり、患者由来の初代細胞、オルガノイド、および気液界面培養からの3次元臓器様構造を記述しています。彼らは、ドナーの表現型および遺伝的特性を維持しながら、食道上皮における特定のサイトカイン、成長因子、およびシグナル伝達経路の機能を三次元フレームワーク内で調査する可能性を提供します。オルガノイドは、サイトカイン刺激後のトランスクリプトームとプロテオームを評価することにより、組織の微細構造に関する情報を提供します。対照的に、気液界面培養では、経上皮抵抗性(TEER)または高分子フラックス測定を通じて上皮バリアの完全性を評価できます。これらのオルガノイドと気液界面培養を組み合わせることで、食道上皮バリア障害疾患の研究を進めるための強力なツールとなります。

食道オルガノイドは、倒立明視野顕微鏡で文書化されたように、提供されたプロトコルの指示に従って、患者の生検から抽出された初代細胞から増殖します(図1)。上皮ASCは、単離された細胞を基底膜抽出物に播種した後、培養の最初の2日以内に自己組織化的に細胞クラスターを形成し始め、足場として機能します。細胞クラスターのサイズと数は、倒立明視野顕微鏡で顕著に見えますが、最初の1週間以内に連続的に増加します(図2)。しかし、この時点では、細胞クラスターは、ASC由来の食道オルガノイドの多層扁平上皮に特徴的なタマネギ様構造を欠いています。培養の9日目に、タマネギのような多層構造とオルガノイドの中心で成長している角質化したコアが明らかになります(図2A)。オルガノイド培養は最大21日間持続できます26。しかし、オルガノイドは11日目から14日目の間に完全に成熟し、最大サイズに達することが実証されています。11日目から、培養プロセスは主に角質化を進行させ、代謝活性のある生存細胞を減少させることを特徴とする5,26。したがって、実験のためにオルガノイドを回収する最適な時間は、目的の分化段階によって異なり、5日から11日の間になります。
オルガノイドの成長が止まる前に、ケラチンコアの増加により生細胞の数が減少するため、最大3回の継代が可能です。オルガノイドは、遺伝子/タンパク質発現の分析や組織学およびバイオバンキングのために、必要な日にRNAまたはタンパク質を単離するために回収することができます。
ALIとオルガノイド培養の初期細胞単離ステップは同じです。ALI培養を確立する前に、オルガノイドプロトコルとは対照的に、新たに単離された初代細胞を増殖させる必要があります。2回目の継代後、初代ケラチノサイトをトランズウェルインサートに播種し、カルシウム濃度の低い培地で培養することで、単層形成を誘導し、単離された初代ケラチノサイトの早期分化を防ぎます。48時間後、コンフルエント単層が形成されると、培地のカルシウム濃度は1.8 mMに上昇し、上皮層の分化と層別化が誘導されます。7日後、空輸は多層上皮の頂端側を空気にさらして角質化を引き起こします。ALI培養物は通常、最大14日間維持できます(図2B)。TEER測定と高分子フラックス実験により、上皮の機能を監視します。ここでは、初代食道ケラチノサイトからのALI培養、各ウェルの底にNIH/3T3線維芽細胞供給層を持つ初代ケラチノサイトALI培養、および各インサートにNIH/3T3線維芽細胞供給層を持つ初代ケラチノサイトALI培養物でTEER測定を行いました(図2C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66503/66503fig01.jpg"> 図1:患者由来の食道オルガノイド培養のプロセス。 患者由来の食道オルガノイドのサンプル収集手順、細胞単離、オルガノイド培養、および潜在的な実験的応用を示す図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66503/66503fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66503/66503fig02.jpg"> 図2:患者由来の食道オルガノイドの形成と分化。 (A)患者の生検由来の初代細胞から培養した食道オルガノイドの代表的な明視野像。(B)14日目に生検由来の初代細胞から培養した食道ALI培養物の代表的な明視野画像。スケールバー:50μM。(C)初代食道ケラチノサイトからの気液界面(ALI)培養、各ウェルの底にNIH/3T3線維芽細胞供給層を持つ初代ケラチノサイトから培養したALIおよびケラチノサイト層の下の各インサートにNIH/3T3線維芽細胞供給層を持つ初代ケラチノサイトから培養したALIにおける、指示日における経上皮電気抵抗(TEER)測定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66503/66503fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">中程度</td>
			<td>KSFMの</td>
			<td>KSFM-Cの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ベースミディアム</td>
			<td>ケラチノサイト-SFM</td>
			<td>ケラチノサイト-SFM</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">サプリメント</td>
			<td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>ウシ下垂体抽出物(BPE)</td>
			<td>50 μg/mL</td>
			<td>50 μg/mL</td>
		</tr><tr><td>上皮成長因子(EGF)</td>
			<td>1 ng/mL</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2)</td>
			<td>0.09 mM</td>
			<td>0.6 mM</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (ROCK阻害剤)</td>
			<td>-</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr></tbody></table>表1:初代細胞由来食道オルガノイド培地。 ヒト食道オルガノイドを培養するための培地成分のリスト。SFM:無血清培地。

ここでは、ヒト食道オルガノイドの培養と気液界面培養のプロトコールを提供します。食道オルガノイドの気液界面培養は、サイトカインが食道上皮バリアに及ぼす影響を研究するために使用できます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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