Name: 横隔膜運動ニューロンの変性と補償の定量的バイオマーカーとしてのラット横隔膜運動ユニット接続性結果測定の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 学ぶラット横隔膜運動ユニット接続性の定量的評価法。MuNI技術を用いて神経筋障害における補償メカニズムを非侵襲的に長期的に評価し、呼吸運動系の可塑性を解明する手法です。

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すべての手順は、ミズーリ大学の動物管理および使用委員会によって確立されたガイドラインに従って承認および実施されました。実験は、11〜15週齢の成体の雄Sprague-Dawleyラットで行われました。これらのラットはペアで飼育され、12:12の明暗サイクル下に置かれ、標準的な市販のペレット食品とHCl処理水が常に利用可能でした。
1.動物の準備と麻酔の分娩
<ol><li>ネズミを取り扱うときは、適切な個人用保護具を着用してください。</li>
	<li>吸入麻酔薬に3〜5%イソフルランを投与し、適切な導入を確保します。ラットが適切に麻酔されたら、仰臥位に置き、1〜3%の吸入イソフルランで麻酔を維持します。.鉗子を使用して後肢の足パッドに優しく圧力をかけ、離脱反応がないことを確認して、麻酔の深さの十分性を確認します。 注:ラットのサイズと体重に基づいて、麻酔の深さを監視し、それに応じてイソフルラン濃度を調整します。</li>
	<li>サーモスタット加温プレートを使用して温度を37°Cに維持し、CMAPの振幅と遅延に影響を与える可能性のある温度の変動を防ぎます。</li>
	<li>乾燥を防ぐために、獣医用石油ベースの軟膏を目に塗ります。呼吸数を観察し、鉗子でフットパッドに圧力をかけたときの離脱反応を確認することにより、麻酔の深さを監視します。</li>
	<li>バリカンを使用して研究する胸と首の下3分の1から毛を取り除きます。実験全体を通してラットの呼吸を監視します。 注:CMAPとMUNEの記録と麻酔の中止に続いて、ラットが十分な意識を取り戻すまで放置しないでください。.完全に回復するまで、動物をホームケージに戻さないでください。</li>
</ol>2. 電極の配置とセットアップ
<ol><li>図1に示すように、28Gモノポーラ針電極のペアを配置して、CMAP、SMUP、およびMUNEを記録します。<ol><li>アクティブ (E1) 針電極を鎖骨中央線上 (最後の肋骨境界より下) に皮下に配置し、参照 (E2) 針電極をキシフス プロセスと最後の胸骨軟骨との間の角度に皮下に配置します。 注:針電極は横隔膜の筋肉に挿入しないでください。代わりに、それらは皮下領域に配置する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>頸動脈シートでの横隔神経の刺激には、神経刺激の陰極および陽極として一対の 28 G 単極針電極を使用し、前斜筋と中斜筋の間の外側頸部に皮下に配置され、約 1 cm 離れて配置されます。刺激針の配置が4番目の頸椎(C4)の下のレベルにあることを確認してください。 注意: 横隔神経やその他の構造の損傷を避けるために、刺激電極を深く挿入しすぎないでください。 図1 は電極の配置を示しています。</li>
	<li>接地電極は、テールに使い捨ての表面電極を配置します。</li>
</ol>3. データ取得
<ol><li>フレニックCMAP<ol><li>横隔神経を刺激するために、持続時間が0.1ミリ秒、強度が60〜100mAの範囲の単相陰極方形波パルスを適用することにより、横隔膜CMAP応答を記録します。</li>
		<li>刺激強度を徐々に増加させながら、応答の振幅がそれ以上の増加を示さなくなるまで、CMAP応答を取得します。超最大刺激を確保するには、刺激強度を最大限引き出すために使用したレベルの約120%まで上げ、追加の応答を記録します。CMAP サイズが増えなくなった場合は、この応答を最大 CMAP と見なします。 注:呼気中に刺激を与えることは、CMAP記録中の同時筋活動ノイズを最小限に抑えるために望ましいです。</li>
		<li>CMAPのピークツーピーク振幅をミリボルト(mV)単位で測定し、文書化します(図2)。 注:CMAP振幅は、塩基間およびピーク間およびピークtoピークで評価できます。臨床電気診断システムは、多くの場合、等電基基から最初の負のピークまで計算される塩基間評価がデフォルトになります。</li>
	</ol></li>
