Name: 鶏の消化管からの嫌気性細菌の培養を強化するための戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: 学ぶ鶏の消化管からの嫌気性細菌の分離培養法。無菌的な嫌気性技術を用いて15属の細菌を分離し、ミオイノシトール代謝に関与する菌群を解明する方法です。家禽の腸内微生物叢理解に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>ニワトリ消化管における未培養微生物の多様性のための培養戦略

<ol><li>Wylensek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collection+of+bacterial+isolates+from+the+pig+intestine+reveals+functional+and+taxonomic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity.</a> Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).</li>
<li>Medvecky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+and+function+prediction+of+133+gut+anaerobes+isolated+from+chicken+caecum+in+pure+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Geno%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures.</a> BMC Geno. 19 (1), 561(2018).</li>
<li>Zenner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+immune+system+maturation+in+chickens+using+a+synthetic+community+of+cultured+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria.</a> mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).</li>
<li>Borda-Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+the+ileal+microbiota+of+phosphorus+and+calcium+utilization%2C+bird+performance%2C+and+gender+in+japanese+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail.</a> Animals. 10 (5), 885(2020).</li>
<li>Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+culture+through+selective+and+non-selective+conditions%3A+The+evolution+of+culture+media+in+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Micro+New+Infect%22%5BJournal%5D)">Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology.</a> New Micro New Infect. 34, 100622(2020).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hidden+pitfall+in+the+preparation+of+agar+media+undermines+microorganism+cultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).</li>
<li>Kawasaki, K., Kamagata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-catalyzed+hydrogen+peroxide+formation+from+agar%2C+gellan%2C+and+%CE%BA-carrageenan+and+recovery+of+microbial+cultivability+via+catalase+and+pyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate.</a> Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).</li>
<li>Kato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+previously+uncultured+slow-growing+bacteria+by+using+a+simple+modification+in+the+preparation+of+agar+media%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media.</a> Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).</li>
<li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).</li>
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<li>Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+phytase+superdosing%2C+myo-inositol+and+available+phosphorus+concentrations+on+performance+and+bone+mineralisation+in+broilers%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Nutri%22%5BJournal%5D)">Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers.</a> Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).</li>
<li>Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+high+dose+of+microbial+phytase+and+myo-inositol+supplementation+on+growth+performance%2C+tibia+mineralization%2C+nutrient+digestibility%2C+litter+moisture+content%2C+and+foot+problems+in+broiler+chickens+fed+phosphorus-deficient+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets.</a> Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).</li>
<li>Weber, M., Fuchs, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+in+the+niche%3A+A+large-scale+genome-based+survey+reveals+inositol+utilization+to+be+widespread+among+soil%2C+commensal%2C+and+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbio+Spect%22%5BJournal%5D)">Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria.</a> Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).</li>
<li>Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+transcriptional+regulation+of+myo-inositol+operon+in+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens.</a> FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).</li>
<li>Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+binding+affinity+of+repressor+IolR+avoids+costs+of+untimely+induction+of+myo-inositol+utilization+by+Salmonella+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium.</a> Sci Rep. 7 (1), 44362(2017).</li>
