Name: ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学ぶ ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築。膜タンパク質の再構成と酵素の脂質小胞封入により、自律的成長と情報伝達が可能な合成細胞を作成するプロトコルを解説します。

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著者らは、pBAD-PercevalHR遺伝子のクローニングを行ったAditya Iyer氏と、タンパク質の産生と精製を支援してくれたGea Schuurman-Wolters氏に感謝しています。この研究は、NWO重力プログラム「合成細胞の構築」(BaSyC)によって資金提供されました。

複雑な蛋白質ネットワークのための脂質小胞のカプセル化のプロトコール

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<li>Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+synthetic+biology+platform+for+emerging+industrial+biomanufacturing%3A+Bottom-up+pathway+design%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Syst+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design.</a> Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).</li>
<li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-target+and+glucose-responsive+polymersomes+toward+mimicking+endogenous+insulin+secretion+with+improved+hepatic+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).</li>
<li>Kanter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+production+of+scFv+fusion+proteins%3A+an+efficient+approach+for+personalized+lymphoma+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines.</a> Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).</li>
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<li>Sachsenmeier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industry+5.0-The+relevance+and+implications+of+bionics+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology.</a> Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).</li>
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<li>Godoy-Hernandez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+stable+membrane+reconstitution+by+LAiR+enables+the+study+of+physiological+integral+membrane+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions.</a> ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).</li>
<li>Sikkema, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+by+ionic+strength+and+safety+check+by+cyclic-di-AMP+in+the+ABC+transporter+OpuA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA.</a> Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).</li>
<li>Foucaud, C., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+transport+system+of+Streptococcus+thermophilus.+Functional+reconstitution+of+the+protein+and+characterization+of+the+kinetic+mechanism+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport.</a> J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).</li>
<li>Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+on+solubilization+and+lipid+reconstitution+of+Na%2CK-ATPase%3A+enzyme+kinetic+and+biophysical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization.</a> Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).</li>
<li>Simidjiev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+large%2C+ordered+lamellae+from+non-bilayer+lipids+and+integral+membrane+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).</li>
<li>Harris, N. J., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+stability+of+membrane+transport+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Folding and stability of membrane transport proteins in vitro.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).</li>
<li>Jackson, M. L., Litman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-egg+phosphatidylcholine+reconstitution+by+an+octyl+glucoside+dilution+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).</li>
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<li>Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Szoka, F., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+preparation+of+liposomes+with+large+internal+aqueous+space+and+high+capture+by+reverse-phase+evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation.</a> Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).</li>
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<li>Elias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+characterization+of+biomimetic+membrane+mechanics+with+an+on-chip+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Nano+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette.</a> Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).</li>
<li>Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+trapping+of+giant+unilamellar+vesicles+to+study+transport+through+a+membrane+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).</li>
<li>Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+Pressure+Enables+High-Yield+Assembly+of+Giant+Vesicles+in+Solutions+of+Physiological+Ionic+Strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths.</a> Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).</li>
<li>Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).</li>
<li>Setyawati, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+dynamically+interacting+integral+membrane+subunits+of+energy-coupling+factor+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters.</a> eLife. 9, e64389(2020).</li>
<li>Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+coffee+ring+effect+for+a+defect-free+electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+liposomes+from+spin-coated+films+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

