Name: 血小板中のスーパーオキシドアニオン生成を検出するための代替法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学ぶ血小板におけるスーパーオキシドアニオン生成の検出法。DHEを用いた蛍光顕微鏡法とCMHスピンプローブを用いたEPR法を紹介し、従来のフローサイトメトリー法の限界を克服して正確な定量が可能です。

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<meta charset="utf8"></head><body>蛍光イメージングとESRを用いた血小板中のスーパーオキシドアニオンの検出

<table><tbody><tr><td>1-ヒドロキシ-3-メトキシカルボニル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン (CMH)</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-02.1-50mg</td><td>EPR用試薬 (スピンプローブ)</td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>NA</td><td>フローサイトメーター</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>メルク/シグマ</td><td>A7030</td><td>&mu;-スライドコーティング用</td></tr><tr><td>Bruker E-scan M (Noxyscan)</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>&nbsp;NOX-E.11-BES&nbsp;</td><td>ESR分光器</td></tr><tr><td>カタラーゼ&ndash;ポリエチレングリコール(PEG-Cat.)</td><td>メルク/シグマ</td><td>C4963</td><td>過酸化水素スカベンジャー (特異性制御)</td></tr><tr><td>ChronoLog Model 490+4</td><td>Labmedics/Chronolog</td><td>NA</td><td>Aggregometer</td></tr><tr><td>CM ラジカル</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-20.1-100mg&nbsp;</td><td>ESR用試薬(キャリブレーションコントロール)</td></tr><tr><td>デフェロキサミン&nbsp;</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-09.1-100mg&nbsp;</td><td>EPR用試薬</td></tr><tr><td>ジエチルジチオカルバメート(DETC)&nbsp;</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-10.1-1g&nbsp;</td><td>EPR用試薬</td></tr><tr><td>ジヒドロエチジウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D11347</td><td>スーパーオキシドアニオンプローブ</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>メルク/シグマ</td><td>34869</td><td>原液調製用&nbsp;</td></tr><tr><td>EPRシーリングワックスプレート</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-A.3-VPM</td><td>EPR</td></tr><tr><td>グレードの水</td>用消耗品 <td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-07.7.1-0.5L&nbsp;</td><td>EPR用試薬</td></tr><tr><td>ヒト血漿由来フィブリノーゲン</td><td>メルク/シグマ</td><td>F4883</td><td>&mu;-スライドコーティング</td></tr><tr><td>FITC抗ヒトCD41</td>抗体 <td>BioLegend</td><td>303704</td><td>フローサイトメトリー用血小板特異的染色</td></tr><tr><td>ガラスキュベット&nbsp;</td><td>Labmedics/Chronolog P</td><td>/N 312</td><td>凝集計でのインキュベーション用消耗品</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Labmedics/Chronolog</td><td>P/N 385</td><td>血小板刺激用</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>国立衛生研究所 (NIH)</td><td>NA</td><td>ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)</td></tr><tr><td>インドメタシン</td><td>メルク/シグマ</td><td>I7378</td><td>血小板分離用</td></tr><tr><td>マイクロピペット