Name: プレミックス試薬とフリーズドライ試薬によるポイントオブケアCRISPRベースの診断 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶプレミックス試薬とフリーズドライ試薬を用いたポイントオブケアCRISPR診断法。等温核酸増幅とCRISPR検出を組み合わせ、感染症病原体の遺伝物質を高感度かつ迅速に検出する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>ポイントオブケア使用のための最適化されたCRISPRベースの分子診断プロトコル

<ol><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a%2FC2c2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics.</a> Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).</li>
<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and classification of CRISPR-Cas systems.</a> Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Arizti-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Cas13-based+assays+for+the+fast+identification+of+SARS-CoV-2+and+its+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants.</a> Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+Cas13-based+assay+with+point-of-care+attributes+for+simultaneous+COVID-19+diagnosis+and+variant+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance.</a> CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+Cas13-based+assay+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA.</a> Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li>
<li>Myhrvold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-deployable+viral+diagnostics+using+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13.</a> Science. 360 (6387), 444-448 (2018).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+detection+with+CRISPR%2FCas+system+from+applications+to+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges.</a> Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13a-based+detection+for+bovine+viral+diarrhea+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus.</a> Front Vet Sci. 8, 603919(2021).</li>
<li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHERLOCK%3A+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li>
<li>Selvam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-LAMP+CRISPR-Cas12%2F13-based+SARS-CoV-2+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods.</a> Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).</li>
<li>Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+visually+readable+loop-mediated+isothermal+reverse+transcriptase+nucleic+acid+amplification+test+for+detection+Ebola+Zaire+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA.</a> J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).</li>
<li>Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostic+with+CRISPR%2FCas%3A+Beyond+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).</li>
<li>Twistamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Twistamp%C2%AE+assay+design+manual%22">Twistamp® assay design manual</a>. , (2023).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+isothermal+amplification+assay+for+viral+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An enhanced isothermal amplification assay for viral detection.</a> Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).</li>
