Name: 単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離Ca2+ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ単離加圧リンパ管における絶対カルシウム濃度と収縮性のリアルタイム測定法。ラット腸間膜リンパ管を用いた蛍光顕微鏡技術により、カルシウムシグナリングと収縮メカニズムの解明に貢献します。

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この研究は、National Institute of General Medical Sciences、Centers of Biomedical Research Excellence(COBRE)、Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy [P20-GM109005]、National Cancer Institute [1R37CA282349-01]、American Heart Association Predoctoral Fellowship [Award Number: 23PRE1020738; https://doi.org/10.58275/AHA.23PRE1020738.pc.gr.161089]を含む米国国立衛生研究所の支援を受けた。内容は著者の責任であり、必ずしもNIHまたはAHAの公式見解を表すものではありません。図 1 と 図 3 は BioRender.com を使用して作成されました。

単離リンパ管におけるカルシウムと収縮性のリアルタイム解析

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<li>Choi, I., Lee, S., Hong, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+era+of+the+lymphatic+system%3A+No+longer+secondary+to+the+blood+vascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">The new era of the lymphatic system: No longer secondary to the blood vascular system.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (4), 006445(2012).</li>
<li>Ji, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells%2C+lymphedematous+lymphangiogenesis%2C+and+molecular+control+of+edema+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat+Res+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells, lymphedematous lymphangiogenesis, and molecular control of edema formation.</a> Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 123-137 (2008).</li>
<li>Scallan, J. P., Zawieja, S. D., Castorena-Gonzalez, J. A., Davis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+pumping%3A+mechanics%2C+mechanisms+and+malfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic pumping: mechanics, mechanisms and malfunction.</a> J Physiol. 594 (20), 5749-5768 (2016).</li>
<li>Lee, S., Roizes, S., vonder Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+L-+and+T-type+voltage-dependent+Ca2%2B+channels+in+regulation+of+lymphatic+vessel+contractile+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of L- and T-type voltage-dependent Ca2+ channels in regulation of lymphatic vessel contractile activity.</a> J Physiol. 592 (24), 5409-5427 (2014).</li>
<li>Telinius, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphatic+vessel+contractile+activity+is+inhibited+in+vitro+but+not+in+vivo+by+the+calcium+channel+blocker+nifedipine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human lymphatic vessel contractile activity is inhibited in vitro but not in vivo by the calcium channel blocker nifedipine.</a> J Physiol. 592 (21), 4697-4714 (2014).</li>
<li>Imtiaz, M. S., Zhao, J., Hosaka, K., vonder Weid, P. Y., Crowe, M., van Helden, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaking+through+Ca2%2B+stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys J. 92 (11), 3843-3861 (2007).</li>
<li>Jo, M., Trujillo, A. N., Yang, Y., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+functional+ryanodine+receptors+in+rat+mesenteric+collecting+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence of functional ryanodine receptors in rat mesenteric collecting lymphatic vessels.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 317 (3), H561-H574 (2019).</li>
<li>Stolarz, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+Activates+Ryanodine+Receptors+in+Rat+Lymphatic+Muscle+Cells+to+Attenuate+Rhythmic+Contractions+and+Lymph+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin Activates Ryanodine Receptors in Rat Lymphatic Muscle Cells to Attenuate Rhythmic Contractions and Lymph Flow.</a> J Pharmacol Exp Ther. 371 (2), 278-289 (2019).</li>
<li>Van, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+Prevents+the+Lymphostasis+Caused+by+Doxorubicin+in+the+Rat+Mesenteric+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dantrolene Prevents the Lymphostasis Caused by Doxorubicin in the Rat Mesenteric Circulation.</a> Front Pharmacol. 12, 727526(2021).</li>
<li>Atchison, D. J., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+extra-+and+intracellular+Ca2%2B+in+the+lymphatic+myogenic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of extra- and intracellular Ca2+ in the lymphatic myogenic response.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 272 (1), R326-R333 (1997).</li>
<li>Atchison, D. J., Rodela, H., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+stores+modulation+in+lymph+vessels+depends+on+wall+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium stores modulation in lymph vessels depends on wall stretch.</a> Can J Physiol Pharmacol. 76 (4), 367-372 (1998).</li>
<li>Zhao, J., van Helden, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ET-1-associated+vasomotion+and+vasospasm+in+lymphatic+vessels+of+the+guinea-pig+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">ET-1-associated vasomotion and vasospasm in lymphatic vessels of the guinea-pig mesentery.</a> Br J Pharmacol. 140 (8), 1399-1413 (2003).</li>
<li>Cotton, K. D., Hollywood, M. A., McHale, N. G., Thornbury, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outward+currents+in+smooth+muscle+cells+isolated+from+sheep+mesenteric+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Outward currents in smooth muscle cells isolated from sheep mesenteric lymphatics.</a> J Physiol. 503 (1), 1-11 (1997).</li>
<li>Mathias, R., vonder Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+NO-cGMP-KATP+channel+pathway+in+the+mesenteric+lymphatic+pump+dysfunction+observed+in+the+guinea+pig+model+of+TNBS-induced+ileitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the NO-cGMP-KATP channel pathway in the mesenteric lymphatic pump dysfunction observed in the guinea pig model of TNBS-induced ileitis.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (6), G623-G634 (2013).</li>
<li>Garner, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KATP+channel+openers+inhibit+lymphatic+contractions+and+lymph+flow+as+a+possible+mechanism+of+peripheral+edema%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">KATP channel openers inhibit lymphatic contractions and lymph flow as a possible mechanism of peripheral edema.</a> J Pharmacol Exp Ther. 376 (1), 40-50 (2021).</li>
<li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytosolic+Ca2%2B+in+isolated+contractile+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytosolic Ca2+ in isolated contractile lymphatics.</a> J Vis Exp. (58), e3438(2011).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), 1-20 (2011).</li>
<li>Harmer, A. R., Abi-Gerges, N., Morton, M. J., Pullen, G. F., Valentin, J. P., Pollard, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+in+vitro+contractility+assay+using+canine+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Validation of an in vitro contractility assay using canine ventricular myocytes.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 260 (2), 162-172 (2012).</li>
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<li>IonOptix LLC. IonWizard 7.2 Core & Analysis Functions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IonOptix+LLC%22">IonOptix LLC</a>. , IonOptix LLC. Westwood, PA. (2017).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Zawieja, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ano1+mediates+pressure-sensitive+contraction+frequency+changes+in+mouse+lymphatic+collecting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ano1 mediates pressure-sensitive contraction frequency changes in mouse lymphatic collecting vessels.</a> J Gen Physiol. 151 (4), 532-554 (2019).</li>
<li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> J Physiol. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li>
<li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., vonder Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent+manners%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent manners.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2287-H2295 (2004).</li>
</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

