Name: フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学ぶ フローサイトメトリーを用いたマウス海馬由来ミクログリアによるシナプス材料の包絡定量化法。この手法は神経免疫相互作用と脳機能におけるミクログリアの役割解明に貢献します。

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ミクログリアの分離に関する技術支援を提供してくださったRegina Piske氏と、 補足図S1の顕微鏡画像取得を支援してくださったCaio Andreta Figueiredo博士に感謝します。MDCのFACSファシリティの技術サポートに感謝します。この原稿は、2024年にBrain, Behavior and Immunity Journalに投稿された代表的な数値を部分的に示しています。 図 1A、 図 2A、および補足図 S3A は、BioRender.com を使用して作成されました。

シナプス材料のミクログリア包絡に対するフローサイトメトリーベースのアッセイ

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and Disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+contribute+to+circuit+defects+in+Mecp2+null+mice+independent+of+microglia-specific+loss+of+Mecp2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression.</a> eLife. 5, e15224(2016).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Filipello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglial+innate+immune+receptor+TREM2+is+required+for+synapse+elimination+and+normal+brain+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The microglial innate immune receptor TREM2 is required for synapse elimination and normal brain connectivity.</a> Immunity. 48 (5), 979-991 (2018).</li>
<li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nat Med. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), New York, N.Y. 712-716 (2016).</li>
<li>Di Liberto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+under+T+cell+attack+coordinate+phagocyte-mediated+synaptic+stripping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurons under T cell attack coordinate phagocyte-mediated synaptic stripping.</a> Cell. 175 (2), e19 458-471 (2018).</li>
<li>Bisht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+microglia%3A+A+new+phenotype+predominantly+associated+with+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dark microglia: A new phenotype predominantly associated with pathological states.</a> Glia. 64 (5), 826-839 (2016).</li>
<li>Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+the+hippocampus+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (6), 3349(2022).</li>
<li>Aw, E., Zhang, Y., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+responses+to+peripheral+type+1+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial responses to peripheral type 1 interferon.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 340(2020).</li>
<li>Brioschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+synaptic+proteins+in+microglia+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detection of synaptic proteins in microglia by flow cytometry.</a> Front Mol Neurosci. 13, 149(2020).</li>
<li>Norris, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+integrity+and+complement+control+synaptic+material+clearance+by+microglia+after+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JEM%22%5BJournal%5D)">Neuronal integrity and complement control synaptic material clearance by microglia after CNS injury.</a> JEM. 215 (7), 1789-1801 (2018).</li>