<li>Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%3A+Challenges+and+toward+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACSSynth+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications.</a> ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).</li>
<li>Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+DNA-free+RNA+for+use+in+vaccine+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies.</a> Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+strand-displacement+DNA+amplification+by+a+contactless+electrochemical+microsystem+using+interdigitated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes.</a> Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).</li>
<li>Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+molecular+enhancers+of+the+isothermal+exponential+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction.</a> Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+test+kit+for+visual+loop-mediated+isothermal+amplification+of+Salmonella+in+spiked+ready-to-eat+fruits+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables.</a> J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).</li>
<li>Curti, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+lyophilized+CRISPR-Cas12+assay+for+a+ensitive%2C+specific%2C+and+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Viruses. 13 (3), 420(2021).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+with+SHERLOCK+one-pot+testing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing.</a> N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).</li>
</ol>

核酸バイオマーカーの検出のためのCRISPRベースの診断法は、2017年に初めて報告されました 1,2,3,4 それ以来、食品医薬品局(FDA)が承認した検査、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAの検出に関する次世代の診断法として、複数の国で証明されています5,6,7,8.コロナウイルス病2019(COVID-19)を超えて、これらの技術は、多様なウイルスや細菌9,10,11,12,13、遺伝性疾患の突然変異や欠失の検出に効果的であることが実証されており、タンパク質や低分子バイオマーカー2,12を検出するように操作できます.CRISPRベースの診断法は、多くの場合、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)やループ媒介等温増幅(LAMP)14,15などの等温増幅法と、標的認識後の「側副」エンドヌクレアーゼ活性を持つRNA誘導CRISPR関連(Cas)酵素を用いたCRISPRベースの検出を組み合わせたものです3.等温増幅とCRISPRベースの検出の二重使用は、技術にいくつかの望ましい属性、特にゴールドスタンダードのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に近い高い診断精度、および一塩基多型1,9を含む小さな配列の違いを多重化して検出する能力を与えます。
しかし、CRISPRベースの診断法の最も精度の高い診断法は、複数のコンポーネントとステップを含んでおり、専門家でない人やポイントオブケア(POC)での実施が複雑になる場合があります。高精度のCRISPRベースの診断法の使用をPOC設定にまで拡大するというこの課題に対処するために、私たちは、プレミックス、凍結乾燥、リコンビナーゼベースの等温増幅反応およびCRISPRベースの検出反応を調製するためのプロトコルを開発しました。これらのプロトコルは、CRISPRベースの診断7に必要な生化学的成分の産生に関する追加情報を含むCRISPRベースの診断14、デザインガイドライン1、および代替の等温増幅技術2,14,15,16およびCas酵素12を使用した製剤を含む、CRISPRベースの診断14に関する既存の優れたプロトコルを補完するべきである.最終的には、CRISPRベースの診断法が、携帯型で機器不要の分析が必要な環境で、迅速で安価、かつ高感度な核検出を実現できることを願っています1,9,17。
当社のプロトコルでは、主にRPAとCas13ベースの検出を組み合わせて使用しています。RPAは周囲温度に近い温度(37-42°C)で機能するため、エネルギーと機器の要件は低くなっています。その他の等温増幅反応では、より高い温度が必要です(LAMP、60-65°C、ストランド変位増幅(SDA)、60°C、指数関数的増幅反応(EXPAR)、55°C、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、65°C)2。RPAプライマーの設計も、LAMPプライマーとは異なり複雑ではなく、マルチプレックス増幅7,9,14に拡張することができる。RPAを使用して2つのターゲットを超えて多重化することは実際には困難ですが、干渉を最小限に抑えるための多重化RPAプライマーの設計方法に関する明確なガイドラインがあります18。