LVは壊れやすく、小柄な性質を持つため、解剖とカニューレ挿入の両方のプロセスにおいて細心の注意を払うことが不可欠です。船舶にわずかな損傷があっても、生存不能なLVの発生や[Ca2+]i 過渡現象の異常を引き起こす可能性があります。励起設定の一貫性は、対照群と治療群の間の[Ca2+]i 測定値の比較可能性を確保するために、実験シリーズ全体を通じて同様に重要です。均一な設定を維持しないと、実験シリーズ内の血管全体で [Ca2+]i を過大評価または過小評価するリスクが高くなります。同様に、各実験を通じて同じ血管領域を正確に同定し、モニタリングすることも同様に重要です。
レシオメトリックインジケーターFura-2AMを使用すると、単一波長色素に共通する問題である組織の厚さの不均一、蛍光色素の分布/漏出、または光退色によって引き起こされる蛍光変動が正常化されます。31 これにより、このプロトコルで説明されている継続的な監視が可能になります。しかし、Fura-2はCa2+をキレートすることで作用するため、LVを過負荷にし、収縮や薬物反応に利用可能な[Ca2+]i を減らすことが可能です。これらの場合でも、リズミカルな収縮が見られない間に、Ca2+ のスパイクが観察される可能性があります。LVの長さを変えることもこの現象の一因となる可能性があります。これらのCa2+ 測定はまだ有効である可能性がありますが、Ca2+ と直径の両方の測定を成功させるには、複製されたセットアップでFura-2AMの濃度を下げる必要があるかもしれません。私たちの結果には、ベースラインでCa2+ スパイクとリズミカルな収縮の両方が存在したLVのみが含まれています。
Rmin と Rmax の測定は、絶対 [Ca2+]i を計算するための重要なステップです。Ca2+の非存在下では、RminはFura-2比であるべきであるため、Ca2+を含まないPSSに高濃度のEGTAが添加され、残留Ca2+のキレート化が確保されています。初期の研究は、Ca2+フリーPSSでEDTAを使用して実施され、これにより、対応するCa2+スパイクを伴う散発的な血管収縮が生じました。Rmaxについては、[Ca2+]iシグナルを最大化するために、高濃度のCa2+をイオノフォアであるイオノマイシンとともにPSSに添加しています。高Ca2+溶液が沈殿することがあり、PSSからEDTAを取り外す必要がある場合があります。重要なことに、RminおよびRmaxのこれらの追加の測定は、[Ca2+]iの生理学的に関連する変化を評価する機会を提供し、膜の興奮性および収縮性メカニズム27に関する情報を提供するだけでなく、Fura-2の340/380比のみを報告するプロトコルと比較した実験グループ間のベースライン比較を可能にする。適切な R最小値と R最大値を達成できないと、絶対値 [Ca2+]i を計算する能力が排除されます。
LVの収縮性の性質のために、この方法は、麻痺した血管32で測定できる局所的なCa2+放出イベントではなく、全体的なCa2+レベルの測定のみを提供できる。しかし、この方法は、麻痺した血管または個々の細胞28,32を使用する方法と比較して、絶対[Ca2+]iダイナミクスの変化を収縮性と相関させるのに有利である。このアプローチでは、測定されたCa2+の大部分がリンパ筋細胞に由来すると仮定されます。しかし、これらの単離されたLVにも存在する内皮細胞は、観察される総Ca2+シグナルに寄与している可能性がある33。この寄与は、内皮が剥がれたLVを使用して推定できます34。LVの収縮はまた、収縮サイクル中に血管壁がわずかに焦点が合わなくなったりする結果となる可能性があります。したがって、血管を伸ばさずにぴんと張ることができる短い血管セグメントを使用することが重要です。
この方法は、LVへの応用以外にも、細動脈や静脈など、他の血管床から単離された血管の研究に利用できる可能性があり、神経生物学や血管生物学の他の分野での利用が期待されています。さまざまなシグナル伝達経路を標的とするさまざまなアゴニストまたはアンタゴニストの影響を調べることは、根底にあるCa2+ダイナミクスを調査するための別の方法です。さらに、この手法は、それぞれの動物の対照サンプルと処理済みサンプルの比較研究にも使用できます。さらに、このアプローチは、孤立したリンパ筋細胞などの細胞レベルでの実施に適応可能であり、灌流チャンバーと顕微鏡対物レンズの調整は最小限で済みます。要約すると、この方法は、LVの収縮性とリズム性と相関し、LVの収集におけるCa2+ダイナミクスの潜在的な調節因子の堅牢な評価を提供するため、全体的なCa2+ダイナミクスに生理学的に関連する洞察を提供します。

