Name: マウス膵臓内皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 学ぶマウス膵臓内皮細胞の単離法。マグネティックセルソーティングと遠心分離により高生存率で内皮細胞を濃縮し、転写因子解析とウエスタンブロッティングで検証します。膵血管の病態理解に有用です。

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<meta charset="utf8"></head><body>疾患研究のためのマウス膵臓内皮細胞抽出の合理化

<table><tbody><tr><td>1.5 mL eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ディッシュ</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>25G ニードル</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL eppendorf</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14282300</tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro;mのこし器</td><td>フィ</td><td>ッシャー22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-biotin</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>牛の血清アルブミン熱衝撃処置</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1、子牛の皮から</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C9791</td><td>プロトコルのコ</td></tr><tr><td>ラゲナーゼ1型における付着試薬&nbsp;</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Countess 自動セルカウンター</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>D1306</td><td>免疫蛍光</td></tr>性<tr><td>使い捨て安全メスMyco</td><td>インスツルメンテーション</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>260913&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(Ca2+,Mg2+)</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td></td><td></td>14080055</tr><tr><td>エタノール</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>フィッシャー</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター37</td><td></td><td></td><td>°Cに保たれました。C 5% CO2</sub</td></tr><tr><td>>LS カラム</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator&nbsp;</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>ミディアム199</td><td>シグマアルドリッチ&nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>マイクロビーズ 抗ビオチン</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>細胞形態を評価するため</td></tr><tr><td>分子グレード 水</td><td>コーニング</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャー</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>ニューブランズウィック イノーバ 44/44R オービタルシェーカー&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>immunofluorescence</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) 抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (10X) (Ca2+なし、Mg2+なし)</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>プライマー 36B4 フォワード マウス</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>プライマー 36B4 レベス マウス&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTTC</td></tr><tr><td>プライマー KDR フォワードマウス&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>プライマー KDR リバースマウス</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>プライマー Nkx6.1 リバースマウス&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>プライマー Nxk6.1 フォワードマウス</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>プライマー PECAM1 フォワードマウス</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTCTATGCAAG</td></tr><tr><td>プライマー PECAM1 リバースマウス</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATTCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリー水</td><td>タカラ</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 12" 長鉗子</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細鉗子</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細ハサミ</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿 2cm</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>トリゾール試薬</td><td>フィッシャー</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>コーニング</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-カドヘリン抗体Abcam</td><td></td><td>ab33168</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス膵臓内皮細胞の単離