<li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).</li>
<li>Jaszczyk, A., Stankiewicz, A. M., Juszczak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+mouse+hippocampus+with+its+dorsal%2C+intermediate+and+ventral+subdivisions+combined+with+molecular+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sci%22%5BJournal%5D)">Dissection of mouse hippocampus with its dorsal, intermediate and ventral subdivisions combined with molecular validation.</a> Brain Sci. 12 (6), 799(2022).</li>
<li>Fixable viability dyes for flow cytometry. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html</a> (2024).</li>
<li>SynPER synaptic protein extraction reagent. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P BZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QAvD_BwE&ef_id=Cjw KCAiAi6uvBhADEiwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC 3VJNgrPEm1I64E2PBZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QA vD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!3652!3!606658601747!e!! g!!syn per!13368767883!123500396056&cid=bid_pca _ppf_r01_co_cp1359_pjt0000_bid00000_0se_gaw_bt _pur_con&gad_source=1#/87793">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P BZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QAvD_BwE&ef_id=Cjw KCAiAi6uvBhADEiwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC 3VJNgrPEm1I64E2PBZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QA vD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!3652!3!606658601747!e!! g!!syn per!13368767883!123500396056&cid=bid_pca _ppf_r01_co_cp1359_pjt0000_bid00000_0se_gaw_bt _pur_con&gad_source=1#/87793</a> (2024).</li>
<li>Wu, A., Yu, B., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+olfactory+bulb+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Plasticity in olfactory bulb circuits.</a> Curr Opin Neurol. 64, 17-23 (2020).</li>
<li>pHrodo indicators for pH determination. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html</a> (2024).</li>
<li>Rangaraju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phagocytic+properties+of+CD45low+microglia+and+CD45high+brain+mononuclear+phagocytes-activation+and+age-related+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential phagocytic properties of CD45low microglia and CD45high brain mononuclear phagocytes-activation and age-related effects.</a> Front Immunol. 9, 405(2018).</li>
<li>Weinhard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+remodel+synapses+by+presynaptic+trogocytosis+and+spine+head+filopodia+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microglia remodel synapses by presynaptic trogocytosis and spine head filopodia induction.</a> Nat Commun. 9 (1), 1228(2018).</li>
<li>Morizawa, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+through+glial+synapse+engulfment+upon+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning through glial synapse engulfment upon motor learning.</a> Nat Neurosci. 25 (11), 1458-1469 (2022).</li>
