Name: 髄芽腫のフェロトーシス表現型の解明 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: 学ぶフェロトーシス誘導による髄芽腫細胞死のメカニズム。フローサイトメトリーと脂質過酸化物解析を用いて、治療抵抗性細胞集団への新規治療戦略を探索する。小児がん治療への応用可能性を示す。

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この活動は、モナコ公国政府、GEMLUC(Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer)、フラヴィアン財団の支援を受け、BD FACS Melodyの購入手段を提供しました。

本研究は、DAOY野生型(WT)髄芽腫細胞株を用いて実施され、これを37°Cで培養し、5%CO2 含有DMEM培地に8%FBSを添加した。xCT欠失細胞株は、1 mM N-アセチルシステイン(NAC)を添加した培地で実験を行い、同じ条件下で維持しました。細胞は、市販のマイコプラズマ検出キット( 材料表を参照)を使用してマイコプラズマについて定期的にスクリーニングされ、10継 代目まで培養されました。
1. 細胞の収穫と播種
注:すべてのステップは、組織培養層流フードで滅菌無菌技術を使用して実行されます。DAOY髄芽腫細胞は接着性であり、Ca2+ およびMg2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄することにより、付着していないすべての細胞を廃棄できます。
<ol><li>細胞の入ったストックディッシュ(シャーレ、直径100mm)を取り、アスピレーターを使用してプレートから浮遊細胞と培地を取り除きます。</li>
	<li>皿に5〜10 mLのPBSを追加し、皿の円を描く動きで底を洗い、吸引器を使用してPBSをプレートから取り出します。</li>
	<li>トリプシン1mL(10倍希釈)を皿に加えます。プレートを軽くたたくと細胞が取り除かれるまで、プレートをインキュベートします。8% FBSを添加したDMEM培地10 mLを取り出し、皿から細胞を機械的に回収します。</li>
	<li>細胞懸濁液を15mLチューブに移します。</li>
	<li>細胞懸濁液500μLを取り出し、キュベットに入れて計数します。細胞懸濁液のmLあたりの細胞数を数えます。この研究では、自動セルカウンターを使用しました( 資料の表を参照)。</li>
	<li>細胞懸濁液から取り出すのに必要な量を計算して、1,00,000個の細胞を持ちます。</li>
	<li>6ウェルプレートを取り、計算された量の細胞懸濁液を各ウェルに加え、8% FBSを添加したDMEM培地を各ウェルに2mL加えます。</li>
</ol>2.細胞の処理
注:制御と治療は3回で行われます。グループは次のとおりです:コントロール(DMSO)、1μMのエラスチン、0.3μMのRSL3、250μMのFAC、2μMのフェロスタチン1、1μMのエラスチン+2μMのフェロスタチン1、0.3μM RSL3+2μMのフェロスタチン1、250μMのFAC+2μMのフェロスタチン1。実験には、 表1に示すように、4枚の6ウェルプレートが必要です。必要なすべての試薬の商業的な詳細は、 材料表に記載されています。
<ol><li>播種後24時間後、対応する処理を細胞とともにウェルに加えます。</li>
	<li>ディッシュを37°C、5%CO2 のインキュベーターに置いておきます。</li>
</ol>3. BODIPY 581/591 C11プローブによる処理細胞の脂質ヒドロペルオキシド染色
