Name: 低酸素感受性キメラ抗原受容体T細胞の作製と機能検証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶ低酸素感受性CAR-T細胞の作製と機能検証について。レンチウイルスベースの手法で低酸素環境下での選択的細胞傷害性を確認し、がん免疫療法の安全性と有効性向上に貢献する革新的プロトコルを解説します。

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本研究では、HER2(Gene ID:2064)を標的とする低酸素感受性CARであるHER2-BBz-ODDと、通常のHER2-BBzと比較しました。2つのCARの概略図を 図1Aに示し、HER2-BBz-ODDは、CD3ξのC末端にODD配列を追加することでHER2-BBzから得られることを示しています。2つのCARを発現するレンチウイルスベクターの構築と、293T細胞トランスフェクションによる対応するレンチウイルスの生成は、以前に説明されている31。
1. レンチウイルス感染による低酸素感受性CAR-T細胞の作製
<ol><li>凍結保存されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)を37°Cで水浴中で急速に解凍します。解凍したPBMCを、400 IUのIL-2、5 ng/mL IL-7、および10 ng/mL IL-15を添加した9 mLの無血清リンパ球培養培地(ヒトT細胞増殖培地、 以下 TGM と呼ぶ)を含む15 mLチューブに移します。</li>
	<li>細胞計数用の分注を取った後、チューブを300 × g で5分間遠心分離します。ペレット化したPBMCをTGMで4×106 細胞/mLの密度で再懸濁し、懸濁液を6ウェルプレートに移します。</li>
	<li>抗hCD3/hCD28コーティング免疫ビーズを調製します。<ol><li>100 μLのマウスIgG磁気ビーズを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、PBS付き磁気スタンドを使用して2回洗浄します。</li>
		<li>ビーズを100 μLのPBSに再懸濁し、0.2 μgのマウス抗ヒトCD3抗体と2 μgのマウス抗ヒトCD28抗体を加えます。ピペットを使用して混合物を穏やかに混合し、4°Cで一晩揺らします。</li>
		<li>PBS入りマグネットスタンドでビーズを2回洗浄し、PBS100μLに再懸濁します。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ1.2で、抗hCD3/hCD28でコーティングされた免疫ビーズをビーズ対細胞比1:1でプレートに添加します。プレートを5%CO2 の加湿インキュベーターに37°Cで置きます。</li>
	<li>インキュベーションの48時間後、ピペットで細胞を穏やかに混合した後、細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。チューブを磁気スタンドに3分間置き、上清を新しい15 mLチューブに慎重に移して、PBMCから免疫ビーズを除去します。</li>
	<li>細胞計数用のアリコートを取り、300 μLのTGM中の5×105 細胞/ウェルのPBMCを48ウェルフラットプレートに播種します。200 μLのレンチウイルスストックを対応するウェルに添加し、硫酸プロタミンを最終濃度10 μg/mLまで添加します。</li>
	<li>プレートを1,000 × g、32°Cで1.5時間遠心分離し、ピペットを使用して各ウェルから300 μLの上清を慎重に除去して廃棄します。次に、ピペットを使用して1 mLの新鮮なTGMを加え、プレートを5%CO2 で37°Cの加湿インキュベーターに入れます。</li>