<li>Morini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+tools+for+studying+microglial-mediated+synapse+elimination+and+refinement%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies and tools for studying microglial-mediated synapse elimination and refinement.</a> Front. Immunol. 12, 640937(2021).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+J.+Int+Soc+Anal+Cytol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. Part A: J. Int Soc Anal Cytol. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Easthope, E. Strategies for intracellular flow cytometry success. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/">https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/</a> (2022).</li>
<li>Paduano, F. Isotype control antibodies, Key points. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used,the%20primary%20antibody%20and%20fluorophore">https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used,the%20primary%20antibody%20and%20fluorophore</a> (2024).</li>
<li>Flow cytometry intracellular staining controls. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html</a> (2024).</li>
<li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEAST%3A+A+flow+cytometry-based+toolkit+for+interrogating+microglial+engulfment+of+synaptic+and+myelin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">FEAST: A flow cytometry-based toolkit for interrogating microglial engulfment of synaptic and myelin proteins.</a> Nat Commun. 14, 6015(2023).</li>
<li>Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+general+and+discriminating+markers+of+differential+microglia+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes.</a> Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).</li>
<li>van Wageningen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microglial+TMEM119+and+P2RY12+immunoreactivity+in+multiple+sclerosis+white+and+grey+matter+lesions+is+dependent+on+their+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of microglial TMEM119 and P2RY12 immunoreactivity in multiple sclerosis white and grey matter lesions is dependent on their inflammatory environment.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 206(2019).</li>
</ol>

著者は、競合する利益を宣言しません。

ミクログリアとシナプスの相互作用によるシナプスの微細化は、神経免疫学の分野における興味深い研究分野であり、神経変性疾患および神経発達障害におけるミクログリアの役割について有望な洞察を提供しています。2011年。Paolicelliらは、ミクログリア内にシナプス物質が存在する証拠を提供し、シナプス包み込みのプロセスへの関与を明らかにしました4。別の興味深い研究では、タイムラプスイメージングと ex vivo 器官型脳スライス培養モデルを採用し、ミクログリアがトロゴサイトーシスとして知られる食作用プロセスに関与し、シナプス構造全体ではなくシナプス前構造を飲み込むことを報告しました23。無傷の組織における食作用の測定を可能にする新しいトランスジェニックマウスモデルを用いたごく最近の論文では、運動学習時にBergmann-glia がin vivo で刈り込みを行うことが示された24。したがって、ミクログリアを含むシナプス包み込みにおけるグリア細胞の関与を示す十分な証拠があります。しかし、このミクログリア機能がシナプス刈り込みの動的で選択的なプロセスにどの程度影響を与えるかについては、さらなる証拠が必要です。