サブマイクロメートルサイズの脂質小胞を含む(膜)タンパク質(proteoLUV)の合成、およびproteoLUVの巨大単層小胞(proteoGUV)への変換のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、他の膜タンパク質13,19,30,40の再構成、およびここに提示されているL-アルギニン分解およびグリセロール3-リン酸合成経路以外の代謝ネットワークのカプセル化に適用できるはずです。
リポソーム中の膜タンパク質の再構成は、一般に、脂質膜内のタンパク質のランダムな配向をもたらす。ArcDおよびGlptの場合、タンパク質は双方向に作用し、溶質は全電気化学ポテンシャルの符号に応じて移動するため、配向は重要ではありません。一方向に機能するタンパク質の場合、分子の向きが50/50の場合、分子の半分は活性に利用できません。
ポリカーボネートフィルターを介して小胞を押し出しると、サイズ分布が狭くなり、フィルターの細孔サイズが小さくなるほど小胞はより均一になります。ただし、小胞が小さいと、体積が小さくなり、小胞あたりのタンパク質(酵素、膜タンパク質)の数が非常に少なくなります。1つ以上の成分が欠落しているLUVの割合を最小限に抑えるために、タンパク質の濃度を 図3A、B に示すように調整することができますが、非常に小さな小胞では確率的影響が避けられません。
ゲル支援膨潤法は、乾燥したアガロース表面に超音波処理された小胞(SUV)を沈着させることに依存しています。乾燥プロセス中に、小胞の濃度勾配が形成され、脂質濃度はスポットの周辺で最も高くなります。これは、コーヒーステイン効果41,42として知られる現象によるものです。その結果、スポット内の小さな領域にのみ、GUV形成に適した脂質が濃縮されています。円形の不均一な濃度の脂質スポットは、小胞融合に利用できない大きな未使用領域をもたらします。したがって、このアプローチではGUV形成の効率は低くなります。GUVの収率を増加させるためには、スピンコーティング42またはコーヒーステイン効果41を活用することにより達成できる均一な脂質沈着を目指すべきである。
プロトコルに関するその他の注意事項:
確率的影響を避けるために、いくつかの膜タンパク質(>10)が小胞ごとに平均して再構成されるように注意する必要があります。したがって、脂質とタンパク質の比率が400:1 w/wを超えることは避けてください。ほとんどのタンパク質では、ランダムな配向が想定されています。
理想的には、全膜タンパク質の体積はできるだけ小さく、とにかくリポソーム体積の10〜20%を超えないようにします。より大きな容量を追加すると、より多くの界面活性剤が導入され、事前に形成されたリポソームの大部分が溶解する可能性があり、再構成効率に悪影響を与える可能性があります。
カプセル化中のコンポーネントの希釈を避けるために、押出機を適切な溶液で事前に平衡化することが重要です。理想的には、予備平衡化溶液には可溶性酵素も含まれている必要がありますが、押出機の予備平衡化に必要な量が比較的多いため、酵素を含めるとコストがかかりすぎる可能性があります。したがって、通常、これらの成分を省略し、酵素の5%希釈を受け入れます。
プロテオリポソームを含む混合物には、分子が疎水性が高く、小胞が存在しない場合に表面に吸着する可能性があるため、イオノフォアを添加する必要があります。溶媒の添加量が少ない(全反応量の<1%)ので注意が必要です。溶媒が小胞内の代謝ネットワークに影響を与えないことを確認するために、制御が行われます。約 1 μM のイオノフォア濃度は、一般に、~3 mg/mL の総脂質濃度に対して安全です。
液滴を完全に乾燥させるように注意する必要があります。液滴が十分に乾燥していないと、膨潤液を添加すると脂質が脂質凝集体を形成し、MLVが形成されるため、GUV形成の効率が低下します。
グルコースは、外部の浸透圧を内部媒体に一致させるために使用されます。後者にはグルコースの代わりにスクロースが含まれており、小胞の密度を高め、それによってGUVの沈降を促進します。さらに、外部環境中のグルコースは位相差を強め、小胞をより見やすくします。
確率的効果は、GUVではそれほど問題になりません。しかし、ここでは、表面と体積の比率が許容できないほど低くなり、膜タンパク質(トランスポーターなど)の数が内部代謝ネットワークにとって制限的になる可能性があります。このプロトコルに記載されている方法では、proteoGUVのサイズを正確に制御することはできませんが、大部分は5〜50μmのサイズ範囲に収まります。
結論として、ここで紹介する研究は、さまざまなサイズの脂質小胞における膜タンパク質の再構成と酵素カプセル化の包括的な概要を提供します。私たちは、ATPの合成のための機能小胞の構築と、アミノ酸やグリセロールなどの単純な前駆体からのビルディングブロックを実証しています。GUVにおける膜タンパク質の再構成は依然として困難ですが、ここで紹介するプロトコールは、ボトムアップ合成生物学研究のさらなる発展への道を開くものです。

