Name: 糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶ 糖鎖-タンパク質相互作用のNMR解析法。飽和転移差分法と化学シフト変動解析を用いて、結合エピトープと分子認識機構を解明する構造糖鎖生物学の手法を習得できます。

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私たちは、MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033が資金提供するSevero Ochoa Center of Excellence Accreditation CEX2021-001136-S、およびInstituto de Salud Carlos III(ISCIII、マドリッド、スペイン)のイニシアチブであるCIBERESについて、スペインのAgencia Estatal de Investigaciónに感謝します。また、欧州委員会にはGLYCOTWININGプロジェクトに感謝します。

糖鎖-タンパク質相互作用解析のための高度なNMR技術

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</ol>

著者は何も開示していません。

飽和移動差NMR(STD-NMR)は、リガンド-タンパク質相互作用の研究に最も使用され、汎用性の高いNMR法となっています。上記のように、飽和移動現象に依存しており、実験装置には、オン共鳴スペクトルとオフ共鳴スペクトルの2つの1次元(1D)1Hスペクトルの取得が含まれます。共鳴時実験では、タンパク質の特定のプロトンの飽和は、一定期間(飽和時間は通常1〜3秒の範囲)に一連の低電力無線周波数パルスを適用することによって達成されます。リガンドの直接的な飽和を避けるために、飽和パルスの周波数と長さは、タンパク質の特定のプロトンを選択的に照射するために最適化されています。つまり、リガンドシグナルが空いている周波数で、適切な長さで適用する必要があります(図1)。50 msの飽和パルスについては、概則として、飽和領域から最も近いリガンド信号まで1ppmの差を保つ必要があります。一般に、タンパク質の脂肪族領域に印加される選択的飽和パルスは、飽和効果を増加させます。あるいは、配位子分子が芳香族シグナルを含まない場合、芳香族プロトン(6〜7ppm)も照射することができます。これは、芳香族基を持たない天然に存在する糖鎖に非常に有用です。タンパク質の特定の領域に選択的に照射すると、飽和度は双極子1 H-1H交差緩和(スピン拡散)を介してタンパク質に沿って伝播します。最終的に、飽和は結合部位のタンパク質プロトンに到達し、その後、分子間1H-1H NOEを介して受容体と密接に接触している(r < 5 Å)糖プロトンに移動します。明らかに、飽和配位子プロトンのシグナルの強度は減少します。飽和を受けた後、結合速度論により、一過性に結合した配位子(迅速な交換が必要)が解離し、飽和情報が遊離状態で蓄積されます。このプロセスにより、NMRのオン共鳴スペクトルは減少したシグナルを示します(図2)。
結合型糖鎖の 1H核のこの強度摂動を明確に示すために、同じ条件下で、受容体または炭水化物シグナルから遠く離れた場所(通常は40〜100ppm)で飽和を適用する制御プロトンNMRスペクトル(オフ共鳴)を取得します。オフ共鳴とオン共鳴の間の減算された1Dスペクトルは、強度が変更されたリガンドの 1H核の信号、つまり磁化を受け取るために受容体結合部位に十分近かったシグナルのみを示しています(図2)。
それにもかかわらず、結合した炭水化物のすべての1H核が同じ量の飽和を受けるわけではありません。理論的には、受容体から結合したリガンドへの磁化移動は距離に依存します(1/r6)。つまり、糖鎖1H核間の移動飽和強度には、リガンドのプロトンと受容体のプロトンとの間の空間的近接に関する情報が含まれており、STD NMRの強度は、受容体に近いプロトンほど大きくなります。したがって、STD NMR実験では、タンパク質表面に近い位置にあるリガンドのプロトンは、結合に直接関与していないものよりも高い強度を示すため、炭水化物の結合エピトープを決定することもできます(図2および図3)。
この実験は、親和性が弱い-中程度のシステムに適用でき、低いμMまたはnMの範囲に強い親和性を持つシステムに適用することはめったにありません。実際、緩和時間スケールでは解離率が速くなければなりません。そうしないと、リガンドが解離する前に、飽和移動情報が緩和によって失われます。
一方、タンパク質を用いたNMR実験は、原子分解能の構造を解くことなく、リガンド-タンパク質相互作用をアミノ酸レベルの精度で解明できるユニークな手法です。溶液中の分子認識現象を直接調べ、共結晶化の必要はありません。CSP解析マッピングは、リガンドの発見やタンパク質結合部位のマッピングに非常に強力です(図4 および 図5)。この方法は、化学シフト時間スケール21において交換レートが遅いシステムであっても、mM範囲とnM範囲との間の任意の範囲の親和性に適用可能である。
それにもかかわらず、このアプローチは、緩和の問題のために、分子量が30〜40 kDaを超えるタンパク質ではおそらく機能しません。その後、TROSYの代替品18 を使用でき、タンパク質の重水素化と組み合わせると特に強力になります。さらに、タンパク質は 15Nで均一に標識する必要があります(また、必要な骨格の割り当てを完了するために、別のサンプルを 13Cと 15Nで二重標識する必要があります)。したがって、対応する発現系を含むタンパク質発現条件は、ミリグラム量のタンパク質を取得できるように最適化する必要があります。また、オリゴマー化や凝集の傾向を示すタンパク質も、この分析には適していません。ここでNMRデータを記録するために使用する装置は、TCIクライオプローブを搭載したBruker 800 MHz分光計です。この方法論を600MHz未満の機器を使用して、または極低温プローブなしで使用するのは非常に困難です。