注:脂質ヒドロペルオキシド特異的プローブのストック溶液は、DMSOで1 mMの濃度で調製されます。原液のアリコートは、-20°Cで不透明なチューブで保存します。染色には、8% FBSを添加したDMEM培地中のプローブの2 μMワーキング溶液を調製します。
<ol><li>処理の6時間後、光学顕微鏡で細胞を観察します(細胞の丸みが見えるはずです)。</li>
	<li>インキュベーターから皿を取り出し、組織培養層流フードに入れます。 アスピレーターを使用して、メディアと浮遊(死んだ)細胞を取り除きます。</li>
	<li>各ウェルに2 mLのPBSを静かに加え、6ウェルプレートの円を描くようにして底を洗浄し、アスピレーターを使用してウェルからPBSを取り除きます。</li>
	<li>プローブの作業溶液2 mL(DMEMにFBSを添加した最終濃度2 μM)を加えます。</li>
	<li>ディッシュを37°Cおよび5%CO2 のインキュベーターに30分間暗所で放置します(プレートはアルミホイルで包むことができます)。</li>
</ol>4. 処理細胞中の脂質ヒドロペルオキシド含量のフローサイトメトリー解析
注意: 次の手順はすべて、暗闇で実行されます(層流フードにライトはありません)。
<ol><li>インキュベーターから皿を取り出し、組織培養層流フードに入れます。 吸引器を使用して、染色液を除去します。</li>
	<li>各ウェルに2 mLのPBSを静かに加え、6ウェルプレートの円を描くようにして底を洗浄し、アスピレーターを使用してウェルからPBSを取り除きます。</li>
	<li>洗浄手順をもう一度繰り返し、吸引器を使用してウェルから残っているPBSを吸引します。</li>
	<li>各ウェルの底に市販の細胞解離試薬( 材料表を参照)150 μLを加え、プレートを軽くたたいて細胞が取り出されるまでプレートをインキュベートします。250 μLのFACSバッファー(PBS、2 mM EDTA、0.5% BSA)を取り、ウェルから細胞を機械的に回収します。</li>
	<li>細胞をフィルターキャップ付きの対応する(以前にマークされた)FACSチューブに移します。分析が行われるまで、細胞を氷上に載せたチューブを暗所に置きます(分析は染色後1時間以内に行う必要があります)。 注:FACSマシンのセットアップとキャリブレーションは、使用するマシンによって異なります( 材料の表を参照)。</li>
	<li>新しい実験を作成し、名前を付けます(DAOYのフェロトーシス-脂質ヒドロペルオキシド)。</li>
	<li>実験計画では、レーザー(488 nm)とフィルター(FITC)を選択します。</li>
	<li>ビューデータで、適切なセルサイズ(>12μm)を選択し、PMT電圧を設定し(セル集団はSSC-H/FSC-Hドットプロットの最初の象限に表示される必要があります)、ドットプロットをゲートします。</li>
	<li>新しいプロット - ヒストグラムを追加し、Y 軸に FITC-A と対数スケールを配置します。</li>
	<li>FACSチューブ内のサンプルをボルテックスし、FACSマシンに入れてサンプルをロードします。10,000 個の FSC シングレット イベントを記録し、ファイルに名前を付けます (例: DAOY WT CTL 6h)。ファイルを .fcs としてエクスポートします。</li>
</ol>5. ヨウ化プロピジウム(PI)による死細胞処理時の染色
注:実験デザインは、脂質ヒドロペルオキシド測定とまったく同じです(ステップ1およびステップ2を参照)。
<ol><li>播種後24時間で、インキュベーターから皿を取り出し、層流フードに入れます。</li>
	<li>培地(死細胞を含む)を15 mLチューブに集めます。</li>
