Name: 脳血管の解剖学的構造を損なうことなく中大脳動脈閉塞・再灌流のラットモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学ぶ中大脳動脈閉塞・再灌流ラットモデル。脳血管の解剖学的構造を損なわず虚血性脳卒中を誘導するマイクロ外科的手法を解説。TTC染色とImageJによる梗塞定量評価も含む。

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この作業は、2023年に河北省外国情報導入プロジェクトの支援を受けました。この原稿の草稿の英語テキストを編集してくださったLiwen Bianji(Edanz)(www.liwenbianji.cn)のLisa Kreiner博士に感謝します。

この実験手順は、煙台大学の動物施設管理委員会(承認番号:YTDX20230410)から承認を受け、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドラインを遵守しています。この研究では、体重300〜350 gの雄のSprague-Dawleyラットを利用しました。使用した動物、試薬、機器の包括的なリストは、材料表に記載されています。
1. 動物の調理法
<ol>
	<li>12時間の明暗サイクル、制御された温度、湿度を維持する環境に動物を収容します。彼らが食料と水に無制限にアクセスできるようにします。</li>
</ol>
2. 麻酔
<ol>
	<li>ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(20 mg / kg)を含む混合物を使用して腹腔内注射によりラットに麻酔をかけます><。
	注:ラットの頭と体を下向きに傾けます。注射部位は、動物の腹部の右下腹部にあります。注入する前にプランジャーを引き戻してください。平均注入量は0.4mLです。</li>
	<li>後足の離脱反射とまばたき反射を評価することにより、麻酔の導入を確認します。麻酔の適切な深さが達成されない場合は、外科的処置中にイソフルランを補給します。.</li>
</ol>
3. 虚血モデリングの手順
<ol>
	<li>オートクレーブを使用して手術器具を滅菌します。手術台および関連機器を70%エタノールで消毒します。</li>
	<li>予想される切開部位の周りの毛皮を剃ることにより、手術部位を準備します。手術部位の皮膚をベタジンと70%エタノールで3回消毒します。</li>
	<li>腹側に約1.5cmの長さの正中線切開を行い、表在筋膜を開きます。</li>
	<li>鋭く鈍い解剖を行い、前述の方法に従って、外頸動脈(ECA)、内頸動脈(ICA)、および総頸動脈(CCA)を露出させます7。</li>
	<li>CCAの周りに3つの4-0シルク縫合糸を配置し、ICA分岐部近くのECAを介して別のシルク縫合糸を配置します。近位CCAに取り外し可能なスリップノットを結びます。止血器を使用して遠位CCAの縫合糸を締め、血流を遮断します。縫合中にCCAの周りに別のスリップノットを緩く結び、血管が閉塞しないようにします。 
	注:スリップノットは血管縫合中に解放する必要があるため、スリップノットがきつすぎず、血流をブロックするのに十分なだけであることを確認してください。</li>
	<li>はさみを使用して、近位のシルク縫合糸とCCAの中央の縫合糸との間に0.5mmの切開を行います. 
	注意: 切開部がフィラメント(シリコンコーティングされた先端)がCCAに入ることができることを確認してください。</li>
	<li>長さ3cmの4-0フィラメント(シリコンコーティングチップ)をCCAに導入します。CCAの周りの絹の縫合糸を締めて、管腔内フィラメントを固定し、出血を防ぎます。次に、遠位CCAから縫合糸を取り出します。</li>
	<li>フィラメントをMCAの内腔に挿入し続け、ECAの周りの縫合糸を制御して、フィラメントがECAに入らないようにします。挿入長さは通常18mmから20mmです。</li>
	<li>タイマーを開始し、オクルージョンが開始された時間を記録します。首の切開部を3-0シルク縫合糸で縫合し、動物を慎重に回復ケージに入れます。0.5 mLの生理食塩水を腹腔内投与します。.</li>
</ol>
4. CCAの顕微手術用縫合
<ol>
	<li>虚血の1.5時間後にラットに再麻酔をかけます。.切開部位を70%エタノールで3回消毒し、切開部を再度開きます。</li>
	<li>CCA切開部の近くに白い先端がはっきりと見えるまで、閉塞フィラメントをゆっくりと引き抜きます。マイクロクランプを、CCA分岐部の近くの固定された管腔内縫合糸の結び目の近くに水平に配置します. 
	注意: シリコンの剥離とその後の血栓症を防ぐために、白いフィラメントの先端を固定しないでください。</li>
	<li>固定されている管腔内縫合糸の結び目を緩め、フィラメントを完全に取り外します。</li>
	<li>近位CCAノットの心臓端側の近くに別のマイクロクランプを配置します。続いて、近位CCAの周りの縫合糸の結び目を外します. 
	注:クランプの適切な配置は、微小血管縫合を容易にするために後のステップで固定血管を持ち上げるために重要です。滑りを防ぐために、周囲の筋肉にクランプを水平に置きます。</li>
	<li>切開部位を通常の生理食塩水で洗い流し、滅菌綿球でその部分を乾燥させて血液を取り除き、明確な手術野を実現します。</li>
	<li>顕微鏡下(倍率4倍)で、11-0の顕微手術用縫合糸を断続パターンでCCA切開部を縫合します(切開部のサイズにもよりますが、通常は2針必要です)。</li>
	<li>縫合後、CCAの両端からマイクロクランプを取り外して血流を回復させます。</li>
	<li>滅菌コットンボールでCCA縫合部位に30秒間圧力をかけ、出血が発生しないようにCCAを2分間観察します。ラットの首の切開部を縫合し、動物をケージに戻す前に麻酔回復のために35°Cのケアボックスに入れます 
	注:術後鎮痛のために、メロキシカムを2 mg / kgの用量で腹腔内投与します。.</li>
</ol>
5. 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)による染色
<ol>
	<li>虚血再灌流の3日後、4%イソフルランと子宮頸部脱臼による深い麻酔下で動物を安楽死させます。</li>
	<li>脳を取り出し、メスの刃8を使用して、厚さ2mmの冠状切片に切ります。</li>
	<li>脳切片を2% TTCで37°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>脳切片を10%ホルマリンで2回すすぎ、10%ホルマリンで室温で30分間固定します。</li>
	<li>連続スライスのデジタル写真を撮影し、Image Jソフトウェアを使用して梗塞領域を定量的に測定します。</li>
</ol>
6. 神経機能検査
注:神経学的機能は、以前のレポート9に続いて、ガルシアテストを使用して評価されました。
<ol>
	<li>自発的な活動、4 つの手足すべての動きの対称性、前足の伸ばし、登り、身体の固有受容感覚、および振動の接触に対する反応を評価します。ガルシアテストの基準に基づいてスコアを割り当て、最大スコアは18ポイントで、正常な神経機能を示します。</li>
</ol>
7. 統計分析
<ol>
	<li>GraphPad Prismを使用して、Studentのt検定を使用して統計分析を行います。データを平均±標準偏差として表します。Pが0.05の場合、統計的に有意な平均<差を考慮します。</li>
</ol>

Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats with Preserved Vascular Anatomy

<ol><li>Tu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((China+stroke+surveillance+report+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Mil+Med+Res%22%5BJournal%5D)">China stroke surveillance report 2021.</a> Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oxidative+stress+and+inflammation+to+prevent+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury.</a> Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).</li>
<li>Ringelstein, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+and+extent+of+hemispheric+brain+infarctions+and+clinical+outcome+in+early+and+delayed+middle+cerebral+artery+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization.</a> Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%3A+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jap+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Trueman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-examination+of+the+intraluminal+filament+MCAO+model%3A+Impact+of+external+carotid+artery+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection.</a> Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).</li>
<li>Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+%28MCAO%29+model+for+ischemic+stroke+with+laser+Doppler+flowmetry+guidance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice.</a> J Vis Exp. (51), e2879(2011).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icaritin+inhibits+neuroinflammation+in+a+rat+cerebral+ischemia+model+by+regulating+microglial+polarization+through+the+GPER-ERK-NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway.</a> Mol Med. 28 (1), 142(2022).</li>
<li>Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+Deficit+and+extent+of+neuronal+necrosis+attributable+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).</li>
<li>Bracko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitropropionic+acid-induced+ischemia+tolerance+in+the+rat+brain+is+mediated+by+reduced+metabolic+activity+and+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).</li>
<li>Goldmacher, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+transplanted+bone+marrow+stem+cells+and+their+effects+in+the+rat+MCAO+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model.</a> PLoS One. 8 (3), e60049(2013).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease.</a> Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).</li>
<li>Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+and+strain-related+variables+significantly+affect+outcome+in+a+murine+model+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia.</a> Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).</li>
<li>Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+susceptibility+to+cerebral+ischemia+are+related+to+cerebral+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).</li>
<li>Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).</li>
<li>Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).</li>
</ol>