	<li>平均シングルモーターユニット電位(SMUP)サイズとMUNE計算<ol><li>インクリメンタル刺激技術を使用して平均SMUPサイズを計算します。<ol><li>漸進的な応答を引き出すには、1 Hzの周波数で0.1 msの持続時間で最大以下の刺激を投与し、最小限のオールオアナッシング応答が達成されるまで0.03 mA刻みで強度を徐々に増加させます。2mA〜10mAの範囲の刺激強度で初期応答を取得します。</li>
			<li>刺激強度が2mAから10mAの間で初期応答が起こらない場合は、刺激カソードの位置を変更し、首の横隔神経から近づけるか遠ざけるかして、必要な刺激強度をそれぞれ減らしたり増やしたりします。</li>
			<li>最初の増分応答が 2 mA から 10 mA の範囲の刺激強度で達成された場合は、最初の応答を保存し、0.03 mA の増分で調整して、段階的に高い刺激強度で追加の増分を取得し、ステップ 3.2.2 の次の基準を満たす合計 9 つの追加増分を達成します。 注: 各 SMUP は、前の増分から各増分を差し引くことによって定量化されます。</li>
		</ol></li>
		<li>増分応答を測定する際には、各増分が次の基準を満たしていることを確認してください。<ol><li>増分応答の最初の負のピークが、最大CMAP応答の負のピークと時間的に整列していることを確認します。 注:呼吸周期からのバックグラウンドノイズによって観察されるわずかな動きは、実験の性質に固有のものです。しかし、ライブ観測中にSMUPが一貫して存在することで、その特定のCMAPに対するSMUPのアイデンティティが確認されます。</li>
			<li>横隔膜は呼吸に関与する動的な筋肉であるため、各呼吸サイクルがベースライン運動を誘発する可能性があります。したがって、3つの重複する応答間で一貫性を確認することにより、各増分応答の安定性と分画の欠如を確認します。 注:低振幅の誘発電位、特に最初のSMUPを呼吸活動によるバックグラウンドノイズと区別するには、警戒を怠らず、3〜4回の呼吸サイクルを観察することが重要です。また、精度のために、ピークがCMAPのピークと整列していることを確認してください。</li>
			<li>各増分が明確で、前の増分よりも大きいことを確認します。したがって、増分応答をリアルタイムで視覚的に区別し、以前に記録された増分に重なる応答を観察します。 注:各振幅での刺激の複数回の反復は、増分の一貫性と事前定義された基準への準拠を確保するために実施される場合があります。</li>
			<li>前述の基準で各インクリメントを目視で確認した後、インクリメント振幅が少なくとも25μVであることを確認してください。増分が25 μV未満の場合は、測定値を破棄し、応答を再評価します。</li>
			<li>10 個のインクリメンタル応答を記録した後、各インクリメント応答の振幅が 10 個すべてのインクリメントの合計振幅の 3 分の 1 を超えないことを確認します。これは、最終応答の合計振幅を表します。この基準が満たされない場合は、10の増分応答の測定を繰り返します。 注:3分の1のしきい値は、各増分応答が単一のモーターユニットの活性化を表すという仮定に基づいています。任意の増分応答の振幅が、10個の増分すべての合計振幅の3分の1を超える場合、その応答が単一の運動ユニットの活性化のみに起因するものではない可能性があることを示唆しています。それどころか、それは、追加の運動ユニットの動員や、電気ノイズや人工物22,26のような非特異的な活動の存在によって影響を受ける可能性がある。</li>
			<li>SMUP の平均振幅を推定するには、10 個の増分の値を平均化します。平均SMUP振幅を測定する別の方法は、最終インクリメンタル応答の全振幅をインクリメント11の総数で割ることである。</li>
		</ol></li>
		<li>最大 CMAP 振幅 (ピークツーピーク) を平均 SMUP 振幅 (ピークツーピーク) で割って MUNE を求めます。特定の電気生理学的システムでは、SMUPはマイクロボルト(μV)で記録されますが、CMAPは通常ミリボルト(mV)で表されます。必要に応じて、MONE を計算する前に、CMAP と SMUP の測定値を同じ単位に変換します。 注:ピークツーピークCMAP、平均SMUP、およびMUNEは、通常、クリニックの筋電図システムによって自動的に計算されます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66568/66568eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> CMAP = 複合筋活動電位 SMUP = 単一モーターユニット電位 MUNE = Motor Unit Number Estimation</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>神経変性のげっ歯類モデルにおける横隔膜運動単位機能の定量化