ボトムアップ合成生物学の分野は、バイオテクノロジー3,4または生物医学目的5,6,7,8のための(最小限の)細胞1,2および代謝バイオリアクターの構築に焦点を当てています。合成細胞の構築は、研究者が天然環境のものを模倣した明確に定義された条件でタンパク質を研究(膜)することを可能にする独自のプラットフォームを提供し、タンパク質と反応ネットワークの創発的特性と隠された生化学的機能の発見を可能にします9。自律的に機能する合成細胞への中間ステップとして、代謝エネルギー保存、タンパク質および脂質合成、恒常性など、生細胞の本質的な特徴を捉えるモジュールが開発されています。このようなモジュールは、生命に対する理解を高めるだけでなく、医学8やバイオテクノロジー10の分野にも応用できる可能性がある。
膜貫通型タンパク質は、細胞内外で分子を輸送し、シグナルを送り、環境の質に応答し、多くの生合成の役割を果たすため、事実上あらゆる代謝ネットワークの中心にあります。したがって、合成細胞における代謝モジュールのエンジニアリングには、ほとんどの場合、内在性および/または末梢膜タンパク質を、特定の脂質と高い完全性(低透過性)で構成される膜二重層に再構成する必要があります。これらの膜タンパク質の取り扱いは困難であり、特定の知識と実験スキルが必要です。
リン脂質小胞内で膜タンパク質を再構成するためにいくつかの方法が開発されており、最も頻繁には、特定のタンパク質の機能11,12、調節13、速度論的特性14,15、脂質依存性15,16、および/または安定性17を研究する目的で開発されました。これらの方法は、脂質の存在下で界面活性剤可溶性タンパク質を水性媒体に迅速に希釈すること18、界面活性剤可溶化タンパク質を界面活性剤で不安定化した脂質小胞とインキュベートすることによる界面活性剤の除去、および界面活性剤のポリスチレンビーズへの吸収19、または透析またはサイズ排除クロマトグラフィー20による界面活性剤の除去を含む.有機溶媒は、例えば、油-水間相21の形成を介して脂質小胞を形成するために使用されてきたが、内在性膜タンパク質の大部分は、そのような溶媒に曝露されると不活性化される。
当研究室では、主に界面活性剤吸収法により膜タンパク質を再構成し、大単層小胞(LUV)19を形成する。この方法は、複数の膜タンパク質の共再構成および酵素、代謝物、およびプローブの小胞内腔へのカプセル化を可能にする22,23。膜タンパク質含有LUVは、電気形成24またはゲル支援膨潤25のいずれかを使用し、膜タンパク質26の完全性を維持するための特定の条件を用いて、水溶性成分のカプセル化の有無にかかわらず、巨大単層小胞(GUV)に変換することができる。
この論文は、L-アルギニンのL-オルニチンへの分解を通じてATPを再生する非平衡代謝ネットワークのLUVでの再構成のためのプロトコルを提示します27。ATPの形成は、リン脂質合成のための重要な構成要素であるグリセロール-3-リン酸(G3P)の産生と結合している22,28。代謝経路は、アルギニン/オルニチン(ArcD)とG3P/Piアンチポーター(GlpT)の2つの内在性膜タンパク質で構成されています。さらに、ATPのリサイクルには3つの可溶性酵素(ArcA、ArcB、ArcC)が必要であり、GlpKを使用してグリセロールをグリセロール3-リン酸に変換するために使用されます。L-アルギニンの分解からのATPを使用して、経路の概略図の概要については図1を参照してください。このプロトコールは、脂質やタンパク質の合成、または細胞の分裂など、さらに複雑な反応ネットワークを将来構築するための良い出発点となります。小胞の脂質組成は、多種多様な内在性膜タンパク質の活性をサポートし、小胞27,29,30の内外への多様な分子の輸送に最適化されている。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> 図1:ATP産生およびグリセロール3-リン酸の合成および排泄のための経路の概要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
要するに、精製された膜タンパク質(ドデシル-β-D-マルトシド、DDMに可溶化)を、Triton X-100で不安定化した予め形成された脂質小胞に添加することで、タンパク質を膜に挿入することができます。その後、活性剤分子は活性ポリスチレンビーズの添加によって(ゆっくりと)除去され、その結果、十分に密封されたプロテオリポソームが形成されます。次に、可溶性成分を小胞に添加し、凍結融解サイクルでカプセル化することで、膜融合の過程で分子を捕捉することができます。得られた小胞は非常に不均一であり、多くは多層です。次に、細孔径が400、200、または100nmのポリカーボネートフィルターを介して押し出され、より均一なサイズの小胞が得られます。細孔サイズが小さいほど、小胞はより均質で単層化されますが、その代償として内部容積が小さくなります。取り込まれていないタンパク質および低分子は、サイズ排除クロマトグラフィーによって外部溶液から除去されます。proteoLUVは、ゲルアシスト膨潤によってマイクロメートルサイズの小胞に変換することができ、これらのproteoGUVは、顕微鏡による特性評価と操作のためにマイクロ流体チップに収集およびトラップされます。 図2 は、完全なプロトコルの概略図の概要を示しています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> 図2:サブマイクロメートル(LUV)およびマイクロメートルサイズ(GUV)の脂質小胞に膜タンパク質を再構成し、酵素および水溶性成分をカプセル化するためのプロトコルの概要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
再構成およびカプセル化プロトコルは良好に機能し、タンパク質の機能は保持されますが、proteoLUVおよびproteoGUVのサイズは不均一です。マイクロ流体アプローチ31,32は、サイズがより均質なマイクロメートルサイズの小胞の形成を可能にするが、二重層内の残留溶媒がタンパク質を不活性化するため、膜タンパク質の機能的再構成は一般に不可能である。proteoLUVのサイズは100〜400 nmの範囲であり、低濃度の酵素では、カプセル化により代謝経路が不完全な小胞につながる可能性があります(確率的効果;図3を参照)。LUVは、ATPやG3Pなどのビルディングブロックの生成にここに示すように、特定の代謝モジュールを構築するのに理想的です。このようなプロテオLUVは、GUVにカプセル化され、宿主小胞のオルガネラ様コンパートメントとして機能する可能性があります。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> 図3:直径100、200、または400nmの小胞あたりの分子数 (A) カプセル化されたタンパク質(酵素、プローブ)が1〜10 μMの範囲にある場合 (B) 再構成は、脂質(mol/mol)あたり1〜1,000、1〜10,000、および1〜100,000の膜タンパク質で行われます。分子は示された濃度でカプセル化され、これらのタンパク質と脂質の比率で膜に取り込まれると仮定します。一部の酵素では、それらが膜に結合し、小胞内の見かけの濃度を増加させる可能性があることがわかりました。略語:LPR = Lipid-Protein-Ratio <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>アミコンカットオフフィルター</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>ミリポア遠心フィルターユニット アミコンウルトラ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td></td> <td>Formedium-D</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sucrose</td><td>Formedium-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glycon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Ether</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>押出機</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>蛍光計</td><td>Jasco</td><td>分光蛍光光度計 FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>重力フローカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ 100 &micro;L</td><td>ハミルトン</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ 1000 & マイクロ;L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルド LCP ディスペンサー</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルド ソニケーター</td><td>ヒールシャー超音波技術</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ブーム</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr>大型<tr><td>ファルコンチューブ遠心分離機</td><td>Eppendorf</td>遠心<td>分離機5810</td> RL<td></td></tr><tr><td>-アルギニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-オルニチン</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体チップ</td><td>自家製&nbsp;</td><td>PDMSベースの</td><td>DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop分光計</td><td>Isogen ライフサイエンス</td><td>ND-1000 分光光度計 NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>GUV用針</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4 インチ 0.4 x 20 mm</td></tr><tr><td>マイクロ流体用針</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2 インチ 1.2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>浸透圧計</td><td>Gonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 基本的な凝固点浸透圧計</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>プラズマエッチング</td><td>PE-アベンジャー</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネートフィルター</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor トラックエッチング 膜 製品: 10417104</td><td>0.4 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>ポリカーボネート製超遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>ピラニン</td><td>アクロス オーガニックス</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>クォーツキュベット (黒)</td><td>ヘルマ・アナリティクス</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>セファデックス G-75 樹脂&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ソニックスソニックス&材料 INC</td><td>Sonics バイブラ セル</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S plus 0.2</td><td>0.2 &micro;m</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>遠心分離機5418</td><td></td></tr><tr><td>テフロンスペーサー</td><td>自家製&nbsp;</td><td>テフロンベース</td><td>45 x 26 x 1.5 または 45 x 26 x 3 または 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>UV ランプ</td><td>Spectroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS 分光計</td><td>Jasco</td><td>V730 分光光度計</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>広視野蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Casein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