リンパ管系は、脳、心臓、肺、腎臓、腸間膜など多くの臓器系にみられ、間質腔から中心静脈管に液体(リンパ液)を送り込み、体液の恒常性を維持することで作動する7,8,9,10 .それは、血管毛細血管床内のブラインドエンドリンパ管から始まり、それが集リンパ管(LV)に流れ込みます。LVの収集は、リンパ筋細胞(LMC)10,11の層に囲まれた内皮細胞の層である2つの細胞層から成り立っています。リンパ液の輸送は、外因性の力(例えば、新しいリンパの形成、動脈の脈動、中心静脈圧の変動)と内因性の力の両方によって達成されます12。
リンパ輸送の本質的な力は、リンパ機能を調査する大多数の研究の焦点である、集まったLVの自発的なリズミカルな収縮です。この内因性リンパポンプは、主に細胞質の遊離Ca2+([Ca2+]i)の周期的な上昇と下降によって調節されます。LMCにおける原形質膜の自発的な脱分極は、電位依存性の「L型」Ca2+(Cav1.x)チャネルを活性化し、Ca2+の流入とそれに続くLVリズミカルな収縮を誘発する8,9,10。この役割は、ニフェジピンのような特定の薬剤でCav1.xを阻害することによって実証され、これはLV収縮を阻害し、血管拡張を引き起こした13,14。Cav1.xチャネルによって媒介されるLMCにおける[Ca2+]iまたは「Ca2+スパイク」の一時的な上昇は、筋小胞体(SR)15,16,17,18上のイノシトール三リン酸(IP 3)受容体およびリアノジン受容体(RyRs)を活性化することにより、細胞内Ca2+貯蔵を動員する可能性もある。現在の証拠は、IP3受容体がRyRs 15,16,19,20,21と比較して、正常なLV収縮に必要なCa2+に大きく寄与することを示唆しています。しかし、RyRsは、病理学中または薬物的介入17,18に応答して役割を果たす可能性がある。さらに、Ca2+活性化K+チャネル22およびATP感受性カリウム(KATP)チャネル23,24の活性化は、LMC膜を過分極させ、自発的な収縮活性を阻害することができる。
LVの収集においてCa2+ ダイナミクスを調節する可能性のあるイオンチャネルやタンパク質は他にもたくさんあり、これらの潜在的な調節因子を理解するためには、薬理学的薬剤に応答したCa2+ と血管収縮性の変化をリアルタイムで研究する方法を利用することが重要です。Fura-2を使用してLV [Ca2+]i の相対的変化を測定する以前の方法が記載されている25。Fura-2とCa2+ の解離定数が知られているため26、Ca2+の実際の濃度を計算することが可能であり、この方法の適用が広がり、Ca2+ シグナル伝達、膜興奮性、および収縮性メカニズム27に関する追加の洞察が得られ、実験グループ間のベースライン比較も可能になります。この後者のアプローチは心筋細胞28で使用されており、したがって、LVに適応することができます。この論文では、これら2つのアプローチを組み合わせて、絶対的な[Ca2+]i の変化と血管の収縮性/リズム性の変化をリアルタイムで連続的に測定および計算する改良された方法を示します。また、ニフェジピンで治療したLVの代表的な結果も提供しています。

