Name: プレートリーダーを用いたカルシウム動員アッセイによるプロテアーゼ活性化受容体のモジュレーターの特性評価(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぶプレートリーダーを用いたカルシウム動員アッセイによるPARモジュレーター評価法。内皮細胞を使用し、炎症抑制薬候補パルマモドリンのスクリーニングと作用機序解析に応用可能です。

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<meta charset="utf8"></head><body>内皮細胞におけるプロテアーゼ活性化受容体リガンドの研究

<table><tbody><tr><td>細胞培養試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>接着性EA.hy926細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper細胞解離試薬</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>トリプシンはオプションで使用することができますが、PAR2アッセイでは絶対に避けるべきです。</td></tr><tr><td>Dulbeccoの変更されたイーグル媒体(DMEM)w/フェノールレッド</td><td>コーニング</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>の胎児のウシの血清(FBS)</td><td>アバントール</td><td>97068-091</td><td></td></tr><tr><td>ブタの皮からのゼラチン</td><td>MilliporeSigma</td><td>G2500</td><td>脱イオン水と水0.4%(w / v)の溶液を作るために使用します。滅菌するために使用前にオートクレーブ。</td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0.4% w/v)</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Calcium Mobilization Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Thermo</td><td>172571000</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Avantor</td><td>97061-420</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Thermo</td><td>42352-0250</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Thermo</td><td>J66650-AD</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>ハンク平衡塩溶液(Ca/Mg/フェノールレッドフリー)</td><td>コーニング</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>プルロニックF-127(ポロキサマー407)</td><td>スペクトラムケミカル</td><td>P1166</td><td></td></tr><tr><td>プロベネシド</td><td>TCIアメリカ</td><td>P1975</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>VWRインターナショナル</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>TFLLRN-NH<サブ>2</サブ>(TFA塩)</td><td></td><td></td><td>Versiti血液でTrudy Holystによって調製Research Institute</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well培養処理、黒壁、透明底アッセイプレート</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>透明蓋付き</td></tr><tr><td>遠心チューブ、15 mL</td><td>Avantor</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ、50 mL</td><td>Avantor</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ、T-75</td><td>Corning</td><td>353136</td><td>組織培養処理</td></tr>済み <tr><td>使い捨て試薬リザーバー、50 mL</td><td>コーニング</td><td>RES-V-50-S</td><td></td></tr><tr><td>エンスパイアプレートリーダー</td><td>パーキン・エルマー</td><td></td><td>製造中止</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ、1.5 mL</td><td>アバンター</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット、9インチ</td><td>フィッシャー</td><td>13-678-6B</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>PCRチューブストリップは、独立したフラットで滅菌する必要がありますキャップストリップ</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペットチップ、20&micro;L</td><td>Biotix</td><td>63300042</td><td>滅菌済み、ろ過済みチップ</td></tr><tr><td>ピペットチップ、200 & マイクロ;L</td><td>Biotix</td><td>63300044</td><td>滅菌済み、ろ過済みチップ</td></tr><tr><td>ピペットチップ、1250 &micro;L</td><td>Biotix</td><td>63300047</td><td>滅菌済み、ろ過されたチップ</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>volume 6 used</td></tr><tr><td>Serological pipette, 5 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp;07-5005</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット 10 mL</td><td>トレードウィンズ ダイレクト</td><td>&nbsp;07-5010</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット 25 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp;07-5025</td><td></td></tr></tbody></table>

プレートリーダーを用いたカルシウム動員アッセイによるプロテアーゼ活性化受容体のモジュレーターの特性評価(英語)