	<li>新鮮なTGMを添加して、細胞密度を0.5-2×2〜3日ごとに106 細胞/ mLに調整します。まず、細胞を12ウェルプレートに移し、次に6ウェルプレートに移します。総数が4mLの容量で6×106 に達するまで細胞を培養し続けます。 注:並行して、上記と同じ手順に従ってJurkat T細胞のCAR形質導入を実施するが、TGMが10%ウシ胎児血清(FBS)を含む培地RPMI1640置換される点を除いて。</li>
</ol>2. フローサイトメトリーを用いたCAR-T細胞における酸素依存性CAR発現の評価
<ol><li>ステップ1.8のCAR形質導入T細胞を、2.5 × 106細胞/ウェルの密度で2つの12ウェルプレートに2つのTGM中にプレート化します。1つのプレートを5%のCO2を37°Cで加湿したインキュベーターに直接入れ(細胞培養の標準条件は21%のO2であるため、正常酸素状態)、もう1つのプレートをO2レベルが1%にプリセットされた移動式CO2/O2/N2インキュベーターチャンバー(低酸素状態)に置き、チャンバーを加湿状態に保ちます。 5% CO2/94% N2 インキュベーター、37 °C。</li>
	<li>24時間ごとに、低酸素または正常酸素条件下でプレートから5個×10個の5 細胞を1.5mLの微量遠心チューブに収集します。チューブを500 × g で5分間遠心分離し、上清を取り除き、ピペッティングにより細胞を1 mLのPBSに穏やかに再懸濁します。PBSウォッシュをもう一度繰り返します。</li>
	<li>ペレット化した細胞を、各チューブ内の50 μLのFACSバッファー(PBSに2% FBSを添加)に再懸濁します。1:100希釈のPE標識抗Flag抗体(0.2 μg/mL)を50 μL加え、ピペッティングで十分に混合します。暗所で室温で20分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーションの終了時に、各チューブに1 mLのFACSバッファーを加えます。ピペッティングで十分に混合し、500 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>ピペットを使用して上清を慎重に取り除いて廃棄し、手順2.4をもう一度繰り返します。</li>
	<li>ピペットを使用して上清を慎重に取り除き、廃棄します。細胞を200μLのFACSバッファーに再懸濁し、得られた細胞懸濁液を5mLのフローチューブに移します。</li>
	<li>ステップ2.6で細胞懸濁液のフローサイトメトリーを行い、表面のCAR発現を決定します。トランスフェクションされていないT細胞をネガティブコントロールとして含めます。<ol><li>FSC/SSCおよびFSC-A/FSC-Hゲートを使用して、生細胞をスクリーニングします。サンプルごとに 1 つ× 10つの 4 つのライブ シングル イベントを収集します。EGFP(形質導入に成功したT細胞の指標としてレンチウイルスベクターに運ばれる構成マーカー)に陽性の細胞をゲートし、次にフィコエリトリン(PE)に陽性の細胞(CAR発現細胞)をゲートして、PE陽性と蛍光強度中央値(MFI)を測定します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. CAR修飾Jurkat T細胞におけるCAR発現の酸素依存性をウェスタンブロットで解析
<ol><li>セクション1のCAR形質導入Jurkat T細胞を、ウェルあたり5×10個の5</li><li></li><li></li><li></li><li><li><li><li><li><li><li></ol><ol><li></li><li><li> </li><li><li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;"></li></ol><ol><li> </li><li><li><li><li> </li><li><li><li><li><li></li></ol>