精製されたコンポーネントを使用して、内在性膜タンパク質、酵素、および蛍光ベースのセンサーを含む複雑なタンパク質ネットワークを小胞に組み込む方法を紹介します。この方法は、バイオリアクターの設計と構築、および複雑な非平衡代謝反応ネットワークの研究に関連しています。まず、以前に開発されたプロトコルに従って、(複数の)膜タンパク質を大きな単層小胞(LUV)に再溶解します。次に、精製された酵素、代謝物、および蛍光ベースのセンサー(蛍光タンパク質または色素)の混合物を凍結融解押出しでカプセル化し、遠心分離および/またはサイズ排除クロマトグラフィーによって非組み込み成分を除去します。代謝ネットワークのパフォーマンスは、ATP/ADP比、代謝物濃度、内部pH、または蛍光読み出しによるその他のパラメータを監視することにより、リアルタイムで測定されます。直径100-400 nmの膜タンパク質含有小胞は、既存の最適化された手順を使用して、巨大単層小胞(GUV)に変換できます。このアプローチにより、可溶性成分(酵素、代謝物、センサー)をマイクロメートルサイズの小胞に含めることができるため、バイオリアクターの容量を桁違いに拡大できます。GUVを含む代謝ネットワークは、光学顕微鏡による分析のためにマイクロ流体デバイスに閉じ込められます。

