鉄飢餓および嫌気性増殖後の エルシニア偽結核 III型分泌系活性の定量化
May 31st, 2024
細菌は、酸素と鉄のバイオアベイラビリティが異なる宿主組織にコロニーを形成しますが、細菌を研究するほとんどのアプローチでは、曝気されたリッチ培地を使用します。このプロトコルは、ヒトの病原体である エルシニア偽結核 をさまざまな鉄濃度と酸素張力の下で培養し、重要な病原性因子である エルシニア III型分泌システムの活性を定量化することを説明しています。
細菌性病原体は、病原性因子を使用して、宿主生物内のさまざまなニッチにコロニーを形成します。私たちは、細菌性病原体が宿主組織の特定の環境手がかりをどのように感知して病原性因子の発現を調節するかを理解するために取り組んでいます。ヒト病原体であるエルシニア偽結核は、3型分泌系の病原性因子を使用して、エフェクタータンパク質を宿主細胞に注入します。
タイプ3の分泌システムにより、細菌は宿主の防御メカニズムを破壊し、宿主組織にコロニーを形成することができます。しかし、エルシニアIII型分泌系の発現は代謝的に負担が大きいため、3型分泌系遺伝子の発現は温度などの環境合図に応答して厳密に制御されています。私たちの以前の出版物は、エルシニアIII型分泌系の発現が、ISCRと呼ばれる転写因子を介して鉄の利用可能性と酸素張力によって制御されることを示しました。
これらの発見は、エルシニアが鉄含有量と酸素圧が異なる宿主組織にコロニーを形成するため、重要です。例えば、腸管腔にはエルシニアの成長に十分な鉄が含まれていますが、酸素圧は低いです。対照的に、血液のような組織は鉄の利用可能性が非常に低いですが、酸素圧は高くなります。
私たちの方法により、利用可能な鉄と酸素の量が異なる培養条件でエルシニアを成長させ、これらの環境手がかりがタイプ3分泌システムの発現にどのように影響するかを研究することができます。この方法は、鉄と酸素の利用可能性が3型分泌系の発現を制御する分子メカニズムを決定するのに役立ち、これがエルシニア感染の結果をどのように制御するかを理解するのに役立ちます。まず、Lysogenyブロス寒天プレートにYersinia偽結核を縞模様にします。
プレートを室温で48時間インキュベートします。コロニーが形成されたら、1つの孤立したコロニーを4ミリリットルのM9培地に接種します。250 RPMで曝気しながら摂氏26度で一晩培養します。
培養物を入れたキュベットを分光計にセットし、鉄を補給せずに14ミリリットルの滅菌キレート化M9培地で培養液を希釈し、OD600値を0.1にします。フラスコを摂氏26度のシェーカーに入れ、8時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、培養を使用して3つの新しい培養を開始します。2つは嫌気性成長用、1つは好気性成長用です。
好気性培養の場合は、鉄を補給せずに無菌キレートM9培地14ミリリットルで培養物をOD600値0.1に希釈します。その後、26°Cのエアレーションで12時間培養します。嫌気性培養の場合は、14ミリリットルの滅菌キレートM9培地で培養物を希釈して、2本の酸洗浄ガラス管にします。
最初のチューブに、フィルター滅菌した硫酸鉄を最終濃度1リットルあたり1ミリグラムまで加えます。2番目のチューブに、硫酸鉄を加えて最終濃度を1リットルあたり0.01ミリグラムにします。両方のチューブを嫌気性チャンバーで室温で12時間インキュベートします。
次に、嫌気性培養物を摂氏37度にシフトし、4時間インキュベーションを続けることにより、3型分泌系の活性を誘導します。次に、好気的に成長する培養物をOD600値0.2に希釈し、14ミリリットルのキレート化M9培地を2つの酸洗浄フラスコに加えます。必要な最終濃度の硫酸鉄をフラスコに加えます。
両方のフラスコを摂氏26度、250 RPMの曝気で2時間インキュベートします。2時間後、培養物を摂氏37度にシフトし、250 RPMで4時間曝気して、3型分泌系の活性を誘導します。エルシニア偽結核で3型分泌系を誘導した後、この培養物の正規化された容量を15ミリリットルのチューブに移しました。
タンパク質沈殿制御として、各チューブに4マイクロリットルのウシ血清アルブミンを添加します。培養物を3,200Gで4°Cで15分間遠心分離します。シリンジに取り付けられた0.22ミクロンのPVDFフィルターを使用して、上清を新しい15ミリリットルのチューブにろ過します。
次に、上清量の10%に相当するトリクロロ酢酸を追加します。チューブを1分間激しく渦巻きます。チューブを氷の上で摂氏4度の冷蔵室で一晩インキュベートします。
次に、各サンプルの2ミリリットルを2ミリリットルのチューブに加え、次いで21, 000Gで摂氏4度で15分間遠心分離する。真空アタッチメントを使用して上清を吸引します。2ミリリットルのサンプルを同じチューブにピペッティングし、遠心分離し、上清を吸引します。
沈殿反応を1本の2ミリリットルチューブに統合します。ペレットを氷冷した100%アセトン1ミリリットルで洗浄し、続いて遠心分離を行い、上清を吸引します。最後に上清を取り除いた後、ベンチでペレットを1時間乾燥させます。
沈殿したタンパク質は、チューブの側面に沿って霞のように見えるはずです。次に、各ペレットを50マイクロリットルのF-S-B-DTT溶液に再懸濁します。1分間徹底的に渦巻きます。
次に、サンプルを摂氏95度のヒートブロックで15分間煮沸します。その後、室温で最高速度で短時間遠心分離します。各嫌気性サンプル15マイクロリットルと各好気性サンプル10マイクロリットルを12.5%SDS-PAGEゲルにロードして分析します。
ゲルランが完了したら、銀染色を使用してゲル上のタンパク質を可視化します。まず、エルシニア偽結核の分離された好気性サンプルを含むSDS-PAGEゲルをイメージングシステムに配置します。ソフトウェアで、すべてのウェルで3型分泌系エフェクタータンパク質であるYopEを表すバンドを選択します。
参照 YopE バンドを適切なサンプルに設定します。ソフトウェアで計算されたすべてのYopEバンドの相対定量値をエクスポートします。次に、すべてのウェルのすべてのBSAバンドを選択します。
参照 BSA バンドが参照 YopE バンドのサンプルと一致することを確認します。すべてのBSAバンドの相対定量値をエクスポートします。YopE 値を各条件の BSA 値で除算して、正規化された結果を生成します。
銀染色したSDS-PAGEゲルにより、嫌気性サンプルでは、高鉄サンプルと比較して、低鉄サンプルに38倍のYopEが存在することが明らかになりました。好気性サンプルでは、これらのタンパク質はほぼ同量で分泌されていました。
概要
この研究は、ヒト病原体である偽結核菌が鉄の利用可能性や酸素濃度などの環境条件に応じて、その病原性因子であるIII型分泌系をどのように制御するかを調査しています。この研究は、この病原性因子の発現がもたらす代謝負荷と、その制御に関わるメカニズムに焦点を当てています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 病原体学
- 宿主-病原体相互作用
背景
- 細菌病原体は宿主組織に定着するために病原性因子を利用します。
- III型分泌系は宿主細胞にエフェクタータンパク質を注入するために重要です。
- 病原性因子の発現は環境条件によって制御されています。
- 鉄の利用可能性と酸素濃度は偽結核菌におけるIII型分泌系の発現に大きな影響を与えます。
研究目的
- 偽結核菌がどのように環境条件を感知するかを理解すること。
- 様々な条件下でのIII型分泌系の制御を調査すること。
- 病原性因子の発現がもたらす代謝的影響を探ること。
使用した方法
- 様々な鉄濃度下での偽結核菌の培養。
- 細菌の成長時の酸素濃度の調整。
- III型分泌系の活性の定量化。
- 病原性因子の発現に関わる制御メカニズムの分析。
主な結果
- 偽結核菌は鉄と酸素のレベルに基づいてIII型分泌系を制御します。
- III型分泌系の発現は代謝的にコストがかかり、厳密に制御されています。
- 環境条件は病原体の病原性に大きな影響を与えます。
- この研究結果は宿主環境における細菌の適応を理解するのに貢献します。
結論
- この研究は細菌病原性因子の制御メカニズムについての洞察を提供します。