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

このアッセイの目的は、一般に、3〜4個の新しいパルモジュリンの濃度反応曲線(CRC)を作成することです。各アッセイプレートでは、既知の化合物、例えばNRD-21に対する追加のCRCがしばしば生成され、既知のIC50により実験の品質チェックとして機能します。CRCを生成するには、 表1 に示されているようなプレートマップを計画する必要があります。代わりにシングルポイント濃度レスポンスが必要な場合は、10 μMの最終濃度(または他の好ましい濃度)の化合物を少なくとも3つのウェルに添加する必要があります。
アッセイを実施する際には、プレートリーダーに表示される蛍光が急速に増加する必要があります(増加は最初の3〜4回のスキャンで開始されます)必要があります(図2Bの失敗した出力と比較した出力例については、図2Aを参照してください)。アゴニストは、プレートリーダーが蛍光の増加を正確に捕捉できるようにするために、迅速に(15秒以内に)追加する必要があることに注意することが重要です。実際の実験では、ビヒクルウェルの蛍光シグナルは平坦なままであるべきですが、ポジティブコントロールウェル(ビヒクル + 6.5 μM TFLLRN-NH2)の蛍光シグナルは、3 回または 4 回のスキャン後に増加し始めるはずです。最大値に達すると(~10回のスキャン後)、蛍光シグナルはゆっくりと減少し始めるはずです。非常に効果的なアンタゴニストを用いた実験では、アンタゴニストの濃度が最も高いウェルは、ネガティブコントロールと同様に、比較的平坦なシグナルを持つ必要があります。また、ポジティブコントロールウェルのシグナルとアンタゴニストの濃度が低いウェルのシグナルとの間には、ほとんど差がないはずです(図2C)。最も低い濃度の ?? 抗薬がまだカルシウム動員を阻害している場合は、スクリーニングされた濃度を調整して低濃度を含める必要があります。.生成された CRC は、曲線のシグモイドの性質を完全に示すために、少なくとも 1 つのデータ ポイントを ~100% 持つ必要があります。
実験がうまくいかなかった最も一般的な兆候は、ポジティブコントロールウェル(ビヒクル + 6.5 μM TFLLRN-NH2)で蛍光の大幅な増加が見られない場合です(図 2B)。これには、細胞数が少ない(コンフルエント性が確認されていない場合)、アゴニスト溶液が損なわれている、細胞に取り込まれた色素の量が不十分であるなど、さまざまな理由が考えられます。また、誤って特定のウェルにアゴニストを添加しないことも可能です。
プログラム方式では、データは 6 つの別々のスプレッドシートとして出力され、それぞれに 2 つの列のデータが含まれます。基礎蛍光の5回のスキャンはそれぞれの行にあり、すぐ下の行にアゴニストを添加した後に取得された20回のスキャンがあります(代表的な出力については 図3 を参照)。計算の例として、NRD-21を使用した実験の列を使用します。エクスポートされたファイル(図3)では、各ウェルからの基礎蛍光が列CからGに出力され、アゴニスト添加後(次の20スキャン)のデータが次の行の列CからVに出力されます。ファイルの行 14 から 17 には、2 つの別々の列のポジティブ コントロールが含まれています。ポジティブコントロールウェルの1つの基底列の平均は、コマンド「=AVERAGE(C16:G16)」を使用して計算され、1,039.8の値が得られました。このコマンドは、各ウェルの追加の基礎測定に対して繰り返されました。実験スキャンの最大値は、コマンド「=MAX(C16:V16)」を使用して計算され、値は2,629でした。ここでも、すべての井戸に対してコマンドが繰り返されました。次に、各ウェルの基礎蛍光を最大値から差し引きました。この実験では、各ウェルのネガティブコントロールの蛍光の変化を差し引くことでデータを正規化しました(例の列では142.6)。次に、これらの値を、同様に計算されたポジティブコントロールの値で除算しました。この列では、最大値は 2,629、平均基礎測定値は 1,039.8、ブランクから減算された値は 142.6 でした。したがって、調整された正の制御値は 1,446.6 です (式から計算)。この式をカラム内の各ウェルで繰り返し、計算値を1,446.6で割って、蛍光の相対的な変化を求めます。その後、比率はパーセンテージに変換され、分析ソフトウェアにコピーされました。このプロセスは、他の 11 列に対しても繰り返されました。
参照されたソフトウェアを使用してデータを処理するには、XYテーブルを選択し、列を並べて3回繰り返し測定するオプションを選択する必要があります。各濃度の -log 値を x 値に入力し、計算されたパーセンテージを y 値に追加する必要があります。データに対して非線形回帰分析を実行すると、4つの濃度-応答曲線が生成されます。このプログラムは、IC50 値、定量化されたエラー統計、および適合度統計も出力します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig01.jpg"> 図1:EA.hy926セルにロードされたFluo-4 / AM。 Fluo-4は、色素のインキュベーションおよび洗浄ステップ後にEA.hy926細胞に選択的にロードしました。すべての蛍光は細胞内にあり、色素の漏れはありません。EVOSセルイメージャのGTP設定と20倍の倍率を使用して取得した画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig02.jpg"> 図2:アッセイの潜在的な出力 (A)作業用アッセイの代表的なプレートリーダーの出力。行Aはネガティブコントロールであり、蛍光に変化はありません。行Bはポジティブコントロールであり、蛍光の急速な増加を示しています。行C-Hは実験用ウェルで、高濃度のパルモジュリンはプレートの下位にあります。(B)失敗した実験の出力例。陽性対照であるB列では蛍光の増加は見られません。(C)PAR1アゴニストTFLLRN-NH2によって誘発される蛍光の経時変化。