DURAN 50&micro;l</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-G.6.1-50&micro;L</td><td>EPR用消耗品</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン塩酸塩</td><td>メルク/シグマ</td><td>P2658</td> &<td>mu;-スライドコーティング用</td></tr><tr><td>プロスタグランジンE1(PGE1)メル</td><td>ク/シグマ</td><td>P5515</td><td>血小板分離用</td></tr>ク<tr><td>エン酸ナトリウム(4%w/v溶液)</td><td>メルク/シグマ</td><td>S5770</td><td>血小板分離用</td></tr><tr><td>攪拌棒(テフロンコーティング)</td><td>Labmedics/Chronolog</td><td>P/N 313</td><td>凝集計スーパーオキシド</td></tr><tr><td>ジスムターゼ&ndashでのインキュベーション用の消耗品。ポリエチレングリコール (PEG-SOD)</td><td>メルク/シグマ</td><td>S9549</td><td>スーパーオキシドアニオンスカベンジャー(特異性制御)</td></tr><tr><td>ヒト血漿からのトロンビン</td><td>メルク/シグマ</td><td>T6884</td><td>血小板刺激および&mu;-スライドコーティング用</td></tr><tr><td>VAS2870</td><td>エンツォライフサイエンス</td><td>BML-EI395</td><td>NOX阻害剤</td></tr><tr><td>ツァイス510 LSM共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>NA</td><td>共焦点顕微鏡</td></tr></tbody></table>

血小板中のスーパーオキシドアニオン生成を検出するための代替法 

Alternative Methods for the Detection of Superoxide Anion Generation in Platelets

DHE蛍光のフローサイトメトリー検出では、休止状態(図3A)または0.1ユニット/mLトロンビンで刺激した血小板(図3B)の代表的な結果を示します。O2•- 出力は、0.1 unit/mLトロンビン(図3C)または3 μg/mLコラーゲン関連ペプチド(CRP)(図3D)による刺激で示されているように、血小板平均蛍光強度(MFI)として定量化されました。血小板刺激の結果として、DHE染色の2倍/3倍の増加が観察されました。O2•- が測定されることを確認するために、細胞透過性のO2•- スカベンジャーペグ化スーパーオキシドジスムターゼ(PEG-SOD、100単位/ mL)の使用を提案し、O2•- の発生源を特定するためにNOX阻害剤VAS2870(10μM)を使用しました。コラーゲンとトロンビンの両方について、PEG-SODとVAS2870は血小板の活性化によって引き起こされるDHE蛍光の増加を消失させ、測定がO2•- に特異的であり、これらの条件下でのそれらの供給源がNOX酵素であることが確認されました。
DHE蛍光のイメージング検出については、コラーゲンまたはフィブリノーゲンへの接着の瞬間(および次の10分)でのO2•- の生成を評価する実験からのデータ(図4A)またはトロンビンによる刺激によりPLLに接着した血小板からのO2•- の生成を評価することを目的とした実験(図4B)のデータを示します。予想通り、PLLへの接着はO2•-の堅牢な生成を引き起こさない。おそらく、この形態の接着は、シグナル伝達応答45の開始を伴わない静電相互作用に依存しており、このアプローチが可溶性アゴニストの添加に対するO2•− 出力を測定するのに適しているからである。このプロトコルがO2•-の検出を可能にすることを確認するために、スカベンジャーまたは選択的阻害剤のいずれかを利用することができます。我々は、これらの実験において、N-アセチル-システイン(NAC)がO2•- を除去し、血小板蛍光を消失させることができることを以前の研究で示してきた46。ここでは、選択的NOx阻害剤が、コラーゲンまたはフィブリノーゲンに付着する血小板(図4A)またはトロンビンに応答する血小板(図4B)の蛍光を効果的かつ即座に軽減するVAS2870を示します。これは、これらの実験条件でNOXがO2•- の発生源であることを示唆しています。PLLに付着した血小板のコラーゲンやフィブリノーゲンへの接着、トロンビンによる刺激に応答したDHE蛍光(405 nm励起)の代表的な動画を、 それぞれ補足ファイル1、 補足ファイル2、 補足ファイル3として収録しています。注目すべきは、PEG-SODは、O2•- スカベンジャーとして他の実験設定で成功裏に使用されてきましたが、このタイプの実験では効果的ではありません。現時点では、これについて明確な説明はありません。PEG-SODは、イメージングベースのアッセイでO2•- が蛍光の増加を誘導する細胞コンパートメントに到達すると仮定できますが、効率が悪いか、速度が遅いかのどちらかです。この点を明確にするためには、さらに焦点を絞った調査が必要となるかもしれません。