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<li>Boriek, A., Rodarte, J., Reid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+and+tension+distribution+of+the+passive+rat+diaphragm%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Shape and tension distribution of the passive rat diaphragm.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 280, R33-R41 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2 mLガラスシリンジ</td><td>ケントサイエンティフィックコーポレーション</td><td>SOMNO-2ML</td><td></td></tr><tr><td>50 mL、モデル 705 RN シリンジ</td><td>ハミルトン社</td><td>7637-01</td><td>胸膜内注射の実施に利用</td></tr><tr><td>5008 - フォーミュラブダイエット</td><td>ラボダイエット</td><td>0001325</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ可能な 26 G 針 (26S RN 9.52 mm 40&deg;)</td><td>ハミルトン</td><td>カンパニー7804-04</td>胸<td>腔内注射を行うために利用</td></tr>コ<tr><td>レラ毒素Bサブユニット(CTB)</td><td>MilliporeSigma</td><td>C9903</td>サポリン(CTB-SAP)に結合した生存運動ニューロンコレラ毒素Bサブユニット<td>をラベル付けるための胸膜内注射に利用</td></tr>サ<tr><td>ポリン(CTB-SAP)に結合した</td><td>高度なターゲティングシステム</td><td>IT-14</td>運動<td>ニューロン死を引き起こす胸腔内注射に利用</td></tr> 取り外し可能な<tr><td>ケーブル</td><td>Technomed</td><td>202845-0000</td><td>レコーダー電極を電気診断機に接続する</td></tr><tr><td>リード線付き使い捨て 2" x 2" ディスク電極</td><td>Cadwell</td><td>302290-000</td><td>接地電極</td></tr><tr><td>使い捨てモノポーラ針 28 G</td><td>Technomed</td><td>202270-000</td><td>カソードおよびアノード刺激電極-記録電極</td></tr><tr><td>EMG 針ケーブル (アンプ/スティム スイッチ ボックス)</td><td>Cadwell</td><td>190266-200</td><td>モノポーラ電極を電気診断刺激装置に接続するには</td></tr><tr><td>鉄ベース付きヘルピングハンズワニ口クリップ</td><td>ラジオシャック</td><td>64-079</td><td>記録電極の配置を維持する&nbsp;</td></tr><tr><td>イソフルラン(250mLボトル)</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>monoject湾曲先端灌漑シリンジ</td><td>Covidien</td><td>81412012</td><td>電極ゲルのアプリケーションに利用</td></tr><tr><td>PhysioSuite RightTemp Homeothermic Warming</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>PS-RT</td>付き生理学的モニタリングシステム 赤外線<td>加温パッド、直腸プローブ、パッド温度プローブ</td></tr><tr><td>Proトリマーペットが含まれていますグルーミングキット</td><td>オスター</td><td>078577-010-003</td><td>脱毛用バリカン</td></tr><tr><td>サポリン (SAP)</td><td>アドバンスト ターゲティング システム</td><td>PR-01</td><td>胸膜内注射に利用 (単独で注射した場合の制御剤)</td></tr> <tr><td>Sierra Summit EMG システム</td><td>Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA</td><td></td><td>ポータブル電気診断システム</td></tr><tr><td>SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System</td><td>Kent ScientificCorporation</td><td>SOMNO</td><td>には、こぼれ防止、防湿ボトルトップアダプターが含まれています。Yアダプターチューブ;炭掃気</td></tr><tr><td>フィルターSprague-Dawleyラット</td><td>Envigoコロニー208a、インディアナポリス、インディア</td><td></td><td></td>ナ州</tr><tr><td>獣医石油ベースの眼科軟膏&nbsp;</td><td>Puralube</td><td>26870</td>は<td>、角膜の損傷を避けるために麻酔中に適用されます</td></tr></tbody></table>

横隔膜運動ニューロンの変性と補償の定量的バイオマーカーとしてのラット横隔膜運動ユニット接続性結果測定の評価

Assessing Rat Diaphragm Motor Unit Connectivity Outcome Measures as Quantitative Biomarkers of Phrenic Motor Neuron Degeneration and Compensation

このレポートで概説されているCMAP、SMUP、およびMUNE技術は、低侵襲電極配置を使用して横隔膜筋の神経筋機能の記録を可能にします(図1)。振幅と面積のパラメータを使用して、最大CMAPサイズを特徴付け、筋肉群の出力の全体的な尺度を提供できます(図2)。しかし、現在の方法では、CMAPとSMUPの両方のサイズを定量化するために振幅に依存しています。CMAP、SMUP、およびMUNEは、神経筋疾患のさまざまなラットモデルで神経筋機能を測定するために利用できます。MN変性の文脈でMU損失を実証するために、ラットは横隔膜性MNおよび追加のCTB(25μg)を標的とするためにCTB-SAP(25μg)を両側胸腔内注射を受け、対照ラットは非抱合型CTB(25μg)およびSAP(25μg)を投与された1,27。
図3では、CTB-SAP胸腔内注射の7日後の成体対照ラットと成体ラット(12週間)の所見を比較しています。CTB-SAP の胸腔内注射後、MUNE は、対照ラットの 74 の機能的な運動単位の正常な所見と比較して、60 の推定機能運動単位で減少します。しかし、CTB-SAPラットのCMAP振幅(14.25 mV peak-to-p)は、対照(14.5 mVピークtoピーク)と比較して最小限の変化を示しました。これは、おそらく付随的な発芽によるものでした。図 4 では、ダイアフラム CMAP、SMUP、および MUNE を両側から取得し、ベースライン/注入前 (n = 14)、注射後 7 日(n = 14)、14 日(n = 14)、21 日(n = 6)、および 28 日(n = 14)で平均化しました。図 4 では、グループ間のベースラインの差は見つかりませんでした。MUNEは、CTB-SAPラットにおいて、時間(p &lt; 0.05)、CTB-SAP(p &lt; 0.001)、および相互作用時間 x CTB-SAP(p &lt; 0.01)に有意な変化を示し、MNEは~40%減少しました。CTB-SAPラットの平均SMUPは、時間(p &lt; 0.05)およびCTB-SAP(p &lt; 0.01)とともに有意な変化を示しましたが、SMUP振幅の50~60%の増加による有意な相互作用はありませんでした。CMAPには大きな変化は見られませんでした。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig01.jpg"> 図1:電極の配置。 (A)刺激陰極と(B)陽極は、約1cm離れた前斜角筋と中斜筋の間の外側頸部に皮下挿入されます。(C)「アクティブ」電極(E1)および(D)「参照」記録電極(E2)は、剣状突起と最後の肋骨軟骨との間の角度に従って、最後の肋骨境界より下の鎖骨中線上に配置されます。さらに、(E)は、アーティファクトを最小限に抑えるために、地面として尾部に使い捨てのディスク電極が配置されています。BioRender.com で作成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig02.jpg"> 図2:複合筋活動電位。 