Name: モノクロマルチプレックス定量的PCRテロメア長さ測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶモノクロマルチプレックス定量的PCRによるテロメア長さ測定法。ヒトDNAを用いた集団研究で細胞老化を評価し、早期逆境と健康結果の関連を正確に解析するコスト効率の良いプロトコルを解説する。

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<meta charset="utf8"></head><body>ヒト集団研究における正確なテロメア長評価

<ol><li>Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shortest+telomere%2C+not+average+telomere+length%2C+is+critical+for+cell+viability+and+chromosome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability.</a> Cell. 107 (1), 67-77 (2001).</li>
<li>Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+telomere+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pathol%3A+Mech+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of telomere biology in cancer.</a> Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).</li>
<li>Lindrose, A., Drury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+reporting+recommendations+for+pcr-based+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Telomere+Research+Network%22%5BJournal%5D)">Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement.</a> Telomere Research Network. , (2020).</li>
<li>Verhulst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary%3A+The+reliability+of+telomere+length+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Commentary: The reliability of telomere length measurements.</a> Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).</li>
<li>Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement-caveats+and+a+critical+assessment+of+the+available+technologies+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools.</a> Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).</li>
<li>Mundstock, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+obesity+on+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).</li>
<li>Haycock, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucocyte+telomere+length+and+risk+of+cardiovascular+disease%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 349, 4227(2014).</li>
<li>Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoking+and+telomere+length%3A+A+systematic+review+of+84+studies+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis.</a> Environ Res. 158, 480-489 (2017).</li>
<li>Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+and+telomere+length%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Depression and telomere length: A meta-analysis.</a> J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).</li>
<li>Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+all-cause+mortality%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis.</a> Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).</li>
<li>Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+telomere+length+in+risk+and+recurrence+of+prostate+cancer%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis.</a> Andrologia. 51 (7), e13304(2019).</li>
<li>Schneider, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+telomere+length+with+risk+of+disease+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Inter+Med%22%5BJournal%5D)">Association of telomere length with risk of disease and mortality.</a> JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+the+risk+of+cardiovascular+diseases%3A+A+mendelian+randomization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).</li>
<li>D'mello, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shortened+leukocyte+telomere+length+and+cardiometabolic+outcomes%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Cardiovasc+Gene%22%5BJournal%5D)">Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis.</a> Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).</li>