著者には、開示する潜在的な相反する利益はありません。

MCAo は、脳卒中の動物モデルを作成するために広く使用されている方法であり、虚血後の血流を回復させることにより、患者に観察される脳卒中プロセスを効果的に再現します10、11、12。当研究室では、ECAに損傷を与えることなくCCAからの再灌流を可能にする虚血性脳卒中モデルを開発しました。虚血の誘発に続いて、CCA の顕微手術修復が行われます。CCA血流の直接測定は行われませんでしたが、実験者は再灌流を進める前にCCAの血管脈動を観察しました。この技術は、患者の脳卒中プロセスによく似ながら、首の血管の解剖学的完全性を維持します。さらに、神経機能と脳虚血領域の評価により、この外科的アプローチによって誘発された脳卒中の妥当性が確認されました。
前述の虚血性脳卒中モデルは、さまざまな要因の影響を受ける可能性があります。Koizumi et al.4 による方法では、血液再灌流は CCA の結紮によりウィリス輪に大きく依存しています。ただし、脳血管系の変動は最終的な脳梗塞容積に影響を与える可能性があり、血液灌流が低いため脳卒中モデルの死亡率が増加する可能性があります13,14。さらに、ECA の虚血は顔の筋肉や神経の機能を損ない、さまざまな神経機能の評価に影響を与える可能性があります15,16。
現在の方法は、次の 3 つの重要なステップを通じてこれらの課題に対処します。(1) CCA 切開をできるだけ小さく保ち、フィラメント挿入に十分な大きさに保ち、血管縫合に伴う時間と損傷を軽減します。(2) シリコーン剥離や血栓症につながる可能性のある白色フィラメント先端のクランプを防ぐために、遠位 CCA をクランプするときは、微小血管クランプを CCA 分岐部にできるだけ近づけて配置します。(3) 血管修復後に正中線頸部切開部を縫合する前に、脈動が再開され、実質的な出血がないか CCA を観察します。
現在の方法にはいくつかの制限があります。まず、縫合部位に塞栓が形成される可能性があり、塞栓が剥がれるとさらなる脳虚血につながる可能性があります。このリスクは、将来の実験で慎重に検討し、管理する必要があります。第二に、この研究ではラットの体重を監視していなかったため、この方法が食物摂取量に影響を与えたかどうかを判断することが困難になりました。食物摂取量はこの方法の利点の直接的な指標であり、その評価は貴重な洞察を提供する可能性があります。最後に、現在の方法では顕微手術の技術的熟練度が必要であり、適切なトレーニングと専門知識がなければ、その広範な使用が制限される可能性があります。
要約すると、MCAo モデリング手法は高い生理学的関連性と構造的完全性を提供しますが、より堅牢な実験を行うには対処する必要がある制限があります。首の血管の解剖学的完全性を維持し、患者の脳卒中プロセスを厳密にシミュレートすることは、この方法の大きな強みです。このアプローチは間違いなく虚血性脳卒中の研究に大きく貢献し、実験モデルの信頼性と精度を向上させるでしょう。最終的には、これにより治療効果をテストするために必要な実験グループが減り、より信頼性の高い実験結果が得られる可能性があります。