付属の設定を使用して 96 ウェルプレートの 2 カラムをスキャンするには、PerkinElmer EnSpire プレートリーダーで ~5 分かかります (つまり、各ウェルのスキャン間には ~15 秒かかります)。NRD-21溶液は示されている通りで、「アゴニスト」は6.5μM TFLLRN-NH2、n = 1です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig03.jpg"> 図3:作業アッセイのExcel出力例。 基礎蛍光は、行10から偶数番号の行に出力され、アゴニスト添加後の最初の10回のスキャンの結果は、後続の奇数番号の行に出力されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig04.jpg"> 図4:ロボットによる液体処理と「フリック 」の比較アッセイプレートをゼラチンでプレコーティングし、プレートをフリックしてブロッティング乾燥させることにより、手動で培地交換を行うと、ばらつきの少ない濃度反応曲線が得られます。(A)パルモジュリンML161およびNRD-21および5μM TFLLRN-NH2、n = 3(自動液体処理)の濃度-反応曲線。(B)パルモジュリンML161およびNRD-21および5μM TFLLRN-NH2、n = 3(ゼラチンコーティング、フリックプレート)の濃度反応曲線。データはSEM±平均です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig05.jpg"> 図5:温度スタディ。 37°Cでアッセイを実行すると、室温よりも再現性の高いデータが得られます。(A)ML161および5 μM TFLLRN-NH2、n = 3(室温)の濃度-反応曲線。(B)ML161および5μM TFLLRN-NH2、n = 3(37°C)の濃度-応答曲線。データはSEM±平均です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig06.jpg"> 図6:細胞密度の研究。 最適な細胞密度は、アッセイ開始の16〜24時間前に播種した場合、60,000細胞/ウェルです。(A)異なる細胞密度でのTFLLRN-NH2 の濃度-反応曲線、n = 3。(B)最適細胞密度60,000細胞/ウェルでのTFLLRN-NH2 の濃度-応答曲線。データはSEM±平均です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig07.jpg"> 図7:アッセイ量。 (A) ML161 および 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (200 μL 最終容量) の濃度反応曲線は、100 μL のアッセイ容量を使用します。(B)ML161および5 μM TFLLRN-NH2、n = 3(100 μL最終容量)の濃度-反応曲線。データはSEM±平均です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig08.jpg"> 図8:ヒット化合物を検出するアッセイの能力を決定するためのZ'因子の生成。 6.5 μM TFLLRN-NH2 (カラム B) とオプションの PAR1 アンタゴニスト 10 μM NRD-21 (カラム C) または 0.316 μM vorapaxar (カラム D) によるカルシウム動員反応。(A)アッセイは細胞播種後16時間で完了しました。(B)細胞播種後24時間でアッセイを完了。(C)次の式を使用して計算されたZ'係数の表: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66507/66507eq01v5.jpg" style="margin: auto;">、ここで、σp はポジティブコントロールの標準偏差、σ n はネガティブコントロールまたはサンプルの標準偏差、μp はポジティブコントロールの平均、μn はネガティブコントロールまたはサンプルの平均です。各値は、車両 + 6.5 μM TFLLRN-NH2 をポジティブ コントロールとして指定し、示された条件をネガティブ コントロール (ビヒクル) またはサンプル (NRD-21 および vorapaxar) として比較することによって計算されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig09.jpg"> 図9:PAR2アゴニストによるカルシウム動員。 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4によって誘発される蛍光の経時変化。データはSEM±平均です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:化合物スクリーニング用の96ウェルプレートマップの例。 各濃度は3倍で測定されます。行 A にはネガティブ コントロール (拮抗薬なし、アゴニストなし) が含まれ、行 B にはポジティブ コントロール (アンタゴニストなし、アゴニスト) が含まれます。カラム 1 から 3 には、オプションで品質管理に使用できるパルモジュリン NRD-21 の 6 つのハーフログ濃度が含まれています。PM-A、PM-B、PM-Cは無名のパルモジュリンです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:以前に公開されたプロトコルと新しく最適化されたプロトコルの比較。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

characterizing-modulators-protease-activated-receptors-with-calcium

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Biochemistry

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