<li>Wilbourn, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+telomere+length+and+mortality+risk+in+non-model+vertebrate+systems%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).</li>
<li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+and+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).</li>
<li>Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+telomere+length+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of telomere length measurement methods.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).</li>
<li>Cawthon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+measurement+by+quatitative+pcr%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere measurement by quatitative pcr.</a> Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).</li>
<li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement+by+a+novel+monochrome+multiplex+quantitative+pcr+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method.</a> Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).</li>
<li>Lindrose, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+comparison+studies+of+telomere+length+measurement+using+qpcr+approaches%3A+A+critical+appraisal+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature.</a> PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+extraction%2C+DNA+integrity%2C+and+laboratory+on+the+precision+of+qpcr-based+telomere+length+measurement+-+a+multi-lab+impartial+study%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ph+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).</li>
<li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+yield+and+purity%3A+An+overlooked+detail+of+pcr+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting.</a> Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+chronological+age+across+the+human+lifespan%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+414+study+samples+including+743%2C019+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length and chronological age across the human lifespan: A systematic review and meta-analysis of 414 study samples including 743,019 individuals.</a> Ageing Res Rev. 90, 102031(2023).</li>
<li>Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+telomerase+activity%3B+a+yin+and+yang+of+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence.</a> J Vis Exp. (75), e50246(2013).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-mediated+inflammatory+diseases+and+leukocyte+telomere+length%3A+A+mendelian+randomization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genetics%22%5BJournal%5D)">Immune-mediated inflammatory diseases and leukocyte telomere length: A mendelian randomization study.</a> Front Genetics. 14, 1129247(2023).</li>
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<li>Zong, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+air+pollution+exposure+and+telomere+length%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health%22%5BJournal%5D)">Ambient air pollution exposure and telomere length: A systematic review and meta-analysis.</a> Public Health. 215, 42-55 (2023).</li>
<li>Tang, L., Li, D., Wang, J., Su, B., Tian, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+air+pollution%2C+genetic+risk+and+telomere+length+in+uk+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22J+Expo+Sci+Environ+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Ambient air pollution, genetic risk and telomere length in uk biobank.</a> J Expo Sci Environ Epidemiol. , (2023).</li>