左半横隔膜の筋肉から記録された代表的なCMAP応答の図。CMAPのピークtoピーク振幅は、負のピーク電圧から正のピーク電圧まで決定されます。略語:CMAP = Compound muscle Action Potential。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig03.jpg"> 図3:CTB-SAP胸腔内注射の7日後の対照ラットと成体ラットからの2つの代表的なCMAPおよびMUNE記録(A)ピークツーピーク振幅14.5mVの対照成体ラット(12週齢)の左横隔化合物筋活動電位(CMAP)。画面感度 = 1 mV/分割、画面再生時間は 1 ミリ秒/分割。(B)合計振幅が1.940mVの後続の10個のインクリメンタル応答を10で割って、平均SMUPサイズ(0.194mV)を決定します。画面感度 = 0.2 mV/分割、掃引速度は 1 ms/分割。MUNE = 74 (MUNE=CMAP/平均 SMUP (14.5 mV/ 0.194 mV)) (C) CTB-SAP 注入の 7 日後の横隔 CMAP は、CMAP のピーク ツー ピーク振幅 14.25 mV にほとんど変化が見られませんでした。画面感度 = 1 mV/分割、掃引速度は 1 ms/分割。(D)合計ピークtoピーク振幅が2.360mVの10回以降のインクリメンタルレスポンスを10で割ると、平均SMUPサイズは0.236mVになります。画面感度 = 0.2 mV/分割、掃引速度は 1 ms/分割。したがって、計算されたMUNEは60でした。略語:CMAP =複合筋活動電位;MUNE = 運動単位番号の推定;CTB-SAP = サポリンに結合したコレラ毒素Bフラグメント;SMUP = 単一モーター単位電位。*電気刺激によって引き起こされるアーティファクトを示しています。電気刺激とCMAPの振幅のコントラスト、および増分応答のために、刺激の一部のみをグラフ化したことに注意することが重要です。ブラインドカラーのフレンドリーな色を使用して、アクセシビリティを向上させるための増分応答の視覚化を強化しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig04.jpg"> 図4:CTB-SAP後のCMAP、SMUP、およびMUNEの電気生理学的評価。 群間のベースライン差は認められなかった(CTB-SAP群と対照群の両方で11週齢の雄ラット7匹)。(A)CMAPには大きな変化は見られませんでした。(B)CTB-SAPラットの平均SMUPは、経時的(p &lt; 0.05)およびCTB-SAPあり(p &lt; 0.01)で有意な変化を示し、有意な相互作用はなく、SMUP振幅が50-60%増加したことを示している。(C) CTB-SAP 注射の 7 日後、平均 MUNE は 102.58 ± 20.54 から 72.43 ± 15.59 に 27.07% 大幅に減少しました (平均 ± SD)。この減少は持続し、28日後にさらに11.75%の減少となりました(MUNE:60.64 ± 11.33、p &lt; 0.01)。ベースライン、注射の7日後、14日後、および28日後のすべての測定値は、14匹のラットから得られ、n = 7匹のラットに抱合型CTB-SAPを注射し、n = 7匹のラットに非抱合型CTBとSAPを対照群として投与しました。21日目に6匹のラットを使用しました。CMAP、SMUP、および MUNE のデータは平均として示され、比較は二元配置分散分析を使用して実行されました。アスタリスクは、*p &lt; 0.05、**p &lt; 0.01) での違いを示します。略語:CMAP =複合筋活動電位;MUNE = 運動単位番号の推定;CTB-SAP = サポリンに結合したコレラ毒素Bフラグメント;SMUP = 単一モーター単位電位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Loss of ventilatory muscle function is a consequence of motor neuron injury and neurodegeneration (e.g., cervical spinal cord injury and amyotrophic ...

assessing-rat-diaphragm-motor-unit-connectivity-outcome-measures-as

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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