	<li>各ウェルに1 mLのPBSを加え、6ウェルプレートの円を描くようにして底を洗浄し、PBSをそれぞれの培地でチューブに集めます。</li>
	<li>各ウェルの底に200 μLのトリプシン(10倍希釈)を加え、プレートを優しく軽くたたいて細胞が取り除かれるまでプレートをインキュベートします。それぞれの培地+ PBSを使用して、ウェルから細胞を回収します。</li>
	<li>細胞懸濁液を180 x g で室温で10分間遠心分離します。吸引器を使用して上清を取り除きます。</li>
	<li>細胞ペレットを300 μLのFACSバッファーに再懸濁し、分析まで氷上に置きます。</li>
	<li>分析の直前に、PI溶液( 材料表を参照)を最終濃度2 μg/mLまで加えます。</li>
</ol>6. 処理後24時間後の死細胞のフローサイトメトリー解析
注:FACSマシンの設定とキャリブレーションは、前に示したとおりに行われます(ステップ4を参照)。
<ol><li>新しい実験を作成し、名前を付けます(DAOYのフェロトーシス-細胞死)。</li>
	<li>実験計画では、レーザー(488 nm)とフィルター(PE)を選択します。</li>
	<li>ビューデータで、適切なセルサイズ(>12μm)を選択し、PMT電圧を設定し(セル集団はSSC-H/FSC-Hドットプロットの最初の象限に表示される必要があります)、ドットプロットをゲートします。</li>
	<li>新しいプロット - ヒストグラムを追加し、PE-A を y 軸と対数スケールにします。</li>
	<li>FACSチューブ内のサンプルをボルテックスし、FACSマシンに入れてサンプルをロードします。</li>
	<li>10,000 個の FSC シングレット イベントを記録し、ファイルに名前を付けます (例: DAOY WT CTL 6h)。ファイルを .fcs としてエクスポートします。</li>
</ol>7. DAOY xCT-/-細胞における脂質ヒドロペルオキシド含量のフローサイトメトリー解析
注:xCT−/− 細胞は、前述のように生成されている24。
<ol><li>この実験では、ステップ2で示されたように細胞を播種しますが、処理の代わりに、培地に1 mM NACを一晩補充します。</li>
	<li>翌日、NAC を 1 つのグループで保持し、もう 1 つのグループから NAC を削除します。</li>
	<li>ステップ6で説明したのとまったく同じ方法で、脂質ヒドロペルオキシド含有量のフローサイトメトリー分析を実行します。</li>
</ol>8. フローサイトメーターの結果の解析
<ol><li>FlowJo ソフトウェアで .fcs ドキュメントを開きます ( 「資料の表」を参照)。</li>
	<li>個々のファイルをダブルクリックすると、個々のサンプルに記録されたすべてのイベント(FCSシングレットだけでなく)が開きます(SSC-A/FSC-Aドットプロット)。マシン上で行われたゲートが保持されないような設定になっているため、ゲートをもう一度作成し、母集団に名前を付ける必要があります(例:DAOY WT)。</li>
	<li>ゲートされた母集団をダブルクリックすると、ヒストグラムのある別のウィンドウが開きます。</li>
	<li>Y軸を使用する蛍光フィルター(Comp-FITC/PE-A)に変更します。</li>
	<li>X軸を モーダル に変更します(各ピークをそのモード、つまり、特定のビンで見つかったセルの最大数の%に正規化します)。</li>
	<li>ヒストグラムをレイアウトエディタにコピーします。これをすべてのサンプルに対して繰り返し、新しいヒストグラムをレイアウトエディタに貼り付けるたびに、ヒストグラムがオーバーレイされるように前のヒストグラムの上にドラッグします(半分のオフセット)。</li>
</ol>