<li>Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement-caveats+and+a+critical+assessment+of+the+available+technologies+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools.</a> Mutat Res. 730 (1), 59-67 (2012).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+cell+type-specific+telomere+length+changes+in+subsets+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic and cell type-specific telomere length changes in subsets of lymphocytes.</a> J Immunol Res. 2016, 5371050(2016).</li>
<li>Needham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socioeconomic+status%2C+health+behavior%2C+and+leukocyte+telomere+length+in+the+national+health+and+nutrition+examination+survey%2C+1999-2002%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Sci+Med%22%5BJournal%5D)">Socioeconomic status, health behavior, and leukocyte telomere length in the national health and nutrition examination survey, 1999-2002.</a> Soc Sci Med. 85, 1-8 (2013).</li>
<li>Verhulst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+comparability+between+qpcr-based+telomere+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Res%22%5BJournal%5D)">Improving comparability between qpcr-based telomere studies.</a> Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).</li>
<li>Dagnall, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pre-analytic+variables+on+the+reproducibility+of+qpcr+relative+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement.</a> PloS one. 12 (9), e0184098(2017).</li>
<li>Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement+by+qpcr-summary+of+critical+factors+and+recommendations+for+assay+design%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design.</a> Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).</li>
<li>Wolf, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-tissue+comparison+of+telomere+length+and+quality+metrics+of+DNA+among+individuals+aged+8+to+70+years%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years.</a> PLOS One. 19 (2), e0290918(2024).</li>
<li>RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+long-term+storage+on+stability+of+standard+DNA+for+nucleic+acid-based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods.</a> J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).</li>
<li>Dagnall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pre-analytic+variables+on+the+reproducibility+of+qpcr+relative+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement.</a> PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).</li>
<li>Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+effect+of+repeated+freeze+and+thaw+cycles+on+stability+of+genomic+DNA+using+pulsed+field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis.</a> Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).</li>
<li>Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/">https://cran.r-project.org/</a> (2024).</li>
<li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data%3A+a+practical+guide+for+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).</li>
</ol>

テロメアは、すべての真核生物の染色体の末端に見られる保護複合体であり、高度に保存された反復DNA配列と関連タンパク質で構成されています。テロメアはDNAの完全性を保護し、染色体の安定性を維持します。テロメアの進行性短縮は、不完全な遅鎖DNA合成、DNA損傷、およびその他の要因の結果として、分裂細胞で発生します1,2。テロメア長(TL)が人間の生涯にわたる老化および加齢性疾患のバイオマーカーであることを裏付ける証拠の増加に伴い、ヒトへの曝露、疾患、および健康の研究におけるTLの役割を評価するために利用されるTL測定アッセイの種類が増加している3,4,5。メタアナリシスでは、TLと全死亡率、環境曝露、およびがん、心血管疾患、糖尿病などの健康転帰との関連が報告されています6,7,8,9,10,11,12,13 .これらのメタアソシエーションは、アソシエーションの強さが異なる方法論14,15,16間で異なる傾向がある2ダース以上の異なるTL測定方法論の1つを利用した研究から導き出されます。調査研究に最適なTL測定方法を選択することは、各方法が独自の長所と短所を持っているため、正確な結果を確保するための重要なステップです5,17。