脳卒中は、世界中の成人の死亡および長期の神経機能障害の主な原因であり、様々なタイプを包含しており、虚血性脳卒中が症例の約81.9%を占め、脳出血とくも膜下出血がそれぞれ14.9%と3.1%を占めています1.虚血性脳卒中は、アテローム性動脈硬化症または中大脳動脈(MCA)の閉塞に起因し、局所的な脳血流の減少とそれに続く脳の損傷につながります。虚血細胞への栄養供給のこの減少は、エネルギーの枯渇を引き起こし、膜の完全性の喪失、細胞の腫脹、そして最終的には溶解を引き起こします。さらに、細胞内カルシウムの増加、興奮性アミノ酸の放出、フリーラジカル産生の増加、炎症性細胞の活性化などの要因が、脳卒中後の脳組織の損傷2に寄与します。
虚血性脳卒中の治療目標は多面的です。進行中の神経学的損傷を減らし、死亡率と長期的な障害を減らすこと、不動と神経機能障害から生じる合併症を予防すること、そして脳卒中の再発リスクを最小限に抑えることです。虚血性脳卒中の病態生理学の複雑さを考えると、虚血性脳卒中を標的とする治療法の研究開発には、堅牢な脳卒中モデルが不可欠です。
現在、中大脳動脈閉塞症(MCAo)は虚血性脳卒中の一般的な動物モデルです3です。MCAoは通常、シリコンチップまたは炎鈍化モノフィラメントを頸部血管に挿入して、中大脳動脈(MCA)の起点に到達するまで挿入することによって実行されます。1986年、小泉らは、総頸動脈(CCA)の切開部からシリコン先端のモノフィラメントを挿入する技術を開発し、MCAの入り口に到達して血流を遮断できるようにしました4。1989年、ロンガのグループは、外頸動脈(ECA)の切開部からモノフィラメントを導入する別のMCAo法を報告しました。その後、モノフィラメントは内頸動脈(ICA)とECAの分岐部を横切り、MCA5の始点に到達します。
MCAoを誘導するための2つの既存の方法の限界は明らかです。小泉の方法は、同側CCAの永久的な閉塞を必要とし、再灌流がWillis4の円のみに依存するため、MCA灌流の減少につながります。逆に、ロンガの方法はECAを切断することを含み、ECAシステムに損傷を与え、その結果、顔の筋肉機能5の障害を引き起こします。この損傷は、食物や水の摂取に影響を与えるだけでなく、顔の感覚機能障害を引き起こし、虚血性脳卒中後のリハビリテーションと神経機能の評価に影響を与える可能性があります6。
現在のプロトコルは、脳血管の解剖学的構造を損傷することなく虚血性脳卒中モデルを誘発する新しい方法を開発することにより、これらの制限に対処しようとしています。この新しいアプローチは、マイクロサージェリー技術を利用してCCAを修復するため、以前の方法に関連する欠点を回避できます。

<table><tbody><tr><td>10%ホルマリン</td><td>北京Labgic Technology Co.、Ltd.</td><td>BL913A</td><td></td></tr><tr><td>11-0顕微手術用縫合糸</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>3月8日 1回;</td><td></td>5</tr><tr><td>2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)</td><td>SIGMA</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>3-0シルク縫合</td>糸 <td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>3-0</td><td></td></tr><tr><td>4%イソフルラン&nbsp;&nbsp;</td><td>天津玲浦生物科技有限公司 Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>20221102</tr><tr><td>6-0シルク縫合糸</td>寧<td>波医療縫合針有限公司</td><td>6-0</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td>山<td>東Lierkang医療技術有限公司</td><td></td><td></td>20230408</tr><tr><td>フィラメント</td><td>Xinong Technologies Co Ltd.</td><td>2838-A5</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン&nbsp;&nbsp;</td><td>江蘇恒瑞製薬有限公司</td><td>230613BL</td><td></td></tr><tr><td>雄 Sprague Dawley ラット</td><td>済南 Pengyue 実験動物育種有限公司</td><td>SCXK(Lu)20190003</td><td></td></tr><tr><td>マイクロクリップ</td><td>上海Jinzhong医療機器工場</td><td>W40150</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>S100 OPMIピコ</td><td></td></tr><tr><td>看護ボックス</td><td>北京Fuyi電器有限公司</td><td>FYL-YS-100L</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>SIGMA</td><td>PHR3263</td><td></td></tr></tbody></table>

脳血管の解剖学的構造を損なうことなく中大脳動脈閉塞・再灌流のラットモデル

A Rat Model of Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion Without Damaging the Anatomical Structure of Cerebral Vessels