フェロトーシス性髄芽腫細胞における脂質ヒドロペルオキシドのFACS分析

<ol><li>Dixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+An+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Yang, W. S., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+screening+identifies+compounds+activating+iron-dependent%2C+nonapoptotic+cell+death+in+oncogenic-ras-harboring+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells.</a> Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Meister, A., Anderson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione.</a> Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).</li>
<li>Lewerenzm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystine%2Fglutamate+antiporter+system+xc-+in+health+and+disease%3A+From+molecular+mechanisms+to+novel+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Bersuker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQ+oxidoreductase+FSP1+acts+parallel+to+GPX4+to+inhibit+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis.</a> Nature. 575, 688-692 (2019).</li>
<li>Doll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSP1+is+a+glutathione-independent+ferroptosis+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor.</a> Nature. 575, 693-698 (2019).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+GCH1%2FBH4+axis+activates+ferritinophagy+to+mitigate+the+resistance+of+colorectal+cancer+to+erastin-induced+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis.</a> Front Cell Dev Biol. 10, (2022).</li>
<li>Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ferroptosis+as+a+vulnerability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).</li>
<li>Viswanathan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+a+therapy-resistant+state+of+cancer+cells+on+a+lipid+peroxidase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway.</a> Nature. 547, 453-457 (2017).</li>
<li>Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+epithelial-mesenchymal+transition+promotes+ferroptosis+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer.</a> Redox Biol. 37, 101697(2020).</li>
<li>Hangauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-tolerant+persister+cancer+cells+are+vulnerable+to+GPX4+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition.</a> Nature. 551, 247-250 (2017).</li>
<li>Zhang Tuo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+induces+ACSL4-dependent+ferroptosis+during+cerebral+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion.</a> Signal Transduct Target Ther. 7, 59(2022).</li>
<li>Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ferroptosis+and+emerging+links+to+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Front Aging Neurosci. 14, (2022).</li>
<li>Zhuo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+ferroptosis+in+glioblastoma%3A+Therapeutic+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges.</a> Front Mol Biosci. 9, (2022).</li>
<li>Bisaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+from+medullospheres+reveals+a+role+for+iron+in+the+cancer+progression+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma.</a> Mol Cell Ther. 3, 8(2015).</li>
<li>Schonberg, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+iron+trafficking+characterizes+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells.</a> Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).</li>
<li>Werbowetski-Ogilvie, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sorting+to+sequencing+in+the+molecular+era%3A+the+evolution+of+the+cancer+stem+cell+model+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma.</a> FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).</li>
<li>Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+cystine-glutamate+exchange+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis.</a> Elife. 3, e02523(2014).</li>
<li>Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+modulates+cell+survival+in+a+Ras-+and+MAPK-dependent+manner+in+ovarian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells.</a> Cell Death Dis. 4, e592(2013).</li>
<li>Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C11-BODIPY581%2F591%2C+an+oxidation-sensitive+fluorescent+lipid+peroxidation+probe%3A+%28Micro%29spectroscopic+characterization+and+validation+of+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology.</a> Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).</li>
<li>Miotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mechanism+of+ferroptosis+inhibition+by+ferrostatin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1.</a> Redox Biol. 28, 101328(2020).</li>
<li>Daher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablation+of+the+cystine+transporter+xCT+in+PDAC+cells+inhibits+mTORC1%2C+growth%2C+survival%2C+and+tumor+formation+via+nutrient+and+oxidative+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses.</a> Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).</li>
<li>Shimada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+cell+death+mechanisms+reveals+metabolic+regulation+of+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis.</a> Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).</li>
<li>Yang, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+lipoxygenases+drives+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).</li>
<li>Gaschler, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FINO2+initiates+ferroptosis+through+GPX4+inactivation+and+iron+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation.</a> Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).</li>
<li>Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryparedoxin+peroxidase-deficiency+commits+trypanosomes+to+ferroptosis-type+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death.</a> Elife. 7, e37503(2018).</li>
<li>Cheloni, G., Slaveykova, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+C11-BODIPY581%2F591+dye+for+the+determination+of+lipid+oxidation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry.</a> Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).</li>
<li>Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitation+of+BODIPY+as+a+probe+for+the+evaluation+of+lipid+peroxidation+and+its+inhibition+by+antioxidants+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma.</a> Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducer+erastin+irreversibly+inhibits+system+xc%E2%88%92+and+synergizes+with+cisplatin+to+increase+cisplatin%27s+cytotoxicity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin's cytotoxicity in cancer cells.</a> Sci Rep. 8, 968(2018).</li>
<li>Cheff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducing+compounds+RSL3+and+ML162+are+not+direct+inhibitors+of+GPX4+but+of+TXNRD1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1.</a> Redox Biol. 62, 102703(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+degradation+mechanism+of+GPX4+degrader+in+induction+of+ferroptosis+exerting+anti-resistant+tumor+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect.</a> Eur J Med Chem. 247, 115072(2023).</li>
<li>Vucetic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Together+we+stand%2C+apart+we+fall%3A+how+cell-to-cell+contact%2Finterplay+provides+resistance+to+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis.</a> Cell Death Dis. 11, 789(2020).</li>
<li>Meira, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cystine-cysteine+intercellular+shuttle+prevents+ferroptosis+in+xctko+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers (Basel). 13 (6), 1434(2021).</li>
</ol>