<li>Yebra, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+gene+cluster+enabling+Lactobacillus+casei+BL23+to+utilize+myo-inositol%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).</li>
<li>Zhang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+iol+clusters+in+Lactobacillus+casei+strains%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains.</a> World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).</li>
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<li>Relman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+bacterial+16s+rRNA+amplification+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Diag+Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing.</a> Diag Mol Microbiol. , 489-495 (1993).</li>
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<li>Gilroy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+microbial+diversity+within+the+chicken+gut+microbiome+revealed+by+metagenomics+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture.</a> PeerJ. 9, e10941(2021).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+gut+metagenome+and+the+modulatory+effects+of+plant-derived+benzylisoquinoline+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids.</a> Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microbial+genomes+and+gene+catalog+of+the+chicken+gut+from+metagenomic+sequencing+of+high-fidelity+long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads.</a> GigaScience. 11, 116(2022).</li>
<li>Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-resolved+metagenomics+of+the+chicken+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome.</a> Front Microbiol. 12, 726923(2021).</li>
<li>Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+melanoidins+from+a+glucose-glycine+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Food+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system.</a> Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).</li>
<li>Ferrario, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+the+cecal+microbiota+of+feral+chickens+by+culturomic+and+metagenomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).</li>
<li>Crhanova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+culturomics+shows+that+half+of+chicken+caecal+microbiota+members+can+be+grown+in+vitro+except+for+two+lineages+of+clostridiales+and+a+single+lineage+of+bacteroidetes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes.</a> Microorganisms. 7 (11), 496(2019).</li>
<li>Rubio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacilli+counts+in+crop%2C+ileum+and+caecum+of+growing+broiler+chickens+fed+on+practical+diets+containing+whole+or+dehulled+sweet+lupin+%28lupinus+angustifolius%29+seed+meal%5BTitle%5D)+AND+%22British+Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal.</a> British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).</li>
<li>Bjerrum, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+composition+of+the+ileum+and+cecum+of+broiler+chickens+as+revealed+by+molecular+and+culture-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques.</a> Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>VWR</td><td>20104.334</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>VWR</td><td>97064-332</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>カール・ロス</td><td>P726.1</td><td></td></tr><tr><td>嫌気性ステーション</td><td>ドン・ホイットリー・サイエンティフィック</td><td>A35 HEPA</td><td></td></tr><tr><td>酪酸</td><td>メルク</td><td>8.0045.1000</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>チキンリゾチーム(ムラミダーゼ)</td><td>VWR</td><td>1.05281.0010</td><td></td></tr><tr><td>システイン</td><td>VWR</td><td>97061-204</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>VWR</td><td>90000-908</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム水素</td>カール<td>ロス</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>カールロス</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Legehennen/ Junghennenfutter</td><td>Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, D&uuml;ドイツ、ッセルドルフ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>MagAttract HMW DNA Kit</td><td>Qiagen</td><td>67563</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>混合ガス (80% N2 (品質レベル 5.0)、15% CO2 (品質レベル 3.0) および 5% H2 (品質レベル 5.0))</td><td>Westfalen Gase GmbH,</td><td></td> Germany-Mutanolysin<td></td></tr><tr><td>, 組換え(凍結乾燥物)</td><td>A&バイオテクノロジー</td><td>1017-10L</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>カール・ロス</td><td>4191.2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>ChemSolute</td><td>8418.01</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>カール・ロス</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>カール・ロス</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2671</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A&nbsp;</td><td>キアゲンリボヌクレアーゼA(RNase A)&nbsp;</td><td>19101</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>VWR27800.291</td><td></td><td></td></tr>レ<tr><td>サズリンナトリウム</td><td>VWR85019-296</td><td></td><td></td></tr>チ<tr><td>オグリコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102933</td><td></td></tr><tr><td>大豆ペプトン、GMOフリー、アニマルフリーVWR</td><td></td><td>97064-186</td><td></td></tr>サー<tr><td>モサイクラー</td><td>バイオラッド</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>カールロス</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>カール・ロス</td><td>9139.2</td><td></td></tr><tr><td>ビタミン ミックス (サプリメント)</td> <td>VWR</td><td>968290NL</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>スター ラボ</td><td>07127/92930</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>カール ロス</td><td>9257.05</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-D-フルクトース</td><td>VWR</td><td>53188-23-1</td><td></td></tr></tbody></table>

鶏の消化管からの嫌気性細菌の培養を強化するための戦略

Strategies to Enhance Cultivation of Anaerobic Bacteria from Gastrointestinal Tract of Chicken

輸送中の嫌気性状態のモニタリング ナトリウムレサズリンの添加により、サンプルをチューブに移す前に輸送溶液の色がピンク色に変化することは、嫌気性条件の維持の中断または失敗を示しています。そのため、図 2に示すように、色の変化を示すチューブは輸送中に使用せず、色の変化がないチューブのみを使用しました。
シーケンシング結果の解析 バックグラウンドノイズが大きすぎる、ベースラインに乱れがあるクロマトグラムデータ、シグナル強度が低いピーク、単一位置に複数のピークまたは重なり合うピークが存在する、ピーク高さが一貫していない分離株の DNA 抽出は、サンプルの汚染、増幅の不均一、またはシーケンシングプロセス中の問題を示すため、新鮮で純粋な培養を使用して繰り返しました。NCBIでBLAST検索を実行すると、最も高いパーセントの同一性と高いクエリカバーを示す株は、分離株の同定につながる私たちの分離株に関連する株でした。
広範囲の嫌気性細菌の培養 嫌気性細菌の単離により、5つの異なる培地で600を超える分離株が得られ、別々のボトルで調製および滅菌されました。16S rRNA遺伝子を用いた同定により、15種類の細菌属が誕生しました(図4)。分離株の総数のうち、半数以上が厳密な嫌気性細菌を表し、残りは通性嫌気性細菌です。
分離株の多様性には8つの菌株が含まれ、 Clostridiaceae、 Lactobacillaceae 、 およびOscillospiraceae 科のメンバーに関連する新しい分類学的種を示しています(表5)25。これらの結果は、培養研究を成功させるために、培地の調製と多様な培地の使用におけるグッドプラクティスを遵守することの重要性を強調しています。
ターゲット分離 最小寒天培地でのコロニーの観察は、MIを炭素源として利用できる嫌気性細菌が存在する可能性を示唆しています(図5)。これらの知見を遺伝子レベルで決定的に確認するために、全ゲノムシークエンスによる網羅的な解析を行うことができます。このシーケンシングアプローチにより、iolA、iolB、iolC、iolD、iolE、iolF、iolG、iolH、iolI、iolJ、iolT、 iolWなど、MI代謝に関連する、またはMI代謝に寄与する特定の遺伝子を同定できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig01.jpg"> 図1:嫌気性細菌培養のためのGIT切片のサンプリングと輸送のプロセス 1)切片は切断前にクランプで閉じられます。点線は推奨されるカット位置を示しています。2)サンプリングされたセクションを輸送溶液で満たされたハンゲートチューブに移します。3)嫌気性状態を維持するために輸送液を注入することにより、空気雰囲気を置き換えます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig02.jpg"> 図2:ニワトリの回腸切片から採取したサンプルを含むハンゲートチューブの図。 この画像は、ハンゲートチューブに輸送溶液を適切に充填し、サンプルを持たないコントロールと比較して、空気空間がなく、一貫した色が維持されていることを示しています。サンプルチューブ内の顕著な濁りは、消化物の溶解に起因します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig03.jpg"> 図3:嫌気性細菌の保存における一連のステップ1 )等張溶液中での24時間から48時間の無酸素培養物へのバイオマス収穫。2)遠心分離と上清の除去のプロセスによる細菌細胞の洗浄により、残った培地を取り除きます。3)洗浄プロセスの繰り返し。4)ペレットを培地と50%グリセロール溶液に溶解した後、滅菌クライオバイアルで-80°Cで保存します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig04.jpg"> 図4:属レベルでの単離された細菌の分類学的分布。 積み上げ棒グラフは、5つの異なる培地製剤から単離された細菌の多様性を示しており、この研究で多様な培地製剤を使用することの有益な影響を強調しています。培地の組成を 表1に示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig05.jpg"> 図5:最小限の寒天培地上の嫌気性細菌コロニー。 39°Cでの24時間のインキュベーション後、最小限の寒天培地で繁殖する嫌気性細菌コロニー。 コロニーの発達は、他の炭素源の中でも主要な炭素源としての ミオイノシトールの潜在的な同化を示唆しています。(A)10-1の2つの希釈が提示され、コロニー数がそれらの豊富さのために実用的な列挙を上回っていることが明らかになります。(B)10-2、識別可能な可算コロニーを表示し、選択的分析を容易にします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">メディア</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>ペプトンメディア</td>
			<td>多糖類メディア</td>
			<td>短い脂肪酸培地</td>
			<td>炭水化物メディア</td>
			<td>硫化還元細菌(SRB)培地</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Cのソース</td>
			<td>デキストロース 0.2%</td>
			<td rowspan="2">家禽の飼料(2%)</td>
			<td rowspan="2">酢酸0.17%、イソ吉草酸0.01%、プロピオン酸0.2%、酪酸0.2%</td>
			<td rowspan="2">デキストロース 5%</td>
			<td rowspan="2">Na-DL-乳酸、アスコルビン酸</td>