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

このプロトコルに従うと、3つのマウス膵臓、および1つのマウス膵臓から750,000個の細胞をプールすると、約2×106 個の生細胞を得ることができます。ECの濃縮を検証するために、我々は以下の分析を行った:1)定量的PCR:フロースルー(FT)サンプル(すなわち、非CD31抗体結合画分)と比較して、EC画分は 、Pecam1 (CD31をコードする)および Kdr (VEGFR2をコードする)のレベルが有意に高かった、2つのECマーカー遺伝子33、および膵臓内分泌細胞の転写因子であるNK6ホメオボックス1(Nkx6.1)のレベルが低かった(図4A));2)ウェスタンブロッティング:3種類の調製物(pEC-1-3)から得られたEC濃縮サンプルは、予想サイズ(~130 kDa)でCD31の強いシグナルを示しました。これに対し、インプットサンプルとFTサンプルは最小限のCD31シグナルを示しました。ポジティブコントロールとして、MS1細胞(pEC細胞株)のライセートも強いCD31シグナルを示しました(図4B)。3)トリパンブルー染色:単離された細胞の生存率は約50%であることがわかりました(図4C)。4) 公開されたプロトコル15 に従ったフローサイトメトリー:生細胞集団のゲーティング(図4D)により、CD31+細胞は88%、TdTomato+細胞は76%であることがわかりました。注目すべきは、単離された細胞の大部分がCD31とTdTomatoを共発現することです(図4E)。ネガティブコントロールとして、未染色のMS1細胞およびIgGとインキュベートしたMS1は、CD31でマークされた生細胞を示さなかった。ポジティブコントロール、すなわちCD31について染色されたMS1細胞は、ほぼ100%の生CD31+細胞を示しました(図4F)。また、単離された細胞を培養し、公開されたプロトコル36に従ってPECAM1の免疫蛍光染色を行い、TdTomatoを画像化したところ、単離された細胞内の両方のマーカーの強力なシグナルが示され、ECの存在が示唆されました(図4G)。
<img alt="血管構造研究と細胞相互作用分析のための膵島内ECを示す膵臓図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
図1:膵臓と膵島の血管新生の図。 膵臓内皮細胞(EC)と膵島内ECの絵の描写。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="単一細胞膵臓の調製図;遠心分離、CD31-ビオチン標識、フロースルー分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
図 2: ワークフローの概要。 1)膵臓の解剖、2)機械的消化、3)酵素インキュベーション、4)遠心分離、5a)上清除去、5b)細胞ペレットの二次コラゲナーゼ消化、6)、7)、8)ペレットの再構成と抗体結合、9)マイクロビーズインキュベーション、10)MACSカラム濃縮、11)生存率のための細胞カウント、および12)ダウンストリーム分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="生物学研究における膵臓の採取、単離、およびトリミングプロセスを示す組織解剖。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
図3:組織処理ステップ。 (A)腹腔、(B)孤立したマウスの膵臓、および(C)トリミングされたマウスの膵臓の画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="遺伝子発現、CD31解析、DAPI、細胞選別、蛍光、フローサイトメトリーの結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
図4:マウス膵臓から単離されたEC画分の検証(A)FTサンプルとCD31による濃縮EC画分のqPCR。Pecam1(CD31)、Kdr(VEGFR2)、およびNkx6.1(膵臓β細胞特異的転写因子)33。*は、t検定に基づくFTと比較したp &lt;0.05を示します。n = 3-4個のプールされたサンプル、それぞれ3匹のマウスからなる。(B)CD31のウェスタンブロッティング。pEC-1-3は、3つの別々のプールされたマウスサンプルから濃縮されたECを示します。30 mgの細胞ライセートを各レーンにロードし、続いてPonceau S染色を行いました。(C)生存率アッセイのための濃縮pECの細胞計数およびトリパンブルー染色。(D)4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)およびCD31抗体で染色したマウスpECのフローサイトメトリーゲーティング戦略。(E)未染色のMS1(左上)、AlexaFluor-488二次抗体で染色したMS1(IgGコントロール、右上)、CD31で染色したMS1(左下)、CD31で染色した単離マウスpECのフローサイトメトリーヒストグラム(右下)。(F)フローサイトメトリーを使用して定量した生細胞の割合。(G)DAPI(青)対比染色および内因性TdTomato蛍光レポーター(赤)によるCD31発現(緑)の免疫蛍光染色。スケールバー = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="免疫蛍光顕微鏡によるCD31/CD144/DAPI,Cdh5,Pecam1のUMAP遺伝子発現解析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
図5:マウス膵臓におけるCD31およびCD144特異性 (A)CD31(マゼンタ)およびCD144(シアン)を用いたマウス膵臓のDAPI対比染色による免疫蛍光。広視野蛍光倒立顕微鏡で10倍レンズを使用して撮影した画像。スケールバー = 100 μm。破線は小島の面積を区切っています。(B)scRNA-seq(GSE128565)37により検出されたC57BL6マウスの膵島ECにおけるCdh5およびPecam1の発現を示すUniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>酵素</td>
			<td>使う</td>
			<td>温度と時間</td>
			<td>参考</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コラゲナーゼI</td>
			<td>単一細胞解離、全膵膜EC濃縮</td>
			<td>37°C、20分</td>
			<td>このプロトコル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コラゲナーゼIV</td>
			<td>膵島分離および非酵素的解離</td>
			<td>37°C、20分</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コラゲナーゼ+トリプシン</td>
			<td>マウス膵臓の管細胞の検査</td>
			<td>37°C、30分</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コラゲナーゼB</td>
			<td>膵臓の単細胞懸濁液</td>
			<td>37°C、30分</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コラゲナーゼNBI</td>
			<td>膵島の分離</td>
			<td>37°C、30分</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コラゲナーゼP</td>
			<td>Acinar 実行可能なサスペンション</td>
			<td>37°C、15分</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コラゲナーゼXI</td>
			<td>膵島の分離</td>
			<td>37°C、15分</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ディスパーズ</td>
			<td>シングルセル懸濁液</td>
			<td>37°C、45分</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>リベラーゼ</td>
			<td>シングルセル懸濁液</td>
			<td>37°C、10分</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>トリプシン</td>
			<td>単一細胞解離、全膵臓</td>
			<td>4 °C、O/N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:マウス膵臓サンプルの処理に使用されるさまざまなプロトコルの概要。

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

isolation-of-mouse-pancreatic-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

膵島は、ランゲルハンス島とも呼ばれ、グルコース調節やその他の重要な生物学的機能のためのホルモンを産生する内分泌細胞のクラスターです。このプロトコルでは、最初にAmpulla of...

コラゲナーゼ灌流による膵島単離:膵島細胞を単離するための酵素的方法

本書では、マウスの膵臓からプライマリー膵臓腺房細胞を単離し、培養するための迅速かつ便利な手順を説明します。この方法では、新鮮な主要形質転換/ノーマル膵外分泌細胞の生理機能を研究するための貴重なアプローチを構成している。...

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

ここでは、2型糖尿病のマウスモデルから膵島を分離するためのプロトコル、Leprdb、および2光子顕微鏡を利用した無傷の膵島からのインスリン分泌を測定するための生細胞アッセイの詳細を紹介します。...

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

このプロトコルは、イメージングや分子生物学的実験を行う目的でマウスの冠状細胞を分離する方法を共有するために準備されています。...

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マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

ここで潜在的な糖尿病誘発異物化学物質を識別するために、化学物質によって ROS の帰納法をスクリーニングするためのマウスの膵島細胞を分離するためのプロトコルを提案する.

マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

ここでは、膵島細胞などの異種細胞集団におけるカルシウム動態をイメージングおよび定量するためのプロトコルを提示する。蛍光レポーターは、イヌビレット内の細胞の末梢層に送達され、次いで固定化および画像化され、蛍光強度のダイナミクスの細胞単位分析が行われます。...

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

この記事では、新生児マウスから初代肺内皮細胞を単離し、培養しました。...

初代マウス肺内皮細胞の単離

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。...

マウスから一次膵島および一次膵臓細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法

学ぶマウス膵臓内皮細胞の単離法。マグネティックセルソーティングと遠心分離により高生存率で内皮細胞を濃縮し、転写因子解析とウエスタンブロッティングで検証します。膵血管の病態理解に有用です。

マウス膵臓内皮細胞の単離

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