試薬のコストが比較的低く、アッセイのターンアラウンドが迅速で、拡張性があり、初期DNA要件が少ないため、PCRベースのTL測定技術は、大規模なサンプル集団を持つ研究、高濃度のサンプルへのアクセスが限られている研究、またはハイスループットを優先する研究を行う場合に優先的に利用されることがよくあります。TL測定の最初のPCRベースの方法である、リチャード・カウソンによって最初に開発されたシングルプレックス定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、テロメア(T)とシングルコピー遺伝子(S)増幅の蛍光シグナルの比を利用し、別々のPCRプレート上で実行される18。このアプローチでは、反復テロメアDNA配列(T)に相補的なプライマーを使用して、サンプル中の全テロメアDNA含有量を増幅し、蛍光レポーターSYBR greenの検出によって定量します。同様に、保存された単一コピー(S)遺伝子の遺伝子間領域に相補的なプライマーを使用して、ゲノムコピー数を定量化します。これら 2 つの推定値は、プレート間のばらつきを制御するプロジェクト内のすべてのアッセイで使用されるゲノム DNA 標準曲線に対して定量化されます。全テロメアDNA(T)を単一ゲノムコピー数(S)で割ると、T/S比、つまり個々のDNAサンプル18,19の細胞当たりの平均テロメア含量を表す単位のない相対測定値が得られる。したがって、T/S 比は機能的な長さの特定の測定値ではありません。ただし、文献の基準と一致して、このプロトコル全体でサンプルあたりの平均TLという用語を使用します。
この方法は、2009年にRichard CawthonがモノクロマルチプレックスqPCR(MMqPCR)アッセイを、元のシングルプレックスqPCR法19と比較してT/S比の変動性を潜在的に低減するアプローチとして説明したときに進歩しました。MMqPCRアッセイは、qPCRアッセイの利点に加えて、1つの報告蛍光色素を使用して同じ反応ウェル内のTシグナルとSシグナルを測定するという追加の利点を備えているため、シングルプレックスqPCRに比べてエラーが減少し、精度と再現性が向上します19。さらに、このマルチプレックス法は、シングルプレックスアッセイ19と比較して必要な反応回数が半分であるため、コストを削減し、スループットを向上させる可能性がある。
MMqPCR TL測定の利点を考えると、この方法は、曝露、健康転帰、および生物学的プロセスとのTL関連に関する集団ベースの研究に適しています。ただし、このメソッドを開始するのは難しい場合があります。これらの課題に対処するために、当研究室で利用されているMMqPCR TL測定プロトコルについて詳しく説明し、アッセイの精度を高め、汚染リスクを低減し、再現性を高めるために実施された主要なステップに焦点を当てています。
さらに、このプロトコルでは、データをクリーニングし、TL測定の再現性の重要な統計的尺度であるクラス内相関係数(ICC)を計算するための手順を概説します2。私たちの代表的な結果により、このプロトコルを使用して高ICCを生成する能力を実証しています。さらに、TL測定値のばらつきを減らし、結果として生じるICCを増加させることが期待される品質管理(QC)とトラブルシューティングの手順を特定します。この方法の高い再現性、効率性、費用対効果により、MMqPCR TL測定は疫学TL研究に最適です。 図1は、このプロトコルで説明されているMMqPCR法の概要を視覚的に示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig01v2.jpg"> 図1:メソッドの概要。 テロメアの長さを測定するためのモノクロマルチプレックス定量的ポリメラーゼ連鎖反応法の広範な概要。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.5mLチューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0099</td><td>Seal-Rite 0.5mL 微量遠心チューブ、滅菌 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>1.5mL チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5599</td><td>Seal-Rite 1.5mL 微量遠心チューブ、滅菌 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>100mM DTT</td><td>社内</td><td>適用</td><td>されませんストックDTT、希釈酢酸ナトリウム、PCRグレードH2O で作られました 保存温度と条件:マイナス20°C;C&nbsp;</td></tr><tr><td>15mLチューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14-959-53A</td><td>コーニング 352196 ファルコン 15mL コニカル遠心分離機 チューブ 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>1M MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>50152107</td><td>Biotang Inc 1M MgCl2 1M 塩化マグネシウム溶液、18.2メガオームの水で調製し、0.22ミクロンのフィルター でろ過 保存温度と条件: 4度;C&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Gold Buffer</td><td>In House</td><td>Not Applicable PCR</td><td>グレードH2O で希釈した10X金バッファー 保存温度と条件:マイナス20°C;C&nbsp;</td></tr><tr><td>25mM dNTPs</td><td>New England BioLabs</td><td>N0446S</td><td>デオキシヌクレオチド溶液セット 保存温度と条件: マイナス 20 °C;C&nbsp;</td></tr><tr><td>5mLチューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3391276</td><td>Argos Technologies マイクロ遠心チューブ &ndash; 5mL 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>バイオ・ラッド</td><td>HSP9601</td><td>ハードシェル 96ウェルPCRプレート、ロープロファイル、薄壁、スカート、ホワイト/クリア 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>オフィスデポ</td><td>3489072</td><td>レイノルズラップスタナードアルミホイルロール、12 "x 75 '、シルバー 保管温度と条件:室温</td></tr><tr><td>AmpliTaqゴールドキット&ndash;ポリメラーゼおよびバッファー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4311806</td><td>AmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ with Gold バッファーおよび MgCl2 (このキットの MgCl2 は使用していません)、10X Gold バッファー、2.5U AmpliTaq