		</tr><tr><td>でんぷん 0.05%</td>
		</tr><tr><td>Nのソース</td>
			<td>大豆由来のアミノ酸 (1%)</td>
			<td>-</td>
			<td>トリプトンからのアミノ酸と肉抽出物(0.1%)</td>
			<td>大豆ペプトン(0.1%)、(NH4)3 クエン酸塩(0.1%)からのアミノ酸</td>
			<td>NH4Cl (0.1%)</td>
		</tr><tr><td>ミネラルの供給源</td>
			<td>K2HPO4 (0.05%)</td>
			<td>-</td>
			<td>K2HPO4 (0.05%)</td>
			<td>K2HPO4 (0.05%)</td>
			<td>K2HPO4 (0.05%)</td>
		</tr><tr><td>寒天</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
		</tr><tr><td>補因子 (滅菌後に添加)</td>
			<td>酵母エキス(0.1%)</td>
			<td>-</td>
			<td>ビタミンミックス(0.01%)</td>
			<td>ビタミンミックス(0.01%)</td>
			<td>酵母エキス(0.01%)</td>
		</tr><tr><td>阻害 剤</td>
			<td>何一つ</td>
			<td>何一つ</td>
			<td>トゥイーン80(1%)</td>
			<td>メナジオン (0.05%)</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>表1:広範囲の細菌単離のための培地の組成。 5種類の寒天培地の組成で、それぞれが炭素源、窒素源、ミネラル源、補因子や阻害剤の組み込みなどのバリエーションに基づいて独自に配合されています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>組成</td>
			<td>量(g / L)</td>
		</tr><tr><td>カゼインペプトン</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>大豆ペプトン</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>リン酸水素二カリウム</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>ミオイノシトール</td>
			<td>2.5</td>
		</tr></tbody></table>表2:濃縮培地の組成。複雑な成分をブレンドして設計された培地の処方で、幅広い細菌の増殖をサポートします。各成分の数量はg/Lで指定されています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>組成</td>
			<td>最小寒天培地(g / mL)/ L</td>
			<td>ミニマルブロス培地(g / mL)/ L</td>
		</tr><tr><td>L-シスチン</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr><tr><td>チオグリコール酸ナトリウム</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>リン酸水素ナトリウム二水和物</td>
			<td>0.53</td>
			<td>0.53</td>
		</tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td>
			<td>0.41</td>
			<td>0.41</td>
		</tr><tr><td>塩化アンモニウム</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr><tr><td>塩化カルシウム</td>
			<td>0.11</td>
			<td>0.11</td>
		</tr><tr><td>塩化マグネシウム</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>トリプトン</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>EDTAの</td>
			<td>0.00773</td>
			<td>0.00773</td>
		</tr><tr><td>微量元素溶液SL7</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>ビタミンミックス</td>
			<td>0.2</td>
			<td>0.2</td>
		</tr><tr><td>ミオイノシトール(20 mM)</td>
			<td>3.6</td>
			<td>3.6</td>
		</tr><tr><td>寒天</td>
			<td>15</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>pH (1 mM HCl を使用)</td>
			<td>6 ± 0.2</td>
			<td>6 ± 0.2</td>
		</tr></tbody></table>表3:最小限の培地組成。 この培地は、一次炭素源としてミオイノシトールを配合しています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>初期変性</td>
			<td>95°C</td>
			<td>4分間</td>
			<td>1倍</td>
		</tr><tr><td>変性</td>
			<td>95°C</td>
			<td>30秒</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>アニーリング</td>
			<td>52°C</td>
			<td>30秒</td>
			<td>30倍</td>
		</tr><tr><td>延長</td>
			<td>68°C</td>
			<td>90秒</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>最終拡張</td>
			<td>68°C</td>
			<td>10分間</td>
			<td>1倍</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表4:16S rRNA遺伝子増幅の最適条件。 ターゲット遺伝子の効率的な増幅のためにサーモサイクラーで採用される理想的な温度、持続時間、およびサイクリングパラメータ。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>新規タクソノミーの割当て</td>
			<td>ゲノムサイズ</td>
			<td>GCコンテンツ</td>
			<td>腸領域</td>
			<td>16Sアクセッション </td>
		</tr><tr><td>リモシラクトバチルス・ガリ</td>
			<td>1861581</td>
			<td>50.43</td>
			<td>実り</td>
			<td>OM760982</td>
		</tr><tr><td>リモシラクトバチルス・アビウム</td>
			<td>2158112</td>
			<td>48.49</td>
			<td>回腸</td>
			<td>OM760983</td>
		</tr><tr><td>リモシラクトバチルス・プーリ</td>
			<td>1924125</td>
			<td>45.87</td>
			<td>回腸</td>
			<td>OQ831033</td>
		</tr><tr><td>クロストリジウム・ブタノリプロデンス</td>
			<td>3507657</td>
			<td>28.34</td>
			<td>実り</td>
			<td>OQ831034</td>
		</tr><tr><td>Faecalispora anaeroviscerum</td>
			<td>2921858</td>
			<td>50.36</td>
			<td>回腸</td>
			<td>OM760984</td>
		</tr><tr><td>リモシラクトバチルス・インセラム</td>
			<td>1993658</td>
			<td>44.9</td>
			<td>回腸</td>
			<td>OM760986</td>
		</tr><tr><td>Ligilactobacillus hohenheimensis</td>
			<td>1381484</td>
			<td>50.47</td>
			<td>空腸</td>
			<td>OM760988</td>
		</tr><tr><td>リモシラクトバチルス・ディフィシリス</td>
			<td>1998683</td>
			<td>47.38</td>
			<td>回腸</td>
			<td>OQ832131</td>
		</tr></tbody></table>テーブル5。新規細菌種の分類学的同定。 この研究でニワトリの消化管から単離および同定された新規細菌種は、ゲノムサイズ、GC含量、切片、および16S rRNA遺伝子アクセッションとともに詳細に説明されています。このテーブルは25から変更されています。

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