糖鎖の分子認識は、健康や疾患に関連する多くのプロセスに不可欠です。生体受容体(レクチン、抗体、酵素)の糖鎖に対する特異性と選択性は、エンタルピーの多様な成分(CH-πとファンデルワールス、水素結合、静電)とエントロピー(疎水性、ダイナミクス、溶媒和-脱溶媒和)1の間の不安定なバランスの調整に大きく依存します。
糖鎖の大きな化学的多様性とダイナミックな性質を考えると、NMR法は25年以上にわたって糖鎖相互作用の解剖に広く採用されてきました2。これらの方法論は、他の方法論では必要な相互作用の証拠を取得できない場合でも、原子分解能3,4で正確な詳細で分子認識イベントに関する優れた情報を提供します。重要な点として、NMRは汎用性が高く、原子レベルでのさまざまな時間スケールでの動的事象を研究することができるため、溶液中の糖鎖の構造、立体構造、ダイナミクスを研究するための最良の手法を構成しています。それにもかかわらず、この情報を解きほぐすことは、慎重なデータ分析5とともに明確に定義された戦略の採用を必要とするかなり複雑なプロセスである可能性があります。
NMRの手法は多様であり、実際、糖鎖-タンパク質相互作用を解明するために使用できる方法論は数多くあります6。ここでは、糖鎖-受容体相互作用7,8を解読するために現在採用されている2つの基本的なNMRアプローチについて述べるが、その中で、主要な糖鎖エピトープとタンパク質結合部位9の提示を解きほぐす方法に重点を置いている。
どのような分子認識イベントにおいても、受容体が所与のリガンドに結合すると、結合10の参加者の多くのNMRパラメータに影響を与える化学交換プロセスが存在する。したがって、NMRの観点からは、相互作用は糖鎖リガンドの観点からも、タンパク質受容体の観点からもモニターすることができる11。一般的に言えば、タンパク質受容体は大きな生体分子であり(回転運動が遅く、速度がnsの時間スケールで、したがって横方向の緩和が速い)、相互作用する糖鎖は中小の分子(回転運動が速く、ps時間スケールの速度で、横方向の緩和が遅い)と見なすことができる12。標準的な観点から見ると、糖鎖のNMRシグナルは狭く、受容体のNMRシグナルは広い13。
リガンドベースのNMR法は、多くの糖鎖NMRパラメータが遊離状態から結合状態に移行するときに経験する劇的な変化に依存しています14。STD-NMRは、溶液状態における結合の存在の推定から糖鎖結合エピトープの決定まで、多様な糖鎖結合特性を評価するために最も採用されている実験的NMR技術です15。すなわち、タンパク質受容体16と接触しているリガンドの原子である。
あるいは、受容体ベースのNMR法は、糖鎖の存在下でタンパク質受容体のシグナルに起こる変化を、アポ状態17について記録されたものと比較してモニターする。これらは主に、両方の状態間のタンパク質シグナルの化学シフト摂動のスクリーニングに焦点を当てています。最も一般的に使用される実験は、 1 H-15N HSQC、またはそのTROSY代替18である。
この2つのアプローチを組み合わせることで、幅広い親和性を示す多くの多様なシステムにNMRを適用することができます。しかし、受容体を用いたNMR法では、リガンドに基づく方法とは対照的に、比較的大量の可溶性、非凝集、安定同位体標識(15N)タンパク質が利用可能でなければなりません。
ここでは、両方の方法について説明し、それぞれの長所と短所を強調します。プロトコルに記載されている基本的な手順は、ブルカー分光計の使用例であることに注意してください。その結果、コマンドとパラメータの名前は、TopSpin(ブルカーの分光計制御ソフトウェア)で使用されているものと一致します。