私たちは、ここに提示された研究について利益相反を宣言しません。

フェロトーシス細胞死の主な特徴は、原形質膜における脂質ヒドロペルオキシドの制御不能な蓄積です。この酸化的損傷は、酵素的または非酵素的な方法で発生する可能性がありますが、いずれの場合も、反応は鉄依存性/触媒性であり、これがこのタイプの細胞死の名前を説明しています。脂質のヒドロペルオキシドは、4-ヒドロキシ-2,3-トランス-ノネナール(4-HNE)やマロヌアルデヒド(MDA)などの脂質ヒドロパーオキシドの分解生成物を測定することで間接的に推定されることがよくあります。これらの生成物は、多価不飽和脂肪酸の過酸化分解によって生成され、さまざまな高分子と反応し、神経変性疾患、糖尿病、慢性心不全など、さまざまな病状を引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、これらは過酸化イベントの結果であり、優れた脂質ヒドロペルオキシド特異的プローブの開発に多大な努力が払われてきました。
頻繁に使用されるプローブの1つはBODIPY 581/591 C11ですが、これにも考慮すべき欠点があります。具体的には、BODIPY 591/581蛍光色は、還元状態(590 nm)と酸化状態(510 nm)の2つの発光ピークを示します。これら2つの波長での蛍光の比率は、正確な定量が目的である場合、特に重要です。しかし、BODIPY 591/581 nmの単一発光蛍光の強度は、文献1,25,26,27,28、特に510 nmでの赤色発光の減少強度が酸化分子の蛍光の流出によって頻繁にマスクされるため、文献1,25,26,27,28全体で広く使用されています.これが、BODIPY 591/581の蛍光が通常、単一(緑色)蛍光強度の関数として定性的に表示される主な理由の1つです。
このプローブのもう一つの重要な制限は、濃度依存的な方法での酸化防止剤による蛍光発光抑制である30。したがって、染色は抗酸化物質を補給していない培地で行う必要があります。本プロトコルでは、脂質ヒドロペルオキシドの強力なスカベンジャーであるフェロスタチン1を使用した。それにもかかわらず、プローブを添加する前に、フェロスタチン1を除去し、プローブがその抗酸化活性にさらされないように細胞をPBSで洗浄した。
フェロトーシス誘導に関しては、多くの市販の薬物が使用できます。ここでは、xCTトランスポーター31の不可逆的な阻害剤であるエラスチンが用いられた。それがトランスポーターに共有結合することを考えると、さらに高濃度(最大100μM)を短時間(5分)使用することができ、その後に洗浄ステップ31を行うことができる。xCTの完全な阻害時のフェロトーシスの正確な動態を評価するために、NACの非存在下でxCT-/-細胞を利用しました。脂質ヒドロペルオキシドの大量の蓄積は6時間後に検出可能であり、播種後24時間で検出可能な生細胞はほとんど検出されませんでした。ナノモル領域のフェロトーシスの非常に強力な誘導物質であるRSL3は、xCT-/-細胞で観察されたものと同様の速度を示しました。その作用機序はまだかなり議論の余地がありますが、それは活性に影響を与えず、代わりにGPx4酵素32,33の分解を誘導するようです。
in vitroでのフェロトーシス誘導の重要な側面は、細胞の密度です。コンフルエントな細胞層は、システイン飢餓、xCTまたはGPx4阻害、GSH枯渇などに対してはるかに耐性があることが長い間観察されてきた34。主な理由は、身体的接触、すなわちコンフルエントがHippo経路の活性化につながり、その結果、代謝と活性酸素種(ROS)の内部産生がダウンレギュレートされるというものです。さらに、還元されたシステインのシャトルも、不完全なxCT阻害に対する耐性に寄与する可能性があります35。本研究では、ウェルあたり1,00,000個の細胞(6ウェルプレート)の濃度を使用して、かなり大きくて平らな細胞との低密度を維持しました。しかし、HD-MB03のような小さくて丸い形状のセルでは、この数をウェルあたり1,50,000〜2,00,000セル(6ウェルプレート)に増やすことができます。
本研究の最終的な制限は、ヨウ化プロピジウム(PI)法による細胞死の検出です。この方法は、あらゆるタイプの細胞死を検出するためにユーザーフレンドリーであり、フェロトーシスは、フェロスタチン-1などのフェロトーシス特異的阻害剤を使用することにより、他のタイプの細胞死と区別することができます。PI染色は、死にかけている細胞が膜の完全性を失い、PIが細胞に浸透し、DNA塩基間に挿入され、蛍光シグナルを放出するという事実に基づいています。ただし、脂質のヒドロ過酸化は膜の「漏れ」を誘発し、細胞死が発生する前でもPIの浸透を可能にすることは注目に値します。したがって、この方法のみに基づいてフェロトーシスの動力学を推定することは困難です。