<meta charset="utf8"></head><body>選択的腫瘍に対する低酸素感受性CAR-T細胞の機能検証

<ol><li>Boardman, A. P., Salles, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+in+large+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma.</a> Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).</li>
<li>Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T%3A+What+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CAR-T: What is next.</a> Cancers. 15 (3), 663(2023).</li>
<li>Barsan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+utilisation+and+outcomes+across+refractory%2C+first+relapse+and+multiply+relapsed+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+A+retrospective+analysis+of+real-world+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22eClinicalMedicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns.</a> eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+delivery+of+dual+CAR+targets+of+CD19+and+BCMA+as+well+as+immunomodulators+to+enhance+therapeutic+efficacy+in+solid+tumors+combined+with+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy.</a> Front Oncol. 12, 1037934(2022).</li>
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<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+anti-solid+tumor+efficacy+of+CAR-T+cells+by+inhibiting+adenosine+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).</li>
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<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+tumor+immune+microenvironment+and+its+optimization+from+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy.</a> Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 遠心分離管</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>上清および細胞 cellection プロトコル ステップ 2,3,4</td></tr><tr><td>10% ExpressCast PAGE</td><td>NCM バイオテクノロジー</td><td>P2012</td><td>免疫ブロッティング プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>NCM バイオテクノロジー</td><td>20220812</td><td>細胞培養 プロトコル ステップ 4</td></tr><tr><td>10 mL ピペット</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>ピペッティング プロトコル ステップ 1</td></tr><tr><td>10xTRIS-Glycine-SDS 電気泳動バッファー</td><td>エピザイム</td><td>3673020</td><td>イムノブロッティング プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>上清および細胞 cellection プロトコル ステップ 1</td></tr><tr><td>25 cm2 EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>細胞培養 プロトコル ステップ 3,4</td></tr><tr><td>4x 蛋白質 SDS PAGE ローディングバッファー</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>6 ウェル平底組織培養プレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>T 細胞 culture プロトコル ステップ 1</td></tr><tr><td>96 ウェル黒色平底組織培養プレート</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>細胞毒性アッセイ プロトコル ステップ 4</td></tr><tr><td>96 ウェル ELISA プレート</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>ELISA プロトコル ステップ 5</td></tr><tr><td>96 ウェル プレート シェーカー</td><td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>Shake プロトコル ステップ 4</td></tr><tr><td>96 ウェル U 底組織培養プレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>268200</td><td>上清 cellection プロトコル ステップ 4,5</td></tr><tr><td>抗 FLAG 抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>カルビノール</td><td>Sinopharm</td><td>10010061</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>二酸化炭素インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>細胞培養 プロトコル ステップ 1,2,3,4</td></tr><tr><td>細胞計数プレート</td><td>Hausser scientific</td><td>1492</td><td>細胞計数 プロトコル ステップ 1,3,4</td></tr><tr><td>CELLection Pan マウス IgG キット</td><td>Thermo Scientific</td><td>11531D</td><td>マウス IgG 磁気ビーズ プロトコルステップ1</td></tr>遠心<tr><td>分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>細胞培養 プロトコルステップ1,3,4</td></tr>化学<tr><td>発光ゲルイメージングシステム</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>Immunoblotting プロトコルステップ3</td></tr><tr><td>塩化コバルト溶液(0.5 M)</td><td>バイオリーパー</td><td></td><td>BR4000203低酸素状態 プロトコルステップ2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103-CV</td><td>細胞培養 プロトコルステップ4</td></tr><tr><td>電子バランス</td><td>ザルトリウス</td><td>PRACTUM612-1CN</td><td>重量 