<table><tbody><tr><td>5 mm 茂美マイクロチューブ セット マット</td><td>CortecNet SAS</td><td>S30BMS-005B</td><td></td></tr><tr><td>α-ラクトース - アガロース</td><td>Sigma - アルドリッチ Qu&iacute;マイカS.L.</td><td>7634-5ML</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム(15 N、99%)</td><td>LC-0179-N-50G</td><td>トレーサー技術。Anal&iacuteとして;ticas S.L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin (ナトリウム塩)&nbsp;</td><td>Melford Laboratories Ltd</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>BIOVIA Discovery studio&nbsp;</td><td>BIOVIA、Dassault Syst&egrave;mes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) ケミカルコンピテントセル&nbsp;</td><td>メルクライフサイエンス S.L.U.</td><td>CMC0014-40X40UL</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマンコールター</td><td>アレグラX-22R</td><td></td></tr><tr><td>D2O&nbsp;</td><td>ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ株式会社</td><td>DLM-4-1000</td><td></td></tr>イン<tr><td>キュベーター</td><td>Eppendorf</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl &szlig;-D-1-thiogalactopyranoside)</td><td>VWR International Eurolab S.L.</td><td></td><td></td>VW437144N</tr><tr><td>LacNAc</td><td>Elicityl</td><td>GLY008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Broth</td><td>Merck Life Science, S.L.U.</td><td>3397-1KG</td><td></td></tr><tr><td>マトラズ 三角マイヤー B N 5000 CC&nbsp;</td><td>VWRインターナショナルユーロラボS.L.</td><td>214-1137</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>PyMOL 分子グラフィックス システム</td><td>バージョン 2.0 Schr&ouml;ディンガー</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ソニックス &マテリアルズ株式会社</td><td>VC 505</td><td></td></tr><tr><td>超伝導NMR磁石</td><td>Bruker</td><td>600 MHz AVANCE III</td><td></td></tr><tr><td>超伝導NMR磁石</td><td>Bruker</td><td>800 MHz AVANCE III</td><td></td></tr></tbody></table>

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(nmr)による解決

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

糖鎖とタンパク質の相互作用は、健康や病気に関連する多くの事象を調節します。実際、これらの認識イベントの確立とその生物学的結果は、両方のパートナーの三次元構造、およびそれらの動的特徴と対応する細胞コンパートメントでの提示に密接に関連しています。NMR技術は、これらの特性を解きほぐすためのユニークな技術であり、実際、糖鎖とその関連受容体との結合イベントを監視するために、さまざまなNMRベースの方法論が開発され、適用されています。このプロトコルでは、NMR-糖鎖生物学の分野で採用されている最も強力な2つのNMR方法論、 1H-Saturation transfer Difference(STD)および 1 H,15N-Heteronuclear Single Quantum Coherence(HSQC)滴定実験を取得、処理、分析する手順を概説しています。これらは、それぞれ糖鎖とタンパク質の観点から情報を補完的に提供します。実際、これらを組み合わせると、分子認識プロセスの構造的および動的側面の両方を解明するための強力なツールキットが提供されます。この包括的なアプローチは、糖鎖-タンパク質相互作用の理解を深め、化学糖鎖生物学分野の研究の進歩に貢献します。