虚血性脳卒中は、世界中の成人の長期的な障害と死亡の主な原因となっています。虚血性脳卒中の動物モデルは、その病理学的メカニズムの理解と潜在的な治療法の開発に大きく貢献しています。現在、フィラメント (血管内縫合) 技術を含む 2 つの一般的な方法があり、脳虚血の動物モデルを誘導しています。ただし、これらの方法には、脳への血液灌流の減少、外部頸動脈系の損傷、食物や水分の摂取障害、顔の感覚機能障害など、固有の制限があります。この記事では、脳血管の解剖学的構造を損なうことなくラット虚血性脳卒中モデルを誘導する新しい方法を紹介します。この研究では、Sprague-Dawleyラットの総頸動脈(CCA)が露出し、切開が行われました。次に、切開部からフィラメントを内頸動脈に挿入して、中大脳動脈を閉塞しました。誘発された虚血の1.5時間後、閉塞フィラメントは内頸動脈とCCAの両方から完全に除去されました。.その後、CCA の切開部を顕微鏡下 11-0 顕微縫合糸 (倍率 4 倍) を使用して縫合しました。この研究では、CCAを修復するための顕微手術技術の利用を通じて、脳血管の解剖学的完全性を維持しながらラットに虚血性脳卒中モデルを誘導する独自の方法の開発に成功しました。

微小縫合の手順 
白色のフィラメントの先端が見えるまで、総頸動脈（CCA）の切開部付近からフィラメントを引いた（図 1A）。次に、CCAにマイクロクランプを装着した（図 1B）。顕微鏡を用いて4倍の倍率で、CCAの切開部を微小外科用縫合糸を用いて断続縫合した（図 1C）。その後、CCAからマイクロクランプを取り除き、解剖学的構造と血流を復元させた（図 1D）。
TTC染色および死亡率 
計12匹の成体雄ラットを、シャム群とモデル群の2群にランダムに分けた（各群n = 6）。残念ながら、シャム群の1匹が麻酔薬の過剰投与により死亡し、モデル群の1匹が24時間以内に死亡した。脳虚血によって生じた梗塞は、線条体と皮質の両方で観察された（図 2A）。虚血性脳卒中から3日後、総梗塞率は脳半球の29.3% ± 1.6%と測定され（図 2B）、術後の死亡率は16.7%であった。
神経機能の評価 
虚血性脳卒中後の1日目および3日目において、モデル群のスコアは擬似手術群と比較して有意に低下した（それぞれ 17.8 ± 0.4 vs. 8.2 ± 1.5、図3A；17.6 ± 0.9 vs. 9.6 ± 1.3、図3B）。
<img alt="外科的縫合技術の図；組織を保持する鉗子；手順：針の刺入、結紮。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図1"> 
図1微小縫合の手順。 (A) フィラメントを共通頸動脈（CCA）から抜去する。青色の矢印は微小血管クランプを示す。 (B) 黒い矢印は、フィラメントを完全に除去した後の切開部位を示す。青い矢印は、微小血管クランプを示す。 (C顕微鏡下で（4倍拡大）、CCA切開部を11-0マイクロサージャリー用縫合糸を用いて結節縫合した。青色の矢印は微小血管クランプを示している。黒色の矢印は縫合後の切開部を示している。Dマイクロクランプを取り除き、総頸動脈（CCA）の血流を再開させる。黒色の矢印は、CCAの縫合部位を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="虚血脳組織切片、棒グラフ、虚血領域率の比較、実験結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図2"> 
図2虚血モデルのTTC染色結果。 (A) 脳虚血後の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色を施した脳切片の代表的な画像。生存組織では、TTCが脱水素酵素によって酵素的に還元され、赤色を呈する1,3,5-トリフェニルフォルマザンとなる。壊死領域の組織は、このような酵素活性が欠如しているため、白色のままである。 (B脳虚血後3日目のラットにおける虚血領域の割合。Sham群と比較して、**P &lt; データは平均値±標準偏差で表記する。各群のラット数は5匹とした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Sham群とModel群のGarciaスコアを比較した棒グラフ。有意差（**）を示す。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図3"> 
図3神経機能の評価。 (A脳虚血後1日のGarciaスコア。B脳虚血から3日後のGarciaスコア。Sham群と比較して、**P &lt; データは平均値 ± 標準偏差で表示している。各群のラット数は5匹であった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

現在のプロトコルは、損傷を引き起こすことなく脳血管の解剖学的構造を保存する中大脳動脈閉塞/再灌流のラットモデルを記述しています。

Ischemic stroke stands as the primary cause of long-term disability and mortality among adults worldwide. Animal models of ischemic stroke have ...