フェロトーシスは、新たに状況化された活性酸素種(ROS)依存型の細胞死1です。ROSに加えて、鉄はこのタイプの細胞死において重要な役割を果たしているため、2という名前が付けられています。フェロトーシスの最終的かつ実行的なステップは、鉄触媒による脂質の酸化的損傷の細胞膜への蓄積であり、最終的には膜の完全性と選択的透過性の低下、そして最終的にはバブリングによる細胞死につながります。脂質のヒドロ過酸化イベントは自然に発生する現象です。しかしながら、細胞膜全体へのその伝播は、細胞の抗酸化防御によって妨げられる。この文脈での主要なプレーヤーは、Se-タンパク質グルタチオンペルオキシダーゼ4(GPx4)であり、膜に接近して脂質ヒドロペルオキシドを毒性の低いアルコール誘導体に変換することができます3。GPx4の還元力は、主に非必須アミノ酸(グリシン、グルタミン酸、システイン)で構成されるトリペプチドであるグルタチオン(GSH)によって提供されますが、これに限定されません。GSHの生合成のための律速アミノ酸はシステイン4です。システインは非必須アミノ酸として分類されますが、その必要量は、増殖性の高い細胞(がん細胞など)では容易に内部産生を超える可能性があります。したがって、半必須アミノ酸のグループに再分類されました。システインの必要な輸入は、主にXc-システムを通じて行われ、これにより、グルタミン酸の輸出を犠牲にして、酸化された(支配的な)形態のシステイン(別名シスチン)の輸入が可能になります5。Xc-システムは、xCTとして知られるNa+非依存性Cl依存性の輸送サブユニットと、CD98として知られるシャペロンサブユニットで構成されています。最近まで、xCT-GSH-GPx4軸の抗フェロトーシス特性は、ユニークで再現不可能であると考えられてきました6。しかし、2019年には、ユビキノール(コエンザイムQ10)とその再生酵素であるフェロトーシス抑制タンパク質1(FSP1)からなる代替の抗フェロトーシス経路が記載されています7,8。その後まもなく、GTPシクロヒドロラーゼ-1/テトラヒドロビオプテリン(GCH1/BH4)を含む脂質ヒドロペルオキシド解毒システムがさらに報告されています9。それにもかかわらず、フェロトーシスの予防におけるxCT-GSH-GPx4軸の中心的な役割は挑戦されていないようです。