プロトコルステップ</td></tr><tr><td>5FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>細胞培養 プロトコルステップ3,4</td></tr><tr><td>GAPDHマウスmAb</td><td>ABclonal</td><td>AC002</td>免疫<td>ブロッティングプロトコルステップ3</td></tr>ゲル<tr><td>電気泳動装置</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>GloMax Microplate Readers</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td>ルシフェラーゼ活性測定 プロトコル ステップ 4</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Yeasen</td><td>P1126151</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>高速マイクロフリーズ遠心分離機</td><td>eppendorf</td><td>5810&nbsp;R</td><td>細胞培養 プロトコルステップ1</td></tr>ヒト<tr><td>IFN-&γ;ELISAセット</td><td></td><td>BD 555142</td><td>ELISA プロトコルステップ5 項目:組換えヒトIFN-&γ;凍結乾燥標準液、検出抗体ビオチン抗ヒトIFN-&γ;、捕獲抗体精製抗ヒトIFN-&γ;、酵素試薬ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(SAv-HRP)</td></tr><tr><td>ヒトIL-2 ELISAセット</td><td>BD</td><td>555190</td><td>ELISA プロトコルステップ5 アイテム:組換えヒトIL-2凍結乾燥標準、検出抗体ビオチン抗ヒトIL-2、捕捉抗体精製抗ヒトIL-2、酵素試薬ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(SAv-HRP)</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>R&Dシステム</td><td>P40933</td><td>T細胞培養 プロトコルステップ1</td></tr><tr><td>IL-21</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CC45</td><td>T細胞培養 プロトコルステップ1</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R&Dシステム</td><td>P13232</td><td>T細胞培養 プロトコルステップ1</td></tr>倒<tr><td>立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX41</td><td>細胞培養 プロトコルステップ1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>CAR-Jurkat建設 プロトコルステップ3</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>LSRFortessa</td><td>フローサイトメトリー プロトコルステップ2</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>ルシフェラーゼレポーターassay プロトコルステップ4 アイテム: 受動溶解バッファー、ホタルルシフェラーゼ基質</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダーBioTek</td><td></td><td>HTX</td><td>ELISA プロトコルステップ5</td></tr><tr><td>モバイルCO2/O2/N2インキュベーターチャンバー</td><td>中国イノベーションインストゥルメント株式会社、 株式 会社。</td><td>Smartor118</td><td>低酸素状態 プロトコル ステップ 2、3、4</td></tr><tr><td>マウス抗ヘキサ ヒスチジン タグ</td><td>Σ</td><td>SAB2702218</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>NcmBlot 急速転写バッファー</td><td>NCM バイオテクノロジー</td><td>WB4600</td><td>免疫ブロッティング</td></tr><tr><td>NcmECL Ultra</td><td>NCM バイオテクノロジー</td><td>P10300</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3 項目: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer 試薬 (A) ,NcmECL Ultra Stabilized 過酸化物試薬 (B)&nbsp;</td></tr><tr><td>NovoNectinに塗ってある48の井戸の平らな版</td><td>Novoprotein</td><td>のGMP-CH38</td><td>CAR-T細胞の構造 プロトコル ステップ 1</td></tr><tr><td>OPD (o-フェニレンジアミン二塩酸塩)タブレット セット</td><td>Σ</td><td>P9187</td><td>基質の試薬 プロトコル ステップ 5 項目: OPDのタブレット(銀ホイル)、尿素の過酸化水素のタブレット(金ホイル)</td></tr><tr><td>PE共役抗DYKDDDDK</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>フローサイトメトリー プロトコル ステップ 2</td></tr><tr><td>プロタミン硫酸</td><td>シグマ</td><td>P3369-1OG</td><td>レンチウイルス感染 プロトコル ステップ 1</td></tr><tr><td>タンパク質マーカー 10 KDa-250 KDa</td><td>Epizyme</td><td>WJ102</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>&nbsp;精製されたNA/LEのマウスの反ヒトCD3</td><td>BD 566685</td><td></td><td>T細胞の培養 プロトコル ステップ 1</td></tr><tr><td>精製されたNA/LEマウスの反ヒトCD28</td><td>BD</td><td>BD 555725</td><td>T細胞の培養 プロトコル ステップ1</td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>Millipore</td><td>168627</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ3</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>細胞培養 プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>脱脂粉乳</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>SKOV3-Luc</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>細胞毒性アッセイ プロトコル ステップ 4</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>NCM バイオテクノロジー</td><td>C125C1</td><td>細胞培養 プロトコル ステップ 4</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Immunoblotting プロトコル ステップ 3</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>keelrein</td><td>NB014467</td><td>Heating プロトコル ステップ 1</td></tr><tr><td>X-VIVO 15&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>無血清リンパ球培養培地 プロトコル ステップ 1</td></tr></tbody></table>