この研究では、脳血管の統合を維持する中大脳動脈閉塞または再灌流のラットモデルを開発します。これは、脳血管の解剖学的構造を損なうことなくラット虚血性脳卒中モデルを誘導するための新しい方法の導入に焦点を当てています。このプロジェクトでは、顕微手術技術とフィラメント誘発性虚血を使用しています。総頸動脈や外部頸動脈系を損傷することなく虚血を誘発する方法を導入します。永久に血流を損なったり、脳血管の解剖学的構造を損傷したりする可能性のある技術とは対照的に、このプロトコルはいくつかの血管の解剖学的完全性を維持します。これは、虚血性脳卒中の研究に、より正確で害の少ないアプローチを提供します。まず、麻酔をかけたラットを手術台に置きます。喉の周りと左首の部分の毛皮を剃った後、手術部位をベタジンと70%エタノールで3回消毒します。首の腹側に1.5センチメートルの長さの正中線を切開し、表在筋膜を開きます。鈍的解剖を行い、外頸動脈、内頸動脈、総頸動脈を露出させます。総頸動脈の周りに3つの4-0シルク縫合糸を配置し、内部頸動脈分岐部近くの外部頸動脈を介して別のシルク縫合糸を配置します。近位の総頸動脈に取り外し可能なスリップノットを結びます。止血剤を使用して遠位総頸動脈の縫合糸を締め、血流を遮断します。縫合中に総頸動脈の周りに別のスリップノットをゆるく結び、血管が閉塞しないようにします。次に、はさみを使用して、近位のシルク縫合糸と総頸動脈の中央の縫合糸との間に0.5ミリメートルの切開を行います。総頸動脈に長さ3センチメートルの4-0フィラメントを導入します。総頸動脈の周りの絹の縫合糸を締めて、管腔内フィラメントを固定し、出血を防ぎます。次に、遠位総頸動脈から縫合糸を取り出します。フィラメントを中大脳動脈の内腔に挿入し続け、外部頸動脈の周りの縫合を制御します。タイマーを開始し、オクルージョンが開始された時間を記録します。首の切開部を3-0シルク縫合糸で縫合します。動物を回復ケージに慎重に置きます。虚血モデリング後、麻酔をかけたラットの頸部切開部を再度開きます。解剖顕微鏡下で、マイクロクランプを管腔内縫合糸の結び目の近くに水平に配置しながら、閉塞フィラメントを静かに引き抜きます。総頸動脈切開部の近くに白い先端がはっきりと見えるまで、引き出しを続けます。次に、フィラメントを完全に取り外し、固定された管腔内縫合糸の結び目を解放します。近位総頸動脈の結び目の心臓端側の近くに別のマイクロクランプを配置します。続いて、近位総頸動脈の周りの縫合糸の結び目を取り除きます。切開部位を生理食塩水ですすいでください。滅菌綿球でその部分を乾かして血液を取り除き、明確な手術野を実現します。4倍の倍率で、11-0の顕微手術用縫合糸を使用して、総頸動脈切開部を断続パターンで縫合します。縫合後、総頸動脈の両端からマイクロクランプを取り外して血流を回復させます。滅菌綿球で総頸動脈縫合部位に30秒間圧力をかけます。総頸動脈を2分間観察して、出血が発生しないことを確認します。首の切開部を縫合し、麻酔回復のためにラットを摂氏35度のケアボックスに入れます。虚血再灌流の3日後、安楽死させたラットから脳を取り出します。脳をマイナス20°Cで20分間凍結します。凍結後、メスを使って脳を厚さ2ミリの冠状切片に切ります。脳切片を2%TTCで摂氏37度で20分間インキュベートします。インキュベーション後、脳切片を小さなシャーレに移し、2%TTCを廃棄します。次に、脳切片を10%ホルマリンで室温で30分間固定します。ホルマリンを捨て、PBSで脳の部分をすすぎます。連続したスライスのデジタル写真を撮影します。ImageJソフトウェアを使用して、梗塞領域を定量的に測定します。TTC染色後、線条体と皮質の両方に脳虚血による梗塞が認められた。虚血性脳卒中後3日で、総梗塞率は半球の約30%で測定され、手術後の死亡率は16.7%でした。