<table><tbody><tr><td>20x S Fluor 対物レンズ</td><td>Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States)</td><td>UPlanSApo</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass micropipettes</td><td>Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, United States)</td><td>GCP-75-100</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl2)</td><td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素 (CO2)</td><td>nexAir (テネシー州メンフィス、アメリカ合衆国)</td><td>UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Forceps</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, United States)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (C10H16N2O8)</td><td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (C14H24N2O10)</td><td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, United States)</td><td>O2783-100</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Invitrogen (Waltham, MA、米国)</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>グルコース(C6H12O6)</td><td>Fisher Bioreagents(マサチューセッツ州ウォルサム、米国)</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Gravity-Fed Pressure regulator</td><td>custom-made in the lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>暖房ユニット</td><td>Living Systems Instrumentation(バーリントン、バーモント州、米国)</td><td>TC-09S</td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>IonOptix(ウェストウッド、マサチューセッツ州、米国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States)</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Invitrogen (Waltham, MA, United States)</td><td>I24222</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix Cell Framing Adaptor</td><td>IonOptix (Westwood, MA, United States)</td><td>665 DXR</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care (Telangana, India)</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>隔離された血管灌流チャンバー</td><td>Living Systems Instrumentation (バーリントン、バーモント州、アメリカ合衆国)</td><td>CH-1</td><td></td></tr><tr><td>Knot preparation vesps</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, United States)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>LED light source</td><td>Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, United States)</td><td>TL4</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td><td>Acros Organics(ニュージャージー州ニュージャージー州、アメリカ合衆国)</td><td>213115000</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S3高速CMOSビデオシステム</td><td>IonOptix(マサチューセッツ州ウェストウッド、アメリカ合衆国)</td><td>MCS300</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Sigma(ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国)</td><td>N7634</td><td></td></tr>眼<tr><td>科縫合剤酸素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(O2)</td><td>nexAir(テネシー州メンフィス、アメリカ合衆国)</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>プルロン酸</td><td>シグマ(ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国)</td><td>P2443</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム(KCl)</td><td>フィッシャーバイオ試薬(マサチューセッツ州ウォルサム、アメリカ合衆国</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>圧力モニターシステム</td><td>リビングシステム計装(バーリントン、バーモント州、アメリカ合衆国)</td><td>PM-4</td><td></td></tr>圧力<tr><td>トランスデューサ</td><td>ーリビングシステム計装(バーリントン、バーモント州、アメリカ合衆国)</td><td>PT-F</td><td></td></tr><tr>ラボ<td></td><td></td><td>でカスタムメイド</td>された<td>シリコーン裏地付きペトリディッシュ</td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム(NaHCO3)</td><td>フィッシャーバイオ試薬(ウォルサム、マサチューセッツ州、米国</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィッシャーバイオ試薬(ウォルサム、マサチューセッツ州、米国</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム(NaH2PO4)</td><td>フィッシャーバイオ試薬(ウォルサム、マサチューセッツ州、米国</td><td>BP329-500</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley rats</td><td>Envigo RMS (インディアナポリス、インディアナ州、米国)</td><td>オス</td><td>9-13 週齢</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems (Wetzlar, Germany)</td><td>S9D</td><td></td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, United States)</td><td>15000-03</td><td></td></tr></tbody></table>