低酸素感受性キメラ抗原受容体t細胞の作製と機能検証

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

HIF-1αのODDドメインをCAR部分に融合させることは、低酸素感受性CARを生成するための主要な戦略です。この研究で分析された低酸素感受性HER2標的CARは、HER2-BBz-ODDと名付けられ、ODD配列を従来のHER2-BBzに統合することにより、この戦略を使用して構築されました(図1A)。本研究では、レンチウイルス形質導入を用いてHER2-BBz-ODD CARまたはHER2-BBz CARを発現させ、その後、ヒトPBMCとJurkat T細胞の2種類の細胞で酸素感受性を調べました。
最初の試験は、低酸素条件下でのCARの発現と正常酸素条件下でのCARの発現であり、フローサイトメトリーによるCAR形質導入PBMC由来T細胞とウェスタンブロッティングによるCAR形質導入Jurkat T細胞の両方で行われました。CAR形質導入PBMC由来T細胞の設定では、HER2-BBz-ODD CARは、CAR陽性細胞の割合と蛍光強度(MFI)の中央値の両方において、1%O2 未満の方が21%O2 未満よりも有意に高い発現を示したことが観察されました(図1B)。CAR形質導入Jurkat T細胞の免疫ブロッティング分析では、HER2-BBz-ODDの低酸素依存性誘導も確認されました。
この文脈では、低酸素症の化学的誘導物質であるCoCl2を培地に添加することで、低酸素状態を便利に模倣できることは注目に値します。 図1Cに示すように、当社のイムノブロッティングの結果は、50または200μMのCoCl2 への曝露が1%O2への曝露の影響を再現し、HER2-BBz-ODD CARの発現を顕著に誘導したが、HER2-BBz CARの発現は顕著に誘導しなかったことを実証した。低酸素感受性CARの機能特性評価は、PBMC由来のCAR-T細胞を用いて行いました。この研究では、ホタルルシフェラーゼを保有するSKOV-3細胞株を標的細胞株として利用しました。この設定により、共培養されたCAR-T細胞によって媒介される細胞毒性を評価するためのプロキシとして、標的細胞関連ルシフェラーゼ活性を測定することができました。
図1Dに示すように、HER2-BBz CAR-T細胞は、大気が正常酸素性か低酸素性かに関係なく、標的細胞を効果的に殺すことが示されました。対照的に、HER2-BBz-ODD CAR-T細胞は、調査した3つのE:T比すべてについて、正常酸素条件下で有意に弱い細胞毒性を示しました。しかし、それらの細胞毒性は、低酸素状態にさらされると有意に増加しました。IL-2およびIFN-γの上清レベルも、CAR-T細胞を標的細胞と24時間共培養した後、ELISAによって測定されました。どちらのサイトカインでも、HER2-BBz-ODD CAR-T細胞では、21%O2と比較して1%O2未満の分泌が高いことが観察され、これは細胞毒性データと一致しています。対照的に、HER2-BBz CAR-T細胞は、21%O2と比較して1%O2未満の2つのサイトカインの分泌が低いことを示し、低酸素が細胞活性に悪影響を与えることを示しています(図1E)。まとめると、これらの結果は、HER2-BBz-ODD CARの低酸素感受性を説得力を持って検証しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66697/66697fig01.jpg"> 図1:低酸素感受性CAR-T細胞の構築と特性評価 (A)低酸素感受性CARであるHER2-BBz-ODDと、その従来型に対応するHER2-BBzの設計の概略図。両CARは、N末端CD8αシグナルペプチド、FLAGタグ、ヒトHER2標的scFv、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメイン、CD3ξシグナル伝達ドメイン、IRES、およびEGFPからなる細胞内部分から構成されています。HER2-BBz-ODDは、ODDドメインがCD3ξシグナル伝達ドメインのC末端に融合している点がHER2-BBzと異なり、正常酸素条件下でユビキチン依存性の分解を促進することにより、低酸素依存性発現を可能にします。(B,C)HER2-BBz-ODD CARの酸素依存性発現の評価。(B)1つの評価は、フローサイトメトリーを使用して1%または21%O2 未満で24時間、48時間、または72時間培養した後、ヒトPBMC由来CAR-T細胞で実施されました。(C)もう1つの評価は、CAR形質導入Jurkat T細胞を用いたもので、細胞溶解物を21%O2、50または200μMCoCl 2、または1%O2 未満で培養してから24時間後に回収し、ウェスタンブロッティングを用いてCAR発現について分析し、HER2-BBz CAR形質導入細胞を対照として含めた。(D,E)異なる酸素条件下でのCAR-T細胞の in vitro 細胞毒性とサイトカイン分泌。(D)CAR-T細胞を、ホタルルシフェラーゼ発現SKOV3細胞と示されたE:T比が1%または21%O2未満で共培養した。共培養の24時間後、非形質導入T細胞と比較した細胞関連ホタルルシフェラーゼ活性の変化を測定することにより、標的細胞の殺傷効率を決定しました。(E)上清は、分泌されたIL-2およびIFN-γを検出するために収集されました。結果は、平均± SEM (n = 3 人の健康なドナー) として表示されます (****p &lt; 0.0001)。略語: scFv = single-chain fragment variable;CAR=キメラ抗原受容体。パネル C と D はLiao et al.31から採用されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66697/66697fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

低酸素感受性キメラ抗原受容体T細胞の作製と機能検証

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Research

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