Gold ポリメラーゼ 保存温度および条件: マイナス 20 °C;C&nbsp;</td></tr><tr><td>ベタイン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AAJ77507AB</td><td>ベタイン、5M 溶液、分子生物学グレード、超高純度、10mL 保存温度と条件: マイナス 20 °C;C&nbsp;</td></tr><tr><td>ビッグチューブラック</td><td>サーモフィッシャー</td><td>344817</td><td>フィッシャーブランド 4ウェイチューブラック 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>CFX Maestro ソフトウェア</td><td>Bio-Rad</td><td>12004110</td><td>リアルタイム PCR プレートのセットアップ、データ収集、統計、結果のグラフ化 保存温度と条件:</td></tr><tr><td>スターターパッケージ付きリアルタイム PCR システム用室温 CFX96 光学反応モジュール</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1845096</td><td>リアルタイム PCR 用96ウェル光学モジュール 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>DTT フィ</td><td>ッシャー サイエンティフィック</td><td>AAJ1539706</td><td>ジチオスレイトール、>99.5+ 分子生物学グレード、5 g 保存温度と条件: マイナス 20 °C;C&nbsp;</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>04-355-32</td><td>ELIMINase 実験室 除染剤 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>HEPA フィルター</td><td>USA サイエンティフィック</td><td>交換フィルター</td><td>AirClean ワークステーション用高効率微粒子エアフィルター 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>サーモフィッシャー</td><td>06666A</td><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes デリケートタスクワイパー、1-Ply 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>ローディングトラ</td>フ <td>Thermo Fisher</td><td>14387069</td><td>Thermo Scientific Matrix 試薬リザーバー 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>該当</td><td>なしMicrosoft 365パッケージ、Excelソフトウェアアプリケーション 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>31-500B</td><td>ポセイドン 31-500B ミニ遠心分離機、青い 蓋 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>PCR グレード H2O</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9937</td><td>ヌクレアーゼフリー水(DEPC処理されていない) 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>PCRフード</td><td>USA Scientific</td><td>4263-2588</td><td>HEPAろ過、AirCleanシステムコンビネーションPCRワークステーション 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>PCRストリップ</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーAB0776</td><td>ロープロファイルチューブとフラットキャップ、8 のストリップ 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>PCRチューブラック</td><td>サーモフィッシャー</td><td>344820</td><td>フィッシャーブランド96ウェルPCRチューブラック 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>ピペットチップ(マルチチャンネル)</td><td>ラニン</td><td>17005860</td><td>ピペットチップSR LTS 20&micro;L F 960A/5, 20&micro;L Maximum 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>ピペットチップ (シングルチャンネル)</td><td>USA Scientific</td><td>1181-3850</td><td>10&micro;L目盛り付きTipOne RPTフィルターチップ 保管温度と条件:室温</td></tr><tr><td>ピペットチップ(シングルチャンネル)USA</td><td>サイエンティフィック</td><td>1180-1850</td><td>20&micro;L斜めTipOne RPTフィルターのヒント 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>ピペットのヒント(シングルチャンネル)USA</td><td>サイエンティフィック</td><td>1111-0880</td><td>200&micro;ラックのL自然なTipOneピペットのヒント 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>ピペットのヒント(シングルチャンネル)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2890</td><td>1000&micro;Lの自然な目盛り付きTipOneピペットの先端 Racks 貯蔵温度および条件: 室温</td></tr><tr><td>のピペットtors(多チャンネル)</td><td>Ranin</td><td>17013802</td><td>Pipet-Liteの多ピペットL8-10XLS、0.5から10マイクロ;L 保管温度と条件:室温</td></tr>ピ<tr><td>ペッター(マルチチャンネル)</td><td>Ranin</td><td>17013803</td><td>Pipet-LiteマルチピペットL8-20LS +、2〜20&micro;L 保管温度と条件: 室温</td></tr>ピ<tr><td>ペッター (シングルチャンネル)</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>F144802G</td><td>ギルソンピペットマンクラシックピペット、1 〜 10&マイクロ;L 保管温度と条件:室温</td></tr>ピ<tr><td>ペッター(シングルチャンネル)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>F123600</td><td>ギルソンピペットマンクラシックピペット、2〜20&マイクロ;L 保管温度と条件:室温</td></tr><tr><td>ピペッター(シングルチャンネル)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>F123601</td><td>ギルソンピペットマンクラシックピペット、20〜200&micro;L 