単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離ca2+ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価

Real-time Evaluation of Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ and Corresponding Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels

リンパ管系は、現在「第3の循環」と呼ばれることが多く、多くの重要な臓器系に位置しています。リンパ管系の主な機械的機能は、細胞外空間から体液を中心静脈管に戻すことです。リンパ輸送は、リンパ管(LV)の自発的なリズミカルな収縮によって媒介されます。LV収縮は、主に細胞質の遊離カルシウム([Ca2+]i)の周期的な上昇と下降によって調節されます。
この論文では、単離された加圧LVにおいて、[Ca2+]i の絶対濃度と血管の収縮性/リズム性の変化をリアルタイムで同時に計算する方法を紹介します。単離されたラット腸間膜LVを使用して、[Ca2+]i と薬物添加に応じた収縮性/リズム性の変化を研究しました。分離されたLVにレシオメトリックCa2+センシングインジケーターFura-2AMをロードし、エッジ検出ソフトウェアと組み合わせたビデオ顕微鏡を使用して、[Ca2+]i および直径の測定値をリアルタイムで連続的にキャプチャしました。
各LVからのFura-2AM信号は、各船舶の最小信号と最大信号に較正され、絶対[Ca2+]iの計算に使用されました。直径測定値は、収縮パラメータ(振幅、拡張期末直径、収縮期末直径、計算された流量)とリズム性(周波数、収縮時間、緩和時間)を計算するために使用され、絶対[Ca2+]i 測定値と相関しました。