可溶化膜タンパク質をリポソームに再構成するには、事前に形成された小胞の不安定化が必要です。少量のTriton X-100を添加すると、小胞の膨潤による光散乱の増加により、最初は540 nm(A540)での吸光度が増加します(図4)。A540 の最大値は、リポソームが界面活性剤で飽和する点(Rsat)であり、その後、さらにTriton X-100を添加すると、小胞が部分的に可溶化されます。 Rsolでは、 リポソームは完全に可溶化されます(図4)。膜タンパク質の再構成には、通常、 Rsat (矢印)を超えて60%に不安定化された小胞を使用します。
再構成された膜タンパク質ArcDは、L-アルギニンを小胞に輸送し、L-オルニチンを小胞から輸送するために使用され、カプセル化された酵素ArcA、ArcB、およびArcCとともに、ADPおよび無機リン酸塩からATPをリサイクルするために使用されます。GlpTは、グリセロール3-リン酸/リン酸アンチポーターであり、GlpKとともに、グリセロールとL-アルギニンの分解によって生成されたATPからのグリセロール3-リン酸の合成(および排泄)に必要です。 t = 0 で5mM L-アルギニンをプロテオリポソームに添加すると、500nmおよび430nmの励起39でのPercevalHR蛍光の比が急激に増加し、これは小胞内のATP/ADP比を反映している(図5)。グリセロールを添加すると、ATPはグリセロール3-リン酸の合成に使用され、その結果、ATP/ADP比が低下する28。L-アルギニンの分解はpHの変化にもつながり、これはピラニンまたはpHluorin27を使用して定量化できます。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> 図5:L-アルギニン分解経路によるATPのリサイクル。 2.7 mg の脂質/mL の LUV をキュベットに入れ、500 nm と 430 nm の蛍光比を記録します。5 mMのL-アルギニンが t = 0で添加されます。F500/F430 比は、小胞内のATP/ADP比の尺度です。略語:LUVs =大単層小胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ATPを生成するLUVは、GUVの形成にも使用できます。LGTアガロースゲル上で乾燥したプロテオLUVを再水和すると、マイクロメートルサイズの小胞が形成されます(図6)。乾燥したLUVスポット内でのプロテオGUVの形成は、脂質の局所濃度と脱水の程度に大きく依存します。一部の地域ではGUVの大きなパッチがありますが、同じ液滴内の他の場所では、GUVがまったく形成されないか、ほとんど形成されません。LGTアガロース支援腫脹によるGUVの形成は、通常、数マイクロメートルから50μm以上の範囲のGUVサイズをもたらします。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> 図6:ゲルアシスト膨潤によって形成されたproteoGUVのDIC画像。 スケールバー = 25 μm。略語:DIC =微分干渉コントラスト;GUVs = 巨大-単層小胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
GUVは回収され、βカゼイン不動態化PDMSベースのマイクロ流体デバイスに閉じ込められます(図7)。このデバイスは、1回の実験で多くの小胞を捕捉して分析できるように設計されており、デバイスを使用して外部環境(流量、バッファー組成など)を制御します34. プロテオGUVの収率が低い場合でも、マイクロ流体チップを通るGUVの一定の流れにより、多くの小胞を収集することができます。十分な量のGUVが捕捉されたら、浸透圧バランスのとれたバッファーでシステムを洗浄し、可溶性タンパク質、低分子、蛍光プローブなどの外部成分を除去します。次に、洗浄バッファーを、50 mM KPi(pH 7.0)、さまざまな量のグルコース(浸透圧を調整するため)、および10 mM L-アルギニンなどの基質を含む等しい浸透圧の基質溶液で置き換えます。マイクロ流体チップのいくつかのトラップで時系列実験が行われ、画像は90秒ごとに撮影されます(PercevalHRを使用した場合は405nmおよび488nmの励起)。また、各時点において明視野画像が撮影される。488 nmと405 nmでの励起後の発光強度の比は、小胞内のADP / ATP比の尺度です。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> 図7:マイクロ流体チップによる小胞の捕捉 (A)外部環境と流量を制御する能力を伴う小胞の捕捉。(B)マイクロ流体デバイスにトラップされ、405nmレーザー(緑)と488レーザー(赤)で励起されたProteoGUV。両方のチャネルの発光は&gt;500nmで測定されます。明視野画像により、蛍光を使わずに小胞を可視化することができます。スケールバー = 25 μm。略語:GUVs =巨大-単層小胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