それにもかかわらず、シナプスのミクログリア巻き込みの定量化は貴重な指標として機能し、ミクログリアとシナプスの相互作用、特にシナプスの微細化の複雑なダイナミクスへの部分的な洞察を提供します。包括的なレビューでは、シナプスのミクログリアの飲み込みを調査するために使用されている現在のプロトコルがまとめられています25。私たちのプロトコルは、すでに使用されている既存のプロトコルに基づいて最適化されていることを強調したいと思います。この研究で提示された方法は、さまざまな解剖された脳領域のシナプスのミクログリア包みを迅速かつハイスループットで定量化します。脳の領域にもよりますが、どちらの方法論でも最大2日間で少なくとも10,000個のミクログリア細胞を解析することが可能であり、複数のマウスモデルを並行して試験する価値があります。
私たちは、vGLUT1+ ミクログリアの定量化には、固定ステップまでの in vivo および短期間の ex vivo 飲み込みの両方が含まれていることを認識しています。したがって、私たちのアッセイは、IHCなどのアプローチを使用して in vivo 検証に先立つ最初のステップとして、ミクログリア内のシナプス物質を定量するための迅速で信頼性の高い方法を提示することを示唆しています。
フローサイトメトリー解析のもう一つの欠点は、シナプスマーカー、特に抑制性シナプスに対する抗体の利用可能性が限られていることです。これらのマーカーに対して明るいシグナルを示す市販の直接標識抗体を見つけることは困難です。シナプスマーカーを標的とするさまざまな抗体の試験には膨大な最適化時間が必要であるため、この研究で行っているように、さまざまな抗体による細胞内染色のための最適化された手順を科学界と共有することが重要です。
本研究におけるデータ解析に関しては、vGLUT1抗体の非特異的結合を説明するために、Isotypeコントロールをテクニカルネガティブコントロールとして用いたが、これは、フローサイトメトリーベースのアッセイを最適化しながら、サンプル中の抗体の非特異的結合の推定値を提供するからである26。しかし、アイソタイプコントロールは、表面染色手順からの非特異的バックグラウンドシグナルを検出するために大部分が最適化されており、細胞内染色コントロールには最適ではない27,28。したがって、抗原検出、自家蛍光、および蛍光色素の輝度に影響を与える可能性のある固定および透過化ステップを含む細胞内染色を行う際に、ネガティブ集団とポジティブ集団を区別するためにそれらに頼るべきではない29。このような細胞内染色手順では、細胞内マーカー29について染色された陽性細胞集団を定義するために、適切な生物学的内部コントロールの使用が必要である。したがって、細胞内染色プロトコルを使用することを考慮して、内部生物学的陰性コントロール(脾臓マクロファージ)を採用し、同じマウスから単離された脾臓マクロファージに従って陽性集団と陰性集団の間の境界を定義しました。ゲートの上の陽性集団を区別し、vGLUT1陽性事象が存在しないゲートでは、生物学的陰性コントロールとして機能する脾臓マクロファージから分離しました(図1)。
この研究で提示された両方の方法は、シナプスのミクログリア包み込みを迅速かつハイスループットな方法で初期分析するための大きな可能性を提供し、小さな脳領域からの10,000を超える細胞を分析しますが、これは標準的な顕微鏡技術では達成できません。したがって、これらの方法は、労力と時間のかかる方法に比べて大きな利点を提供し、さらに、より多くのミクログリアの分析を可能にすることにより、シナプス包みのより包括的な分析を提供します。さらに、この研究で提示された in vitro 法は、シナプスのミクログリア包みに対するさまざまな処理の影響をテストするのに特に有用です。これにより、他の細胞タイプに関連する交絡因子を使用せずに、ミクログリアに対する治療の効果を直接定量化できます。さらに、シナプス包み込みのプロセスに対する微小環境または他の細胞タイプの潜在的な影響を証明するための間接的なアプローチとしても機能します。したがって、これらの方法は、特に並行して使用すると、シナプス材料のミクログリア包みの分析に直感的で有利な代替手段を提供すると結論付けています。
しかし、FACSベースの食作用アッセイによる新たに単離されたミクログリアのex vivoによる分析には、いくつかの欠点が生じる可能性があります。まず、ミクログリアのex vivo活性化とストレス応答を回避しながら、成体の脳から新たに分離されたミクログリアを生成する、十分に最適化されたプロトコルを採用することが重要です。Dissing-Olesenらは、37°C30での組織解離手順を採用することにより、この問題を克服するために転写および翻訳阻害剤の使用を組み込んだ。一方、Matteiらは、ストレス関連遺伝子16のex vivo発現を誘導しないようにするための冷たく機械的な組織解離プロトコルを提示し、最初のセクションでこのプロトコルを適応させて、細胞内vGLUT1染色前のストレス関連ミクログリア応答のex vivo活性化を回避しました。パパインベースの組織解離後のミクログリアの高収率を考慮して、in vitroシナプトソーム包み込みアッセイの前の2番目のセクションで酵素組織解離プロトコルを採用しました(データは示していません)。ミクログリアは、シナプトソームとインキュベートすると、培養条件下では必然的に37°Cに留まり、37°Cでのインキュベーションは、すべてのin vitroアッセイおよび細胞培養手順に共通する欠点として、実際にミクログリアに変化を誘発する可能性があります。したがって、シナプスのミクログリア飲み込みに関してより広範な結論に達するために、提示された両方のプロトコルを並行して使用することをお勧めします。
さらに、これらのマーカーを発現する脳実質内の他の免疫細胞の存在を考慮に入れることにより、CD11b ++/CD45+ ミクログリアを選択するためのゲーティング戦略を慎重に定義することが重要である31。さらに重要なことは、ミクログリアを特異的に標的とするマーカー(例えば、TMEM119、P2RY12)を選択する際には、病理学的および炎症状態中に発現レベルが変化する可能性があることを考慮することが重要であり32、そのような変化は、シナプスのミクログリアの飲み込みを定量化するためのFACSパネルを確立する前に考慮されるべきである。最後に、IHCおよび顕微鏡法に基づく in vivo アプローチを含む、前述のいずれの方法も、単独ではミクログリアによるシナプスの能動的かつ選択的な刈り込みを捉えることはできないことを強調することが重要です。これらの方法では、ミクログリアによる能動的な剪定と、脳実質内のシナプス残骸の受動的な清掃を区別することはできません。したがって、データを評価して議論する際には、これらの異なる概念を明確に区別することが不可欠です。