保管温度と条件:室温</td></tr>ピ<tr><td>ペッター(シングルチャンネル)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>F123602</td><td>ギルソンピペットマンクラシックピペット、200〜1000&micro;L 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>プレートシールフィルム</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Microseal "B&rdquo;PCRプレートシーリングフィルム、接着剤、光学 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>プレートスピナー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14-100-141</td><td>フィッシャーブランドミニプレートスピナー遠心分離機、230 V 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>プレフードフィルター</td><td>USA Scientific</td><td>4235-3724</td><td>AirCleanシステム用プレフィルター ワークステーション 保存温度と条件:部屋温度</td></tr><tr><td>Rソフトウェア</td><td>統計計算のためのRプロジェクト</td><td>該当なし</td><td>Rバージョン4.2.2 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>スケール</td><td>サーモフィッシャー</td><td>01-922-329</td><td>オーハウス30430060 PRシリーズ 分析天びん 容量62g 容量 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>オフィスデポ</td><td>458612</td><td>オフィスデポブランドはさみ、8インチ、ストレート、ブラック、2 のパック 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>シャーピー</td><td>シャーピー</td><td>2151734</td><td>ブラシツイン油性マーカー、ブラック 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>シングルコピー遺伝子フォワードプライマー統合</td><td>DNAテクノロジー</td><td>カスタム</td><td>別の表を参照してください 保管温度と条件:マイナス20°C;C 再水和時</td></tr><tr><td>シングルコピー遺伝子リバースプライマー</td><td>統合DNA技術</td><td>カスタム</td><td>別表を参照してください 保存温度と条件:マイナス20°C;C 再水和時</td></tr><tr><td>スモールチューブラック</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21-402-17</td><td>サーモフィッシャー 8601 リバーシブルマイクロチューブラック 蓋付き 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>J63560.EQE</td><td>3M NaOAc pH 5.2 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>ステンレス鋼 スパチュラ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3990240</td><td>Bel-Art SP 科学器具 ステンレス製サンプリングスプーンとスパチュラ 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>SYBR グリーン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>S7563</td><td>SYBRグリーンI核酸ゲルステイン&ndash;DMSO 10,000倍濃縮物 保存温度と条件: マイナス 20 °C;C 再水和</td></tr>シ<tr><td>リンジフィルター</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-927-55A</td><td>GD/X 25 mm 滅菌シリンジフィルター、酢酸セルロースろ過媒体、0.2 &mu;m 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Thermo Fisher</td><td>148232A</td><td>BD Luer-Lok使い捨てシリンジ(針なし)、10mL 保存温度と条件:室温</td></tr>TE<tr><td>バッファー</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2474100</td><td>TEバッファー、Tris-EDTA、1X Solution、pH 7.6、Molecular Biology、Fisher BioReagents 保存温度と条件:室温</td></tr><tr><td>テロメアフォワードプライマー</td><td>統合DNA技術</td><td>カスタム</td><td>別表を参照してください 保存温度と条件:マイナス20°C;C 再水和テロ</td></tr><tr><td>メアリバースプライマー</td><td>統合DNA技術</td><td>カスタム</td><td>別表を参照してください 保存温度と条件:マイナス20°C;C 再水和時</td></tr><tr><td>UV ライト</td><td>USA Scientific</td><td>4288-2540</td><td>ワークステーション用紫外線電球 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>ボルテック</td>ス <td>サーモフィッシャー</td><td>14-955-151</td><td>フィッシャーブランド ミニ ボルテックス ミキサー、115 V、50/60 Hz 保存温度と条件: 室温</td></tr><tr><td>計量ボート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>01-549-752</td><td>フィッシャーブランド滅菌六角形計量ボート、10mL 保管温度と条件:室温</td></tr></tbody></table>

モノクロマルチプレックス定量的pcrテロメア長さ測定 

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