膜タンパク質を再構成し、酵素やその他の水溶性成分をサブマイクロメートルおよびマイクロメートルサイズの脂質小胞にカプセル化するためのプロトコルを提示します。

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

オランダでは、BaSyCコンソーシアムが分子成分から合成細胞を構築することを目指しています。BaSyCコンソーシアムは、分子生物学から化学、物理学、計算科学まで幅広い研究グループで構成されています。本コンソーシアムは、情報伝達と分断を自律的に行う自己複製システムの構築を目指しています。そして現在、私たちはより複雑な分子システムに向けて統合された分子ネットワークの構築に焦点を当てています。合成生物学における最近の開発には、細胞機能のためのモジュールのエンジニアリング、診断、治療、合成免疫学、および適応材料への応用のための複雑なネットワークへの統合が含まれます。この進歩は、ヨーロッパ、アメリカ、アジアのグループにまたがり、合成細胞構築に対するトップダウンとボトムアップの両方のアプローチを進歩させています。私たちの分野では、代謝ネットワークを構築・最適化するための工学的・進化的手法が現在展開されています。分子選択にはAIを、成分の分離とネットワーク形成には高度な生化学的および生物物理学的手法を使用します。また、膜の再構成、物理的カプセル化、蛍光分光法や顕微鏡法による可視化も採用しています。モジュールの集積化に伴い、膜タンパク質や酵素の数が膨大に増加し、再構成技術やカプセル化技術に制約が生じています。サブミクロンサイズの小胞では確率的なカプセル化が問題となり、脂質膜内で複数の膜タンパク質が再構成されると、マイクロメートルサイズの小胞の形成効率が低下します。フローニンゲンでは、ATP生産のための代謝ネットワークを開発し、基質供給と製品輸出を通じて非平衡状態を維持しています。さらに、ATPのリサイクルを脂質前駆体の合成と排泄に結びつけることで、二次小胞が脂質を産生することを可能にしたのは、当研究室の大きな進歩です。

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

本明細書で我々は、小胞の調製、転写および翻訳機構のカプセル化、およびタンパク質の産生を監視するための簡単​​な方法を記載する。得られた無細胞系がますます複雑な細胞模倣物の構築の開始点として使用することができる。...

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

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このプロトコルは、巨大な単層脂質小胞と組み合わせて滑空キネシン運動性を使用して脂質ナノチューブネットワークを作製するためのプロセスを記載している。...

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インビトロ Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles(GUV)内部の細胞骨格ネットワークの再構成

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