私たちは、以前に発表されたさまざまな研究1,13,47,48,49,50で血小板中のESRによるO 2•-の測定を適用しました。この手法の重要なステップは、市販のCM●(すなわち、スピンプローブCMHとO2•-との間の反応とESRによって測定された共鳴種との間の反応の積)を使用した検量線の作成です。CMHとO2•-の反応を図5Aに、異なる濃度のCM●によって誘発されるESRシグナルの代表的な例を図5Bに示します。さまざまなCM●濃度のデータを使用して、酸化されたCMHの量とサンプル中のESRシグナル強度との間の線形相関を示す検量線を作成しました(図5C)。以下の式は、CM●濃度とESR信号強度の相関関係を表しており、この研究の実験の検量線の計算の出発点です(式1)。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq01v2.jpg" style="margin: auto;">
CM● 濃度とそれに対応するESR強度の両方を実験的に取得したため、検量線の 傾き と Y軸切片 を計算できます。 図 5C に示す例では、 傾き = 1,002,169、 切片 = 596,383 です。したがって、検量線の式は次のように書き直すことができます。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq02.jpg" style="margin: auto;">
上記の式を並べ替えると、ESR強度値に基づいて、さまざまなサンプルのCM● 濃度を計算できます(式2)。
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq03v2.jpg" style="margin: auto;">
サンプル中のCM● の濃度がわかったら、以下の式(式3)で血小板あたりの生成速度と単位時間を計算することができます。
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq04v2.jpg" style="margin: auto;">
式 2 を使用すると、式 3 は次のように書き直すことができます (式 4)。
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq05v2.jpg" style="margin: auto;">
図 5C に示す例では、次のように書き換えることができます。
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq06v2.jpg" style="margin: auto;">
CMH酸化速度は、血小板毎分生成されるCM●のアトモルとして表されます。この値は、実験とドナー間のO2•-生成速度を比較するために使用できますが、これはDHE(またはDCFDA)のような蛍光プローブでは不可能です。蛍光プローブは一般に、同じ実験内での蛍光強度の変化として、O2•-生成に対する異なる条件の影響の推定のみを許可します。この記事で説明したすべての手法について、検出の特異性は、ROSスカベンジャー(PEG-SOD、NACなど)またはスーパーオキシドアニオンを生成する酵素の選択的阻害剤(NOXを阻害するVAS2870など)で確認されました。ここでは、トロンビン(図6A、C、E)またはコラーゲン(図6B、D、F)による血小板刺激(図6)のデータを示します。両アゴニストについて、PEG-SODを用いてO2•-が検出されることを確認しましたが、PEG-カタラーゼ(PEG-Cat.)に対する効果の欠如は、この手法では過酸化水素が検出されないことを示唆しています(それぞれ図6C、D)。VAS2870は、トロンビン-(図6E)およびコラーゲン誘導性(図6F)のESRシグナルを廃止し、NOXがこれらのアゴニストの両方に対して血小板O2•-の主な供給源であることを示唆しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig01.jpg"> 図1:血小板懸濁液のフローサイトメトリー解析 (A)単離された血小板のフォワード(FSC)プロットとサイドスキャタリング(SSC)プロットの典型的な表示。(B)抗CD41抗体による血小板懸濁液の免疫染色により、調製物中の粒子の&gt;98%が血小板であることが確認される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig02.jpg"> 図2:DHEとスーパーオキシドアニオンなどのROSとの化学反応、および生成物のスペクトル特性。 DHEとその2つの酸化生成物であるスーパーオキシドアニオンとの反応によって生成される2-ヒドロキシエチジウム(2OH-Et+)と、他の種類のROS(ヒドロキシラジカルや過酸化水素など)との反応によって生成されるエチジウム(Et+)の構造とスペクトル特性。図で青い破線の長方形で強調表示されている405nmの励起ピークは、2OH-Et+に特異的であるため、O2•-の検出/測定に使用できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig03.jpg"> 図3:DHEおよびフローサイトメトリーによって検出されたトロンビンおよびコラーゲン依存性スーパーオキシドアニオン生成。 (A)安静時血小板および(B)トロンビン刺激血小板のDHE染色の代表的なヒストグラム。