過去 10 年間で、フェロトーシスはさまざまな種類の腫瘍で広く研究され、抗がん戦略として大きな可能性を示しています (Lei et al.10 によるレビュー)。さらに、従来の化学療法に対して高い耐性を示すがん細胞や転移傾向を示すがん細胞は、GPx4の阻害剤などのフェロトーシス誘導物質に対して驚くほど感受性が高いことが報告されています11,12,13。しかし、脳腫瘍の文脈では、フェロトーシス誘導剤の可能性は依然としてほとんど研究されていません。このタイプの細胞死は、脳虚血再灌流障害14および神経変性疾患15と密接に関連していますが、脳腫瘍の文脈でのその可能性は、主に最も一般的な悪性頭蓋脳腫瘍である膠芽腫に限定されています(Zhuoらによるレビュー16)。一方、最も一般的な悪性小児脳腫瘍であり、小児死亡の主な原因である髄芽腫のフェロトーシス誘導物質に対する感受性は、ほとんど解明されていません。私たちの知る限りでは、フェロトーシスと髄芽腫を関連付ける査読済みの文献はほとんどありません。それにもかかわらず、いくつかの研究は、鉄が髄芽腫と膠芽腫がん幹細胞(CSC)の両方の生存、増殖、および腫瘍形成の可能性に重要な役割を果たしていることを明らかにしています17,18、潜在的にそれらをフェロトーシス誘導に対してより脆弱にします。髄芽腫は、CSC、または腫瘍開始/増殖細胞の亜集団で悪名高く、腫瘍の化学療法抵抗性、播種、および再発に大きく関与していると思われるため、これは特に重要です19。
フェロトーシス誘導に対する感度は、通常、脂質ヒドロペルオキシドの含有量/蓄積を測定することによって調査されますが、これは細胞死につながる場合とそうでない場合があります。最も一般的に使用されるフェロトーシス誘導物質は、(1)xCTトランスポーター20の阻害剤であるエラスチン、(2)GPx4酵素2の阻害剤であるRSL3、および/または(3)クエン酸フェロアンモニウム(FAC)21などの鉄供与体である。脂質ヒドロペルオキシド含有量は、選択的プローブBODIPY 581/591 C1122を使用して評価されます。このプローブは、還元状態で581/591 nmに励起および発光が最大です。脂質ヒドロペルオキシドとの相互作用と酸化により、プローブはその励起および発光の最大値を488/510 nmにシフトします。通常、脂質ヒドロペルオキシド含有量の大幅な増加は、フェロトーシス細胞死に先行します。フェロトーシスはプログラムされた細胞死ではないため、その実行につながる分子シグナル伝達カスケードはありません。したがって、それを確認する唯一の方法は、脂質ヒドロペルオキシド含有量を監視し、このタイプの細胞死に対してフェロスタチン123などの特定の阻害剤を使用することです。フェロスタチン1は、細胞の脂質コンパートメントに浸透し、脂質ヒドロペルオキシドを解毒し、それによってフェロトーシスイベントを防止できる親油性抗酸化物質です。