ミクログリアは、中枢神経系(CNS)に常在する免疫細胞です1。彼らは常に微小環境をスキャンし、監視を提供します1,2。さらに、それらは頻繁にシナプスと相互作用し、シナプス活動の微調整を仲介します3。したがって、彼らはシナプス精製のプロセスにおける主要なプレーヤーとして浮上しています。
シナプスの飲み込みによるシナプス微細化におけるミクログリアの役割は、さまざまな研究グループによって示されています3,4,5,6,7。このプロセスの混乱は、統合失調症やアルツハイマー病などの神経発達障害や神経変性疾患の病理に寄与する可能性があります8。ミクログリアによるシナプス精製の異常は、神経疾患のさまざまなマウスモデルですでに検出されています5,9,10。したがって、シナプスのミクログリアの飲み込みの根底にある明確なメカニズムの特定は、神経発達障害および神経変性疾患の病態生理学を理解するために最も重要です8。
シナプスのミクログリアを標的とすることは、疾患の進行に介入し、神経発達障害や神経変性疾患の根本的なメカニズムに関する洞察を得るための大きな可能性を秘めています。このような調査を容易にするためには、高速でハイスループットなアプローチが必要です。現在の方法論的アプローチには、ミクログリア内のシナプス物質の検出を可能にするin vivo、ex vivo、およびin vitroアッセイが含まれます。一般に、シナプスのミクログリアの飲み込みの検出は、免疫組織化学(IHC)および顕微鏡法に基づくアプローチ5,6,11に大きく依存しており、これらは労働集約的であり、多数のミクログリアの分析には限界があります。
これらの技術的な制限を考えると、代替方法論の探求が不可欠です。これを克服するために、フローサイトメトリーベースのアプローチを最適化し、シナプスのミクログリア包み込みの効率的で偏りのないハイスループットな解析を可能にしました。海馬を主な関心領域として選択したのは、その高度なシナプスリモデリングと可塑性12のためであるが、プロトコルはさまざまな脳領域に適応できる。フローサイトメトリーは、シナプス13、14、15のミクログリア包みを検出するために以前の研究ですでに使用されてきましたが、ここでは、現在市販されている蛍光色素標識vGLUT1抗体を採用した段階的な方法論を提供します。さらに、粗シナプトソームを用いたシナプス物質のミクログリア包み込みのハイスループットスクリーニングのための補完的なin vitro アプローチを提供しています。

<table><tbody><tr><td>1 mL Dounce Homogenizer</td><td>Active Motif</td><td>Cat# 40401</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Cat# 0030119452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45</td><td>BD</td><td>Cat# 559864</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6C</td><td>BD</td><td>Cat# 553104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G</td><td>BD</td><td>Cat# 551460</td><td></td></tr><tr><td>BCAタンパク質アッセイキット</td><td>Pierce</td><td>Cat# 23227</td><td></td></tr><tr><td>C-Tubes</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>CD11b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td>抗体 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#14-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>Cat# 554714</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat#41966029</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&acute;S リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;(DPBS)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 14190144</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 丸底ポリスチレン試験管&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Cat# 08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>固定可能な生存率染料</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Cat# L34969</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A medium</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# A1247501</td><td></td></tr><tr><td>LS-columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington</td><td>Cat# LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Th.Geyer</td><td>Cat# 17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 11339283</td><td></td></tr><tr><td>pHrodoRed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# P36600</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>Roche</td><td>Cat# 5892970001</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Cat# 11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Steritop E-GP Sterile Filtration System</td><td>Merck</td><td>Cat# SEGPT0038</td><td></td></tr><tr><td>SynPer Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 87793</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1 Antibody</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-120-764</td><td></td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