ここでは、1H-STD NMRおよび1 H-15N HSQC実験を利用して、レクチンと低分子オリゴ糖との結合相互作用の詳細を解明するためのプロトコルを紹介します。hGalectin-7(hGal-7)によるLacNAcの分子認識の解析で得られた結果は、プロトコールの成功例と、分子認識プロセスの細部を研究するためのこれらのNMR方法論の有効性を示す実例となっています。図3は、LacNAcとhGal-7との相互作用に関する1H-STD NMRスペクトルを示しています。STD NMRシグナルの存在は、結合を示しています(図3A)。さらに、タンパク質と密接に接触しているプロトンに属するシグナルのみが現れ、結合エピトープの描写が可能になります(図3B)。図4は、タンパク質の1 H-15N HSQCスペクトルをフィンガープリントとして使用する方法を示し、図5は、1 H-15Nヘテロ核単一量子コヒーレンス(HSQC)滴定実験を適用して、LacNAc結合時のhガレクチン-7バックボーンアミド基の化学シフト摂動を定義する方法を示しています。これらのデータは、相互作用の存在を明らかにするだけでなく、レクチンの結合界面をも明らかにします。図6は、滴定データの解析により、高マイクロモル範囲にあるhガレクチン-7によるLacNAcの結合親和性を推定できることを示しています。この知見は、他の手法を用いて得られた結果と一致している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig01.jpg"> 図1:オン共鳴周波数の選択。pH 7.4の重水素化リン酸緩衝生理食塩水中のLacNAc:hGal-7 50:1比の1H-NMRスペクトルが示されています。リガンド(LacNAc)のシグナルは、2.0〜5.2ppmの領域に限定されています。飽和頻度は、1〜2 ppmの範囲内にリガンドプロトンが存在しないことを確認するために慎重に選択され、タンパク質のプロトンの選択的な照射が可能になります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig02.jpg"> 図2:STD NMR実験。 STD実験の概略図:最初のスペクトル(オフレゾナンス)が参照として機能し、2番目のスペクトル(オンレゾナンス)ではタンパク質飽和が行われます。飽和は、タンパク質全体に効率的に伝播し、タンパク質と密接に接触してリガンドプロトンに移動します。結果として得られる差分スペクトル(STDスペクトル)は、飽和を経験した共振のみを生成します。STD実験の解析により、結合糖のエピトープマッピングが可能になります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig03.jpg"> 図3:リガンドの視点から見た結合解析 (A)LacNAcとhGal-7との相互作用のためのオフ共鳴スペクトルと1H STD-NMRスペクトルの重ね合わせ。STDスペクトルでは、タンパク質と密接に接触している陽子に属するシグナルのみが現れます。リガンドの1H共鳴のアノテーションは、オフ共鳴スペクトルで報告されます。(B)相対的なSTD強度をLacNAcの化学構造に色付けしてマッピングしました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig04.jpg"> 図4:タンパク質の1 H-15N HSQCスペクトルは、そのフィンガープリントを表しています。 (A)アポ形態の100μMのhGal-7の1つのH-15N HSQCスペクトル。スペクトルは25°Cで記録されました。 一部のNHクロスピークには、対応するアミノ酸のラベルが注釈されています。(B)各NHペアは、化学環境に依存し、その結果、タンパク質の3D構造に依存する独自の化学シフトを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig05.jpg"> 図5:タンパク質の視点から見た結合解析 (A)LacNAcのhGal-7溶液への滴定で記録された1 H-15N HSQCスペクトルの重ね合わせを示す。スペクトルの検査では、いくつかのクロスピークが化学シフト変化を経験するため、相互作用が明確に示されています。(B)LacNAc(15当量)とhGal-7の滴定から推定された骨格アミドシグナルの最大化学シフト摂動(maxCSP)のプロット。(C)CSP分析によると、hGal-7の最も摂動されたアミノ酸は、5gal PDB構造にマッピングされています。3Dモデルでは、赤色は2σを超えるCSP値を指し、ピンク色は1σから2σの間の値を指します。色付きの領域は、おそらく結合部位を表しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig06.jpg"> 図6:1 H-15N HSQC滴定実験に基づくKD測定 (A)研究中のシステムのNMR時間スケールでの化学交換速度に応じた1 H-15N HSQCベースの滴定のパターンの表現(高速、中程度、低速)。LacNAc/hGal-7相互作用の場合、高速交換レジームが観察されました。(B)hGal-7およびLacNAc二糖のモデルシステムについて、さまざまな配位子濃度でのCSP分析から得られたフィッティング曲線とKD推定。推定されたKDは、20の異なるアミノ酸のデータの平均として対応する誤差とともに報告されます。(C)滴定中の選択したクロスピークのシフトを示す1 H,15N-HSQCスペクトルのスニペット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、溶液中のタンパク質-糖鎖相互作用の特性評価を目的とした一連のNMR実験の取得、処理、および分析を詳述したプロトコールを紹介します。最も一般的なリガンドベースおよびタンパク質ベースの方法論が概説されており、構造糖鎖生物学および分子認識研究の分野に貢献していることは間違いありません。