- これらのメカニズムを理解することで、細菌感染症と闘うための戦略に情報を提供できます。
- 将来の研究では、病原性に影響を与える追加の環境要因を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of Yersinia pseudotuberculosis T3SS activity under iron starvation and anaerobic growth provides a robust framework for interrogating pathogen virulence regulation in host-relevant conditions. This approach enables mechanistic de-risking of antimicrobial targets by linking environmental cues to effector protein secretion, directly informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for antimicrobial discovery campaigns focused on T3SS inhibition.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of T3SS regulatory mechanisms in response to iron and oxygen, clarifying virulence pathway control.
- Supports functional target validation by quantifying effector secretion under defined environmental conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking for T3SS as an antimicrobial target.
- Provides a platform for hypothesis-driven evaluation of virulence factor modulation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized protocols for inducing and quantifying T3SS activity in vitro.
- Enables reproducible measurement of secreted effector proteins using SDS-PAGE and silver staining.
- Supports assay readiness for compound screening targeting T3SS function.
- Allows normalization and quantitative comparison across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro conditions with host-relevant iron and oxygen environments encountered during infection.
- Facilitates translational continuity by modeling pathogen adaptation to mammalian tissue niches.
- Enables risk-adjusted advancement of T3SS-targeted candidates based on functional readouts.
- Provides a framework adaptable to other pathogens with robust iron uptake systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation for anti-virulence strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on environmental regulation of T3SS and virulence factor expression.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for effector secretion under defined conditions.
- Analytics: Enables normalization and statistical comparison of protein secretion across iron and oxygen gradients.
- Translational Research: Models pathogen behavior in host-like environments, informing preclinical candidate selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol for evaluating T3SS activity in diverse Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T3SS as a drug target by linking environmental cues to functional output.
- Operational Value: Standardizes effector quantification and assay conditions for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for T3SS-targeted programs by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-virulence candidates based on mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culturing under controlled iron and oxygen conditions.
- Needs access to acid-washed glassware, chelated media, and protein quantification infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and quantification protocols.
- Adaptable to other pathogens with similar iron uptake systems, pending optimization.
- Dependent on accurate normalization and statistical analysis of effector protein outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:06
Yersinia pseudotuberculosis Culture Under Varying Oxygen Tension and Iron Levels
4:51
Trichloroacetic Acid Precipitation of T3SS Effector Proteins from Yersinia pseudotuberculosis Culture
7:19
Relative Quantification of T3SS Activity in Yersinia pseudotuberculosis Cultured in Varying Iron Levels and Oxygen Tension
8:14
Representative Results