表4および表5に示す結果は、プロトコルに従うことによって得られた再現性の高いTL測定の例を示しています。これらの結果を得るために、メーカーのガイドラインに従って、市販のキットを使用して24の末梢血単核細胞(PBMC)サンプルからDNAを抽出しました。これらの 24 個のサンプルを 2 つの 96 ウェルプレートで分析しました。すべてのDNAサンプルは、分光光度計と蛍光光度計を使用して、平均260/280比、平均260/230比、およびdsDNA濃度を使用して品質をチェックし、アッセイの適格性とサンプル希釈係数を決定しました(表6)。表6は、分光光度計を使用して測定されたDNA濃度とは異なる可能性のあるdsDNA濃度を定量化することの重要性も強調しています。このばらつきは、定量化に対するさまざまなアプローチの結果です。具体的には、分光光度計は280 nmでの吸収に基づいてDNA濃度を導き出し、吸光度の読み取りに影響を与える汚染物質(タンパク質、塩など)による変動の影響を受けやすいです。対照的に、蛍光光度計を使用して測定されたdsDNA濃度は、dsDNAに特異的に結合する色素の蛍光によって決定されるため、DNA含有量をより正確に反映していると推定されます。DNAサンプルは、MMqPCR TL分析の前に最大3回の凍結融解サイクルを経験しました。コントロールDNAは、1人の個人からのPBMCのプールDNA抽出から作成され、これを使用してDNAの2 ng/μLから0.0313 ng/μLまでの7点段階希釈を作成しました。PCR Step 9(テロメアアンプリコン)およびステップ 12(このプロトコルではシングルコピー遺伝子アンプリコン、アルブミン)用に作成された独立した標準曲線を図 6A、B に示します。アッセイは市販のリアルタイムPCR検出システムで実行され、図8に示すように、個々のアンプリコン製品が異なる温度で生成されることを示す融解曲線が生成されました。
表4:最適な代表的な結果を得るためのMMqPCR測定からの出力データ。 24 サンプルの平均 T/S 比、SD、CV、Z スコア TL。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%204_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表5:テロメア長データ出力。 MMqPCRアッセイの生データは、ソフトウェアで解析され、 その後、Supplementary File 1として添付されているスプレッドシートテンプレートに追加され、さらなる解析とQCが可能になります。このTLテンプレート出力シートは、データの概要を示し、両方のプレートにわたる各サンプルのサンプルID、平均TL、SD、およびCVを表示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%205_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表6:サンプル結果の分光光度計と蛍光光度計のDNA品質指標。 重複する分光光度計分析とdsDNAおよびサンプルごとの汚染物質の特異蛍光光度計測定からのQCデータ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%206_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig08.jpg"> 図8:メルトカーブの例。 ソフトウェアで生成されたサンプルデータのメルトカーブ。前のピーク ~80 °C はテロメアアンプリコンを表し、~89 °C のセカンダリピークはアルブミンアンプリコンを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このプロジェクトでは、すべての実行で平均テロメア効率は90.7〜102.1の範囲で98.6%、平均アルブミン効率は93.6〜108.2の範囲で102.3%でした。標準曲線から平均 0.97 回の繰り返しが除去されており、これはこのプロトコルの QC 基準を満たしています。平均プレート間CVは1.83%でSDは0.00616、平均プレート内CVは3.78%でSDは0.00658でした。これらの代表的なサンプルの平均TLを表4および表5に示します。 平均TLは1.37で、SDは0.24、範囲は0.84〜2.32でした。サンプルあたりのT/S比、SD、CV、およびZスコアTLを表4に示します。MMqPCR アッセイの T/S 比出力は TL の相対測定値であるため、研究間の比較を可能にするために、比率をこの Z スコアに変換しました。このプロジェクトのICCは、バッチ効果と実行効果20を考慮して、補足ファイル2にあるTRNガイドラインで説明されているように、Rスクリプトを使用して計算されました。プロジェクト内ICCを計算するために、通過したサンプルの10%を再実行し、コホートの各プレートから少なくとも1つのサンプルをICCプレートに確実に配置しました。プロジェクト全体のICCが0.801 [CI: 0.703, 0.86]であることは、TL結果の高い再現性を示しています。
すべての結果が最適になるわけではありません。 図9および 表 7の結果は、MMqPCRアッセイの結果が最適ではないことを示しています。 図9は、テロメア効率が90%未満で、QC基準を下回っている標準曲線を示しており、プレート全体を繰り返す必要があります。プライマー効率の問題は、通常、試薬の問題によるものであるため、試薬の有効期限と有効期限を追跡することは、どの試薬が低効率の原因であるかを判断するための最初のステップとして重要です。期限切れの試薬は、プレートを再度実行する前に交換する必要があります。 表 7は、初期のサンプルレベルのQC基準を満たしたプレートを示していますが、プレート間のばらつきが大きいため、プレートレベルのQC失敗につながっています。プレート間のばらつきは、通常、ピペッティングとプレート充填技術のエラーによるものです。この場合、技術者はプレートのセットアップ中に発生した問題を評価し、ピペットが校正されていることを確認する必要があります。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig09.jpg"> 図 9: 最適でない結果。 ソフトウェアに表示されたこの標準曲線は、テロメアプライマーの増幅効率が90%未満であったため、QCに合格しませんでした。画像はP1のものですが、P2も同様に効率が低かったです。この分析のデータは使用できず、期限切れの原因試薬を交換した後、すべてのサンプルを再度実行する必要がありました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 7: 最適でない結果。 この表は、多くのサンプルが QC 基準を満たさなかった分析のテロメアデータテンプレートを示しています。再分析が必要なサンプルはCV値に基づいて決定され、サンプル名は識別しやすいように赤いフォントに変更されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%207_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1: テロメアデータスプレッドシートテンプレート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%201.%20MMqPCR%20Template_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2: ICC計算。このプロトコルは、テロメア研究ネットワーク(TRN)によって作成されました。このファイルは20から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%202.%20ICC%20Calculation_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3: TRN レポートのガイドライン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%203.%20TRN%20Reporting%20Guidelines_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

モノクロマルチプレックス定量的PCRテロメア長さ測定 

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monochrome-multiplex-quantitative-pcr-telomere-length-measurement

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