<table><tbody><tr><td>BODIPY 581/591 C11</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3861</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Beckman</td><td>Coulter Z1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Erastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7781-5MG</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸フェロアンミニウム</td><td>Acros Organics 211842500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0583-25MG</td><td></td></tr><tr><td>胎児ボビン血清 (FBS)</td><td>Dominique Dutcher</td><td>500105N1N</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Melody</td><td></td></tr><tr><td>Gibco StemPro Accutase 細胞解離試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11599686</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>PlasmoTest マイコプラズマ検出キット</td><td>InvivoGen</td><td>rep-pt1</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2234-25MG</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン - EDTA 10X - 100 mL</td><td>Dominique Dutcher</td><td>X0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

髄芽腫のフェロトーシス表現型の解明

Revealing the Ferroptotic Phenotype of Medulloblastoma

鉄と酸素の相互作用は、地球上の生命の発達に不可欠な部分です。それにもかかわらず、このユニークな化学は魅了され、困惑し続け、新しい生物学的ベンチャーにつながります。2012年、コロンビア大学のグループは、この相互作用が「フェロトーシス」と呼ばれる新しいタイプの制御細胞死につながる中心的なイベントであると認識しました。フェロトーシスの主な特徴は、(1)機能不全の抗酸化防御および/または(2)圧倒的な酸化ストレスによる脂質ヒドロペルオキシドの蓄積であり、これは最も頻繁に細胞内の遊離不安定鉄の含有量の増加と一致します。これは通常、シスチントランスポーターxCT、グルタチオン(GSH)、およびGSHペルオキシダーゼ4(GPx4)を含む標準的な抗フェロトーシス軸によって防止されます。フェロトーシスはプログラムされたタイプの細胞死ではないため、アポトーシスに特徴的なシグナル伝達経路は関与しません。このタイプの細胞死を証明する最も一般的な方法は、親油性抗酸化物質(ビタミンE、フェロスタチン-1など)を使用して細胞死を防ぐことです。これらの分子は、原形質膜の酸化的損傷に接近し、解毒することができます。フェロトーシスの表現型を明らかにする上でのもう一つの重要な側面は、特定の色素BODIPY C11が使用される脂質ヒドロペルオキシドの先行蓄積を検出することです。本稿では、エラスチン、RSL3、鉄供与体などのさまざまな誘導物質を使用して、野生型髄芽腫細胞でフェロトーシスを誘導する方法を示します。同様に、NACの存在下で増殖し、NACが除去されるとフェロトーシスを受けるxCT-KO細胞が使用されます。特徴的な「バブリング」表現型は、フェロトーシスが引き起こされた瞬間から12〜16時間以内に光学顕微鏡で見ることができます。さらに、PI染色法を使用して脂質ヒドロペルオキシドの蓄積とその結果としての細胞死を示すためのBODIPY C11染色とそれに続くFACS分析が使用されます。細胞死のフェロトーシス特性を証明するために、フェロスタチン-1 は特定のフェロトーシス予防剤として使用されます。

脂質ヒドロペルオキシド含有量は、フェロトーシス細胞死の最も一般的に使用される指標です。この記事では、フェロトーシス誘導時の細胞内の脂質ヒドロペルオキシド含有量のフローサイトメトリーの段階的な分析について説明します。

The interaction of iron and oxygen is an integral part of the development of life on Earth. Nonetheless, this unique chemistry continues to fascinate and ...

私たちの研究の最終的な目標は、筋芽腫などの小児がんに対する新しい治療法を開発することです。この目的のために、私たちのチームは、病気の遺伝的背景を強調する新しいモデルシステムを開発するとともに、新しい治療法の道を切り開いています。近年、シングルセルゲノミクスは、系統コミットメントの障害が小児がんの臨床転帰、治療への反応、そして最終的には腫瘍内の治療抵抗性細胞集団の発達にどのように影響するかを明らかにしました。神経前駆細胞の分化状態のスペクトルは、小児がんの臨床転帰の根底にあるようです。主な課題は、腫瘍内のこれらの高度に可塑性に知られている前駆細胞または不十分である前駆細胞を理解すること、およびこれらの疾患に対してより効率的で害が少ない新しい治療法を開発することです。この観点から、フェロトーシスに関する私たちの研究は非常に有望であるように思われます。鉄依存症は、がん幹細胞としても知られるがん細胞の主な脆弱性の1つであり、すべての必須要素です。鉄は諸刃の剣であり、活性酸素種との反応により、フェロトーシスと呼ばれる特定の種類の細胞死を引き起こす可能性があります。私たちのデータは、フェロトーシスがこのタイプの癌細胞に対して大きな可能性を秘めていることを明確に示しています。

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