a-rat-model-middle-cerebral-artery-occlusionreperfusion-without

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ラットにおける虚血性脳損傷の外科的誘導は、脳卒中の研究に広く使用されているモデルです。ここでは、中大脳動脈の閉塞による局所脳虚血の誘導を示す。組織染色および磁気共鳴イメージングによる結果梗塞の可視化も示されている。...

ラット中大脳動脈の血管縫合閉塞による局所脳虚血モデル

我々はビデオで腔内モノフィラメントを使用して成体マウスの中大脳動脈閉塞を製造する方法を示しています。我々はまた、2,3,5 -...

中大脳動脈閉塞のマウスモデル

このビデオは、高齢ラットの総頸動脈またはCCA結紮を使用して、虚血性脳卒中をモデル化するために、永久遠位中大脳動脈閉塞術(MCAO)を実行する手順を示しています。これにより、脳への血流が遮断され、ニューロン死につながり、脳卒中のメカニズムと潜在的な治療法を研究するためのモデルが生成されます。...

ラットモデルにおける中大脳および総頸動脈閉塞による虚血の誘導

出典:Larpthaveesarp, A., et.alです。P10ラットにおける新生児脳卒中の一過性中大脳動脈閉塞モデル。J. Vis.

局所脳虚血を誘発するためのラットの子犬における中脳動脈閉塞の生成

私たちは、齧歯類の主要脳血管の閉塞のための永久的な再現性の高い方法を記述します。この技術は、非常に少ない周損傷、最小限の血液損失、長期生存率が高いと、ヒト臨床人口に見合った一貫性梗塞体積を達成することができる。...

永久的な脳血管閉塞<em&gt;経由</em&gt;ダブルリガチャーと離断

新生児脳卒中は、早期の脳損傷の重要な原因であり、研究を可能にするためには、一貫した焦点損傷パターンと高い再現性を持つトランスレーショナルモデルが必要です。この研究では、完全正期相当のげっ歯類に非出血性の片側性限局性虚血再灌流障害を作成するための詳細な外科的手順について説明します。...

P10ラットにおける新生児脳卒中の一過性中大脳動脈閉塞モデル

腔内フィラメント中大脳動脈閉塞症は、齧歯動物で実験的ストロークの生体内で最も頻繁に使用されるモデルです。一般的な頚動脈修復が可能にする手術方法は、総頸動脈の再灌流と中大脳動脈領域に完全再灌流が可能ここでは、実行されます。...

マウスにおける一般的な頸動脈の修理で再灌流を許可する中大脳動脈閉塞

脳虚血再灌流のマウス モデルを確立して、脳卒中の病態を調査します。我々 は遠位右中大脳動脈と右総頚動脈を結紮し、10 または 40...

2 血管閉塞マウス脳虚血・再灌流モデル

このプロトコルは、総頸動脈を介した中大脳動脈閉塞再灌流の準備プロセスを説明しています。...

中大脳動脈閉塞再灌流のための修正モデル調製

本研究の目的は、ラットにおける頭蓋切除術と選択的中大脳動脈閉塞を恒久的かつ選択的に行う再現可能な方法を確立し、運動記憶および空間記憶障害の実験研究に応用することでした。...

ラットにおける中脳動脈の選択的かつ永久的な閉塞:運動記憶および空間記憶障害の研究における実験的アプローチ

学ぶ中大脳動脈閉塞・再灌流ラットモデル。脳血管の解剖学的構造を損なわず虚血性脳卒中を誘導するマイクロ外科的手法を解説。TTC染色とImageJによる梗塞定量評価も含む。

脳血管の解剖学的構造を損なうことなく中大脳動脈閉塞・再灌流のラットモデル

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