このバーは、500未満のDHE染色値を示しており、安静時血小板とトロンビン刺激血小板でそれぞれ70.7%と16.1%です。この手法を利用して、(C)0.1 unit/mL トロンビンおよび (D)3 μg/mL コラーゲン刺激血小板におけるスーパーオキシドアニオン生成を推定しました。この実験では、PEG-SOD(100 unit/mL)を使用してスーパーオキシドアニオンの測定を確認し、10 μM VAS2870を使用してスーパーオキシドアニオンの供給源としてNOX酵素を特定しました。各データポイントは、50,000血小板からの平均蛍光強度(MFI)として計算され、各実験は5回独立して繰り返され(n = 5)、平均±SEMがグラフに示されました。統計的有意性は、ペアワイズ比較のためのテューキー事後検定による一元配置ANOVAによって評価されました(** = p &lt; 0.01、*** = p &lt; 0.001)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig04.jpg"> 図4:DHE蛍光イメージングにより検出されたコラーゲン、フィブリノーゲン、およびトロンビン依存性スーパーオキシドアニオン生成 (A)コラーゲンまたはフィブリノーゲンのいずれかに付着する血小板について、スーパーオキシドアニオン生成速度を評価した。血小板は、イメージング開始から1分後にコーティングされたμスライド上に分注し、画像収集開始から5分後に10μMのVAS2870を追加しました。(B)トロンビンによる刺激による血小板のスーパーオキシドアニオン生成速度。血小板は、画像収集の開始前に10分間、PLLコーティングされたμスライドに接着させました。2分後、0.1ユニット/mLのトロンビンを添加し、さらに5分後に10μMのVAS2870を添加しました(すなわち、イメージング開始から7分後)。実験スキームはパネルの上部に表示され、0分、1分、3分、6分、および9分の代表的な画像がパネルの中央に表示されます。パネルの下部に単血小板DHE蛍光定量が示されており、ImageJを使用した蛍光強度分析によって取得されました。データは、4つの独立した実験で条件ごとに8〜12血小板からのSEM±平均です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig05.jpg"> 図5:検量線とCMH酸化速度の計算 (A)CMHとCM●の化学構造とESR特性。(B)CM●の濃度(100 nM〜10 μM)の異なるESRデータの代表例。(C)EPR強度とCM●濃度の検量線。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig06.jpg"> 図6:トロンビンまたはコラーゲン刺激による血小板によるスーパーオキシドアニオン産生の検出。スーパーオキシドアニオン出力は、(A)0.1 unit/mL トロンビンまたは (B)3 μg/mL コラーゲンのいずれかで刺激された血小板中のスピンプローブ CMH を用いて ESR によって測定しました。(C、D)100 単位/mL のスーパーオキシドアニオンスカベンジャー PEG-SOD または 100 単位/mL の過酸化水素スカベンジャー PEG 化カタラーゼ (PEG-Cat.) の濃度を、両方のアゴニストについて試験した条件に含めました。スーパーオキシドアニオンの発生源は、NOX阻害剤VAS2870(10μM)との共インキュベーションによって調査されました。(E)トロンビンと(F)コラーゲンはどちらも、スーパーオキシドアニオンの生成をNOx活性に依存しています。図全体を通して、CMH/スーパーオキシドアニオン反応速度は、原稿に記載されているように、ESRトレースから計算されました(式4)。データは、5 (C,D) および 4 つの独立した実験 (E,F) からの SEM ±平均です。統計的有意性は、ペアワイズ比較のためのテューキー事後検定による一元配置ANOVAによって評価されました(** = p &lt; 0.01、*** = p &lt; 0.001)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1: コラーゲンへの接着に応答したDHE蛍光(405 nm励起)の代表的な動画です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/Suppl%20file%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2: 接着フィブリノーゲンに応答したDHE蛍光(405 nm励起)の代表的な動画です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/Suppl%20file%202.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3: PLLに付着した血小板をトロンビンで刺激するDHE蛍光(405 nm励起)の代表的な動画です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/Suppl%20file%203.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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