LVの収縮性とそれに対応する細胞質の遊離Ca2+([Ca2+]i)の変化は、さまざまな濃度のニフェジピン(NIF;0.1-100 nM)への曝露により、単離ラット腸間膜LVで評価されました(図6)。Ca2+ スパイク振幅、ベースライン Ca2+、ピーク Ca2+ などのパラメータは、灌流チャンバーへの NIF の増分添加により、濃度依存的な減少を示しました(図 7A)。同時に、収縮振幅や計算された流量などの収縮パラメータも段階的に減少することを示しました(図7B)。NIFではEDDの直径がわずかに増加しました(図7B)。Ca2+ スパイク周波数と収縮周波数は、オール オア ナッシング応答のように見えます。しかし、この影響は1つのLVで10nMで発生し、すべてのLVは100nMの収縮を停止していました。したがって、結合されたデータは、段階的な濃度応答に似たグラフを生成します。この効果は、他の調製物のLVにNIFを使用した以前の出版物と一致しています(ワイヤーおよび圧力筋造影13,14)。マンハッタンプロットは、間隔、収縮時間、緩和時間などのリズム性の測定値に対する個々のLV応答を示しています(図7C)。このタイプのデータ表現により、研究者はこれらのオールオアナッシングの応答または収縮リズムの変動性を引き出し、根本的なメカニズムに関する追加の洞察を提供することができます。最終的に、収縮振幅と収縮周波数の減少は、これらの単離されたLVを通る計算された流量の減少をもたらし、これはin vivo機能の代理指標として機能します。全体として、LV収縮性の低下は[Ca2+]iの減少と相関していました。私たちの調査結果は、100 nMの範囲で、NIFがリンパ筋細胞(LMC)に存在するCav1.xチャネルに拮抗することにより、LVの収縮と[Ca2+]i振動を効果的に停止したという直接的な証拠を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig01v2.jpg"> 図1:隔離された容器チャンバーのセットアップの画像。 血管灌流研究では、温度調節器を備えた隔離された容器チャンバーを使用しました。重力は、PSSリザーバーを介して圧力を制御するために使用されました。圧力は、流入カニューレ(P1)と流出カニューレ(P2)の両方に接続されたトランスデューサーによって監視されました。略語:PSS = 生理的塩溶液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig02.jpg"> 図2:結び目の準備が一目でわかる。(A) 3層のシルク縫合糸のシングルフィラメントを使用して解剖顕微鏡下でダブルループを準備し、 (B) ルーズエンドをつかんで両方のループに引っ張り、 (C) 両端から結び目を引っ張って小さな開口部を保ち、 (D) 両側から余分なフィラメントを切断し、完全なダブルオーバーハンドノットをすぐに使用できることを示しています。スケールバー= 1.5 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig03.jpg"> 図3:データ取得のための実験ワークフローの概略図。 健康なラットに5%イソフルラン誘導薬を投与し、体幹の血液を抜くために斬首術を行った。腸間膜を露出させて分離するために、正中線切開が行われました。単離された腸間膜を氷冷したPSS溶液に広げ、分離された血管灌流チャンバーでカニューレ挿入のために脂肪を含まないLVを解剖しました。浴槽は、20倍の対物レンズを使用して倒立顕微鏡のステージに置かれました。容器は340nmと380nmの波長の光で交互に励起され、発光蛍光スペクトルはCCDカメラを使用して510nmで収集されました。顕微鏡に接続されたコンピューターは、蛍光捕捉およびエッジ検出イメージングソフトウェアを使用して、収縮性およびCa2+ トレースを生成しました。スケールバー= 1 mm。略語:PSS =生理的塩溶液;LV =リンパ管;CCD = 電荷結合素子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig04.jpg"> 図4:代表的なLV収縮トレース (A)Ca2+ イメージングインジケーターFura 2 AMをPSSにロードしたカニューレLVの直径変化の記録例と、(B)血管の収縮性に関連するすべてのパラメータ(EDD、ESD、AMP、および周波数)を示すズームイントレース。これらの値は、リズム性と流量を計算するために使用されました。略語:PSS =生理的塩溶液;LV =リンパ管;EDD = 拡張末期直径;ESD = 収縮末期直径;AMP = 振幅。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig05.jpg"> 図5:代表的なLV Ca2+ イメージングトレース (A)PSSでFura-2をロードしたカニューレLVの絶対[Ca2+]i の変化の記録例と(B)[Ca2+]i に関連するすべてのパラメータ(ピーク、振幅、ベースライン)を示すズームイントレース(バックグラウンド補正なし)。略語:PSS = 生理的塩溶液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig06.jpg"> 図6:左室収縮性とCa2+イメージングの概要 PSSベースライン、ニフェジピン、Cav1.x(Ca2+)チャネルアンタゴニストの(A)直径、(B)340/380比、および(C)絶対[Ca2+]iに対応する代表的なトレース、R最小およびR最大を含む濃度応答。略語:PSS =生理的塩溶液;LV =リンパ管;NIF =ニフェジピン;Rmin = 最小 Fura-2 蛍光シグナル。Rmax = 最大Fura-2蛍光シグナル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig07.jpg"> (A)Ca2+ (n = 3) および (B) 収縮性 (n = 3) パラメータは、電圧依存性の Cav1.x (Ca2+) チャネル拮抗薬であるニフェジピンの添加により、濃度依存的に減少しました。(C)代表的なマンハッタンプロットは、収縮と収縮および緩和時間の間の平均時間間隔(Δt)を示しています。データは平均±SEMで表されます。略語:PSS =生理的塩溶液;LV =リンパ管;NIF =ニフェジピン;EDD = 拡張末期直径;AMP = 振幅。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、収縮リンパ管の細胞質、遊離カルシウム[Ca2+]i 、血管径をリアルタイムで同時に測定し、絶対的なCa2+ 濃度と収縮性/リズム性パラメータを計算する方法を説明しています。このプロトコルは、さまざまな実験条件でのCa2+ および収縮ダイナミクスの研究に使用できます。

単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離Ca2+ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価

The lymphatic vasculature, now often referred to as &#34;the third circulation,&#34; is located in many vital organ systems. A principal mechanical ...