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

私たちの研究では、多様な糖鎖レクチンシステムの研究を掘り下げ、健康や疾患との関連性を探っています。私たちは、化学、生物学、生物医学の方法論を融合させ、がんから細菌やウイルスの感染に至るまで、病理学者に対する免疫応答の役割を深く調査しました。近年、糖鎖科学は、糖鎖の設計、合成、構造分子認識の解析を原子レベルから細胞レベルに変革することで、画期的なマイルストーンを打ち立てています。これらの進歩は、蛍光療法または先進的糖鎖ベースの治療の舞台を整えるものです。このプロトコールでは、糖鎖分野で採用されている2つの最も強力なNMR方法論を取得、処理、分析するための手順を概説しています。これらの方法論、飽和移動差、および化学的安全性摂動分析は、地衣類の分子認識の構造的および動的側面の正確な情報を補完的に提供します。

disentangling-glycan-protein-interactions-nuclear-magnetic-resonance

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JoVE Journal

Chemistry

化学

このビデオでは、15のN標識野生型および変異型エンボプラキンタンパク質と非標識ビメンチンタンパク質との間のタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴分光法の技術について説明しています。野生型エンボプラキンとビメンチンとの相互作用が成功すると、NMRスペクトルでは広範な線幅が広がり、ピークが消失しますが、変異したエンボプラキンとビメンチンとの間に相互作用がないと、NMRスペクトルではピークが十分に分解されます。...

原子レベルのタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

ここで、安定同位体と核磁気共鳴 (NMR) 分光法とマイクロ スケールを用いたタンパク質間相互作用の後の評価と生産のラベルが付いている蛋白質の浄化のためのプロトコルを紹介します。働く (MST)...

核磁気共鳴分光法 (NMR) とマイクロ働く (MST) による球状と糸状のタンパク質の相互作用を測定

このNMRベースのプロトコルは、シアノビリン-NおよびD-マンノースを使用して弱いタンパク質-糖鎖相互作用を調査します。リガンドとタンパク質の検出方法を組み合わせて、結合部位をマッピングし、アロステリック効果を検出し、遭遇複合体を同定します。このアプローチは、サンプル前処理とデータ分析の概要を示し、糖鎖特異的診断と認識メカニズムに役立つ構造的および動的な洞察を提供します。...

タンパク質と糖鎖の相互作用の探索:核磁気共鳴の進歩

1次元および2次元1HNMRを用いたペプチド-金属錯体の構造と配位決定

還元的に13C-メチル化N末端リジンのα-およびε-ジメチルアミン核磁気共鳴信号を割り当てるための2つの方法が説明されています。1つの方法は、還元的メチル化反応のpH誘導選択性を利用し、もう1つの方法はアミノペプチダーゼを使用してN末端リジンを選択的に除去します。...

還元的にメチル化されたタンパク質上の13C-ジメチルN末端アミンのNMR共鳴を同定する方法

溶解動的核分極(DNP)による感度向上により、NMRやMRIによる代謝過程をリアルタイムで追跡することができます。研究用酵素反応用に設計された専用の溶解DNPセットアップの特性と性能について説明します。...

NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

このプロトコルは、酵素(エンドキシラナーゼ)加水分解の前にREを2つのアミノベンザミドでタグ付けし、その後、質量分析(MS)および核磁気共鳴(NMR)を使用して得られたオリゴ糖を分析することにより、ヘテロキシランの還元末端(RE)および内部領域のグリコシル配列の構造特性評価に使用される特定の技術について説明しています。...

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

EOB-DTPAの単離およびその後の複合体形成の自然のGa（III）および68とGaが本明細書に提示されるだけでなく、標識効率上のすべての化合物との調査を徹底的に分析、in vitroでの安定性およびオクタノール /水のための手順放射性標識された複合体の分配係数。...

EOB-DTPAとそのののGa（III）錯体に関する研究<sup&gt; 68</sup&gt; Gaの放射性標識アナログ

ここには、新しいユーザーがこの新しい方法を適用して、化学交換を受けている自身のシステムの速度論的パラメータを取得するのを助けるために、SSTD...

化学Exchangeプロセスの動力学的パラメーターを取得するために新しいツール：飽和移動差NMR（SSTD NMR）をスピン

学ぶ 糖鎖-タンパク質相互作用のNMR解析法。飽和転移差分法と化学シフト変動解析を用いて、結合エピトープと分子認識機構を解明する構造糖鎖生物学の手法を習得できます。

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

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