ミクログリアは、脳内のシナプス精製において極めて重要な役割を果たします。シナプスのミクログリア包み込みの分析は、このプロセスを理解するために不可欠です。しかし、現在利用可能なシナプスのミクログリア包み物を同定する方法は、免疫組織化学(IHC)やイメージングなど、手間と時間がかかります。この課題に対処するために、ここでは、フローサイトメトリーを使用してシナプスのミクログリア包みを迅速かつハイスループットに定量できる in vitro および in vivo* アッセイを紹介します。
in vivo*アプローチでは、成体マウス脳からの新鮮細胞単離後に細胞内vGLUT1染色を行い、ミクログリアによるvGLUT1+シナプスの飲み込みを定量化しました。in vitroシナプトソーム巻き込みアッセイでは、成体マウスの脳から新たに単離した細胞を用いて、ミクログリアによるpHrodo Red標識シナプトソームの巻き込みを定量しました。これらのプロトコルは、シナプスのミクログリア包み込みを定量化するための時間効率の良いアプローチを提供し、労働集約的な画像解析ベースの方法に代わる有望な選択肢となります。解析を効率化することで、これらのアッセイは、さまざまな疾患モデルにおけるシナプス精製におけるミクログリアの役割の理解を深めることに貢献できます。

本研究では、ミクログリアによるシナプスの in vivo*および in vitro の飲み込みを測定するための2つのプロトコルを最適化し、提示しました。最初のプロトコルでは、vGLUT1陽性シナプスの in vivo*飲み込みに焦点を当てました。出発点として、以前に公開されたプロトコル14を使用しました。しかし、このプロトコールで使用されたFACS抗体は廃止され、我々は多くの最適化ステップとミクログリア単離のための新しい方法を追加しました16。だからこそ、ここで紹介するプロトコルは、すでに公開されているプロトコルの包括的なアップデートとして、科学界と共有する価値があるのです。
シナプスのミクログリア包み込みを定量化するために、11-14週齢のC57BL/6N雄マウスを用いた。海馬は、その高度なシナプスリモデリングと可塑性のために、主要な関心領域として選択されました12。C57BL/6Nマウスの海馬における%vGLUT1陽性ミクログリアとミクログリア特異的なvGLUT1-PE蛍光強度(MFI)を解析した。同じ動物に由来する脾臓マクロファージを、実験ごとに生物学的陰性コントロールとして使用しました。海馬ミクログリアからのvGLUT1-PE蛍光シグナルが、アイソタイプコントロールや脾臓マクロファージと比較して高いことを実証することにより、vGLUT1抗体を試験しました(図1B-E)
さらに、小脳と嗅球のシナプスのミクログリアの飲み込みを比較しました(高いシナプス可塑性の別の基準として)20。その結果、海馬と比較して、嗅球からのミクログリアではvGLUT1蛍光シグナルが高く、小脳では低いシグナルが見出されました(図1F)。最も低いシグナル強度は脾臓マクロファージで検出され、内部ネガティブコントロールとして機能しました(図1E)。さらに、Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFPマウスを使用して、vGLUT1抗体の免疫反応性をテストしました。YFPは、これらのマウスのグルタミン酸作動性ニューロンによって発現され、YFP陽性集団にはvGLUT1陽性画分も含まれるべきであることを示しています。この染色プロトコルを使用して、YFP陽性集団の98.7%をvGLUT1陽性として検出し、抗体の有効性を検証しました(補足図S3)。
全体として、これらの結果は、vGLUT1抗体と提示された染色プロトコルの効率を検証しています。このプロトコルと抗体は、他の実験的アプローチと比較して、シナプスの in vivo*飲み込みをハイスループットかつ迅速に定量するために自信を持って使用できることを示しています。
次に、in vitro法に移り、成体ミクログリアを単離し、同じ動物から単離した新たに分離したpHrodo Red標識シナプトソームとインキュベートして、in vitroでの飲み込みを定量しました(図2A)。シナプトソームをpHrodo Redで標識すると、酸性の周囲のpH21で蛍光シグナルが自然に増加します。我々は新たにシナプトソームを単離し、それらを異なるpH値(pH = 4およびpH = 11)に曝露した。原理証明実験として低pHでの蛍光シグナルの増加を確認した後(図2B)、これらのシナプトソームを新たに単離したミクログリアと1.5〜2時間インキュベートしました。コントロールとして、ミクログリアを非標識シナプトソームとインキュベートしました。次に、CD11b++/CD45+ミクログリア由来のpHrodo Red-PE蛍光シグナルを解析し、pH = 4でシナプトソームから得られるものと同等の正のPE蛍光を観察しました(図2C)。したがって、この方法は、シナプトソームのin vitroエンベロープの高速かつハイスループットな解析を提供し、必要な最適化ステップに従って、アミロイドプラークや他の潜在的なターゲットのエンベロープに拡張することができます。実際、Rangarajuらは、同様のフローサイトメトリーベースのアプローチを用いて、ミクログリアによるアミロイドベータの巻き込みを定量化した22。結論として、これら 2 つの方法は、in vivo* と in vitro の両方で、シナプスのミクログリア巻き込みの堅牢で効率的、かつハイスループットな定量を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig01v4.jpg"> 図1:vGLUT1+ シナプスのミクログリア包みのin vivo*の解析。 (A)細胞内vGLUT1染色のステップを示す実験ワークフローの図解。(B)海馬からの単一/CD11b++/CD45+/生細胞集団を定義するためのゲーティング戦略。この集団は、vGLUT1-MFIの分析と、海馬におけるvGLUT1+ ミクログリアの割合の定量化に使用されました。赤い長方形で示されているゲートは、全サンプル中のvGLUT1+ 細胞分率を示しています。(C)ヒストグラムはvGLUT1-PEの蛍光強度を示しています。(D)赤色の長方形で示されているゲートは、アイソタイプ-PE免疫反応性を示す陽性細胞画分がないことを示しています。ヒストグラムは、Isotype-PE蛍光強度を示しています。(E)赤四角で示されたゲートは、脾臓マクロファージにおいてvGLUT1-PE免疫反応性を示す陽性細胞画分がないことを示しています。ヒストグラムはvGLUT1-PE蛍光強度を示しています。ヒストグラムに示されているゲートは、脾臓からの vGLUT1-MFI が終了するレベル (~104) から始まり、脳サンプル中の vGLUT1 陽性画分を分析するために使用されます。(F)重ね合わせたヒストグラムは、脾臓マクロファージ(灰色)と海馬(赤)、小脳(紫)、嗅球(水色)のミクログリアのPE蛍光強度の比較を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig02.jpg"> 図2:in vitroでのシナプトソームシナプスのミクログリア巻き込みの分析 (A)in vitroシナプトソーム巻き込みアッセイのステップを示す実験ワークフローの図解。(B)2つの異なるpH値でインキュベートされたシナプトソームは、pH = 11で低いpHrodo Red-PE蛍光シグナルを示し、pH = 4で高いpHrodoRed-PE蛍光を示します。(C)単一/CD11b++/CD45+細胞集団を用いて、pHrodo Red-PE蛍光強度を分析した。未染色のシナプトソームとインキュベートしたミクログリアをネガティブコントロールとして使用した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:このプロトコルで使用されるバッファと試薬のリスト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_table%201.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:分離されたばかりの成体ミクログリアの代表画像。 パパインベースの組織解離プロトコルとCD11b +ミクログリアのMACSベースの単離に続いて、20倍対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用して取得した画像。スケールバー = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S2:脾臓マクロファージを定義するためのゲーティング戦略を示す代表的なFACSプロット。 脾臓は、海馬のシナプスのミクログリア巻き込みをテストしながら、実験の実行ごとに実験で陰性コントロールとして使用されました。上記のFACSプロットは、脾臓マクロファージをCD11b ++/CD45++/生存可能な集団として定義しています。この集団は、この閾値ゲートより上に存在する脳サンプル中のvGLUT1+ ミクログリアを定量化するための閾値を設定するために使用されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-2.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S3:vGLUT1抗体の効率をテストするためのゲーティング戦略を示す代表的なFACSプロット。 (A)vGLUT1染色のステップを示す実験ワークフローの図解。YFP+ グルタミン酸作動性ニューロンを用いて、vGLUT1抗体の免疫反応性を試験しました。(B)vGLUT1 FACS抗体の効率をテストするためのポジティブコントロールとして使用されたVglut-IRES-Cre//ChR2-YFPマウスの海馬からYFP+ 集団を定義するためのゲーティング戦略。YFP+ フラクションは、グルタミン酸作動性シナプスを特定するためにゲートされました。この集団では、vGLUT1抗体の免疫反応性を分析して、抗体の免疫反応性をテストしました。(C)アイソタイプコントロールと比較;YFP陽性細胞画分の97.9%が(D)vGLUT1陽性として検出されます。(E)重ね合わせヒストグラムは、アイソタイプとvGLUT1抗体のPE蛍光の比較を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-3.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、フローサイトメトリーを使用してvGLUT1陽性シナプスとpHRodo Red標識粗シナプスソームのミクログリア包みを定量化するための2つのプロトコルを紹介します。

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

私たちの研究は精神神経免疫学にあり、免疫系と脳および心とのクロストークを調査しています。特に、患者の免疫状態に基づいて患者のサブグループを解読し、彼らに合わせた治療法を見つけることに興味があります。私たちの分野での最近の開発には、例えばPETリガンドの開発が含まれますが、RNAシーケンシング、シングルセルRNAシーケンシング、免疫ベースの治療法を解読するための空間的RNAシーケンシングなどの高度な技術も含まれます。私たちのプロトコルは、シナプス物質のミクログリアの飲み込みを定量化するという課題に対処しており、これは脳機能や疾患の病理における役割を理解するために重要です。私たちのプロトコールは、ミクログリアによる飲み込まれたシナプス材料の迅速かつ信頼性の高い定量を提供し、したがってミクログリアの機能活性に関する洞察を提供します。私たちのプロトコルは、他の研究グループが、飲み込まれたモトシナプトソームなど、より機能的なアッセイを研究に含めるように促し、これにより、神経免疫相互作用におけるミクログリアの役割についてより良く、より包括的な理解につながります。

quantification-microglial-engulfment-synaptic-material-using-flow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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