鉄飢餓および嫌気性増殖後の エルシニア偽結核 III型分泌系活性の定量化

細菌性病原体は、病原性因子を使用して、宿主生物内のさまざまなニッチにコロニーを形成します。私たちは、細菌性病原体が宿主組織の特定の環境手がかりをどのように感知して病原性因子の発現を調節するかを理解するために取り組んでいます。ヒト病原体であるエルシニア偽結核は、3型分泌系の病原性因子を使用して、エフェクタータンパク質を宿主細胞に注入します。

タイプ3の分泌システムにより、細菌は宿主の防御メカニズムを破壊し、宿主組織にコロニーを形成することができます。しかし、エルシニアIII型分泌系の発現は代謝的に負担が大きいため、3型分泌系遺伝子の発現は温度などの環境合図に応答して厳密に制御されています。私たちの以前の出版物は、エルシニアIII型分泌系の発現が、ISCRと呼ばれる転写因子を介して鉄の利用可能性と酸素張力によって制御されることを示しました。

これらの発見は、エルシニアが鉄含有量と酸素圧が異なる宿主組織にコロニーを形成するため、重要です。例えば、腸管腔にはエルシニアの成長に十分な鉄が含まれていますが、酸素圧は低いです。対照的に、血液のような組織は鉄の利用可能性が非常に低いですが、酸素圧は高くなります。

私たちの方法により、利用可能な鉄と酸素の量が異なる培養条件でエルシニアを成長させ、これらの環境手がかりがタイプ3分泌システムの発現にどのように影響するかを研究することができます。この方法は、鉄と酸素の利用可能性が3型分泌系の発現を制御する分子メカニズムを決定するのに役立ち、これがエルシニア感染の結果をどのように制御するかを理解するのに役立ちます。まず、Lysogenyブロス寒天プレートにYersinia偽結核を縞模様にします。

プレートを室温で48時間インキュベートします。コロニーが形成されたら、1つの孤立したコロニーを4ミリリットルのM9培地に接種します。250 RPMで曝気しながら摂氏26度で一晩培養します。

培養物を入れたキュベットを分光計にセットし、鉄を補給せずに14ミリリットルの滅菌キレート化M9培地で培養液を希釈し、OD600値を0.1にします。フラスコを摂氏26度のシェーカーに入れ、8時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、培養を使用して3つの新しい培養を開始します。2つは嫌気性成長用、1つは好気性成長用です。

好気性培養の場合は、鉄を補給せずに無菌キレートM9培地14ミリリットルで培養物をOD600値0.1に希釈します。その後、26°Cのエアレーションで12時間培養します。嫌気性培養の場合は、14ミリリットルの滅菌キレートM9培地で培養物を希釈して、2本の酸洗浄ガラス管にします。

最初のチューブに、フィルター滅菌した硫酸鉄を最終濃度1リットルあたり1ミリグラムまで加えます。2番目のチューブに、硫酸鉄を加えて最終濃度を1リットルあたり0.01ミリグラムにします。両方のチューブを嫌気性チャンバーで室温で12時間インキュベートします。

次に、嫌気性培養物を摂氏37度にシフトし、4時間インキュベーションを続けることにより、3型分泌系の活性を誘導します。次に、好気的に成長する培養物をOD600値0.2に希釈し、14ミリリットルのキレート化M9培地を2つの酸洗浄フラスコに加えます。必要な最終濃度の硫酸鉄をフラスコに加えます。

両方のフラスコを摂氏26度、250 RPMの曝気で2時間インキュベートします。2時間後、培養物を摂氏37度にシフトし、250 RPMで4時間曝気して、3型分泌系の活性を誘導します。エルシニア偽結核で3型分泌系を誘導した後、この培養物の正規化された容量を15ミリリットルのチューブに移しました。

タンパク質沈殿制御として、各チューブに4マイクロリットルのウシ血清アルブミンを添加します。培養物を3,200Gで4°Cで15分間遠心分離します。シリンジに取り付けられた0.22ミクロンのPVDFフィルターを使用して、上清を新しい15ミリリットルのチューブにろ過します。

次に、上清量の10%に相当するトリクロロ酢酸を追加します。チューブを1分間激しく渦巻きます。チューブを氷の上で摂氏4度の冷蔵室で一晩インキュベートします。

次に、各サンプルの2ミリリットルを2ミリリットルのチューブに加え、次いで21, 000Gで摂氏4度で15分間遠心分離する。真空アタッチメントを使用して上清を吸引します。2ミリリットルのサンプルを同じチューブにピペッティングし、遠心分離し、上清を吸引します。

沈殿反応を1本の2ミリリットルチューブに統合します。ペレットを氷冷した100%アセトン1ミリリットルで洗浄し、続いて遠心分離を行い、上清を吸引します。最後に上清を取り除いた後、ベンチでペレットを1時間乾燥させます。

沈殿したタンパク質は、チューブの側面に沿って霞のように見えるはずです。次に、各ペレットを50マイクロリットルのF-S-B-DTT溶液に再懸濁します。1分間徹底的に渦巻きます。

次に、サンプルを摂氏95度のヒートブロックで15分間煮沸します。その後、室温で最高速度で短時間遠心分離します。各嫌気性サンプル15マイクロリットルと各好気性サンプル10マイクロリットルを12.5%SDS-PAGEゲルにロードして分析します。

ゲルランが完了したら、銀染色を使用してゲル上のタンパク質を可視化します。まず、エルシニア偽結核の分離された好気性サンプルを含むSDS-PAGEゲルをイメージングシステムに配置します。ソフトウェアで、すべてのウェルで3型分泌系エフェクタータンパク質であるYopEを表すバンドを選択します。

参照 YopE バンドを適切なサンプルに設定します。ソフトウェアで計算されたすべてのYopEバンドの相対定量値をエクスポートします。次に、すべてのウェルのすべてのBSAバンドを選択します。

参照 BSA バンドが参照 YopE バンドのサンプルと一致することを確認します。すべてのBSAバンドの相対定量値をエクスポートします。YopE 値を各条件の BSA 値で除算して、正規化された結果を生成します。

銀染色したSDS-PAGEゲルにより、嫌気性サンプルでは、高鉄サンプルと比較して、低鉄サンプルに38倍のYopEが存在することが明らかになりました。好気性サンプルでは、これらのタンパク質はほぼ同量で分泌されていました。