がん性リンパ浮腫の根底にある病態や、リンパ系と高血圧の関係を理解するために、リンパ管の収縮やリンパの流れのメカニズムを研究しています。リンパ管系内の治療標的を特定し、リンパ疾患の新規治療法を開発することを目標としています。リンパ筋と内皮細胞のさまざまなangチャネルの最近の発見は、基礎となるカルシウムダイナミクスに寄与し、この分野を前進させるのに役立ちました。単離された血管と生体内顕微鏡は、リンパ管の機能を研究するための重要な技術です。最近では、臓器チップや微細加工された血管を使用してリンパ生物学の多くの側面を調査する傾向が強まっています。非常に小さな組織サイズは、リンパ管系の研究、多くの時間、忍耐、および新技術の開発を必要とする課題です。リンパ筋細胞特異的マーカーが利用できないことは、科学界全体にとってもう一つのハードルです。このプロトコルの利点は、同じ血管内のリンパ管収縮と絶対カルシウム濃度を測定できることです。これにより、カルシウムシグナル伝達、収縮のメカニズム、および治療群間のベースライン比較を測定する能力に関する追加の洞察が得られます。カルシウムや麻痺した血管の相対的な変化に依存する可能性のある他の技術と比較して。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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細胞質のCaの測定 2 +絶縁収縮リンパ管における

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この論文は、ラットの心臓から分離された心筋細胞における収縮中のミオフィラメントCa2+感度の変化を評価するプロトコルについて説明しています。心臓電気生理学、収縮期/拡張期サイトゾルCa2+レベル、収縮/弛緩とともに、この測定は、健康な心臓と病気の心臓の心臓の興奮-収縮結合を媒介するメカニズムを支えるために不可欠です。...

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細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2...

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ここで提示されるプロトコルは、ナノニュートン分解能を有する線条筋筋筋線維の収縮特性を評価する。このプロトコルは、干渉法ベースの光学力プローブを用いたセットアップを採用しています。この設定は、高い信号対雑音比を持つデータを生成し、myofibrilsの収縮運動の評価を可能にします。...

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

本プロトコールは、マウスの精密切断肺スライスを調製し、利用して、ほぼ in vivo環境における...

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ここでは、光学系プラットフォームを用いてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において収縮性およびカルシウム測定を行う確立された方法について説明する。このプラットフォームにより、研究者は突然変異の影響とさまざまな刺激に対する応答を迅速かつ再現性のある方法で研究できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞におけるカルシウムおよび収縮性パラメータのリアルタイム測定

このプロトコルでは、生理学的管腔内圧で肺内静脈(小肺静脈またはPV)のCa2+ シグナルを記録および分析するための新しい技術を紹介します。この手法には、小さなPVの単離、Ca2+ インジケーターによるインキュベート、カニューレ挿入と加圧、Ca2+...

生理学的管腔内圧下での小さな肺静脈におけるCa2+ シグナルのイメージング

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マウスの頸部リンパ管およびリンパ流の収縮率を生 体内 で2光子イメージングするための再現可能なセットアップ

感染プロセス中に、重要なステップは、宿主細胞による病原体の付着です。ほとんどのインスタンスでこの接着ステップは、液体を流すことにより生成される機械的ストレスの存在下で発生します。私たちは、細菌の付着の研究において重要なパラメータとしてせん断応力を導入する手法を説明します。...

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

学ぶ単離加圧リンパ管における絶対カルシウム濃度と収縮性のリアルタイム測定法。ラット腸間膜リンパ管を用いた蛍光顕微鏡技術により、カルシウムシグナリングと収縮メカニズムの解明に貢献します。

単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離Ca²⁺ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価

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