キャリーオーバー汚染は2ステップワークフローで大きな問題であることに変わりはありませんが、生成されたRPAのアンプリコンは、LAMP14の大型コンカテメリックアンプリコンと比較してサイズが小さく、キャリーオーバー汚染を引き起こす可能性が低くなります。RPAプライマーは、標準的なガイドライン14に従って設計することができます:それらは一般的に25〜35ヌクレオチド長で、融解温度は54〜67°Cです。 アンプリコンのサイズは 200 塩基対未満である必要があります。逆転写酵素(RT)をRPAに添加してRNAからの増幅を可能にすることができ、逆転写RPA(RT-RPA)では、別の酵素リボヌクレアーゼH(RNase H)が典型的には少量で添加され、得られたRNA:DNAハイブリッドを分離し、増幅反応を促進する5,19。Cas13ベースの検出でT7転写を可能にするために、T7 RNAポリメラーゼプロモーターをフォワードRPAプライマーの5'末端に配置することができます。
RPAからアンプリコンが生成された後、crRNAでプログラムされたCas酵素で検出できます。アンプリコン検出に使用できるさまざまなCas酵素の中で、私たちは、その高い切断活性1と、十分に特徴付けられたポリヌクレオチド切断選好7,9のために、RNA標的Cas13変異体を好みます。Cas13のcrRNA配列は、スペーサーおよびダイレクトリピート(DR)配列により、産生されたRNAの標的部位に相補的(逆相補的)になるように設計されています。crRNA配列とRPAプライマーは、バックグラウンドおよび偽陽性を増加させるオフターゲット増幅産物の望ましくないCasベースの検出を避けるために、重複してはならない14。
Casベースの検出は、レポーター核酸分子(Cas13ベースの反応のRNAレポーター)の切断をモニターするために、さまざまな検出モダリティに依存しています1,2,14。さまざまな検出モダリティには、比色分析、電気化学的読み出し、蛍光、シーケンシング読み出し、ラテラルフローストリップ2が含まれます。我々は、単一の青色LED光源を用いて効果的に励起することができるシアニン5(Cy5)、ローダミンX(ROX)、カルボキシフルオレセイン(FAM)などの種々の蛍光色素およびレポーターを与えられた蛍光読み出し、およびそれらの蛍光をマイクロプレートリーダーまたはリアルタイムサーマルサイクラー7,14によって分析することに焦点を当てる。さらに、蛍光読み出しはセットアップが簡単で、継続的なモニタリングが可能なため、リアルタイムの定量が可能です。マルチプレックスRPA前増幅とCas酵素を用いたマルチプレックスCas13ベースの検出は、マルチカラー蛍光読み出しと組み合わせることで、複数の遺伝子ターゲットを同時に検出することができます2,7。
私たちのプロトコルでは、まず、RT-RPA試薬の凍結乾燥型にRNAサンプルを添加することにより、RT-RPAでRNAを等温増幅します(図1)。RT-RPAでは、生成された二本鎖DNAアンプリコンにT7プロモーターが付加されます。その後、RPA産物は、T7 RNAポリメラーゼも含まれる凍結乾燥Cas13ベースの検出に移されます。この検出反応は、DNAアンプリコンを(T7 RNAポリメラーゼを介して)RNAに変換し、crRNAプログラムCas13で容易に検出できます。標的活性化Cas13は、レポーター分子を切断して検出可能な蛍光シグナル2,7,14を産生します。ここでのプロトコルは、Leptotrichia wadei(LwaCas13a)による検出に関するものですが、直交するCas13およびCas12酵素7,9を使用して、最大4つのターゲットを同時にマルチプレックス検出するように拡張することができます。RPAとCasベースの検出反応も、感度は低下しますが、1つのチューブに組み合わせることができます14。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig01v2.jpg"> 図1:CRISPRベースの検出ワークフロー。 このワークフローは、2つの標的遺伝子の検出を示しています。まず、DNAターゲット内の関心領域をRPAで等温的に増幅します。RNAターゲットを検出する際に、逆転写(RT-RPA)を用いて反応を行うことができます。その後、T7転写はdsDNAアンプリコンをRNAに変換し、次に、標的結合時に側副RNase活性を誘発できるCas13-crRNA複合体によって認識されます。消光された蛍光レポーターの切断により、マイクロプレートリーダーを使用してモニタリングしたり、LEDトランスイルミネーターで可視化したり、リアルタイムのサーマルサイクラーで使用したりできる蛍光シグナルが生成されます。略語:CRISPR =クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。RT = 逆転写;RPA = リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;Cas = CRISPR関連タンパク質;LED = 発光ダイオード。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここで紹介するプロトコールの主な特徴は、凍結乾燥用のプレミキシング製剤です。プレミキシングにより反応の使用が簡素化され、再現性が向上しますが、RPAおよびCasベースの検出に含まれる多くの成分、特に逆転写やATPなどの不安定な補因子は溶液中で安定していません。したがって、我々は、長期保存および容易な輸送および展開のために凍結乾燥できるように、予混合溶液を配合する1,9,20。また、予混合された凍結乾燥試薬は、反応を再構成するためにより多くのサンプル量(したがって、より多くのDNA/RNAインプット)を添加することができるため、検出感度の向上にも役立ちます10。当社の製剤では、凍結乾燥RPAおよびCasベースの検出反応7の凍結保護剤として主にトレハロース21を使用しています。試薬の保存に加えて、トレハロースは、酵素安定化16,22,23,24の増加およびdsDNAの融解温度の低下23を介して反応も促進する。トレハロース以外の他の安定剤5,7,21,25,26の探索は、異なる使用シナリオに対してさらに最適な処方をもたらすかもしれない。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベタイン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 処理水</td><td>Invitrogen</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Merck</td><td>3870-25GM</td><td></td></tr><tr><td>EpiScript 逆転写酵素</td><td>Lucigen</td><td>ERT12925K</td><td></td></tr><tr><td>Gly-Gly-Gly&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-50239-1G</td><td></td></tr><tr><td>LwaCas13a</td> 自社<td>生産</td><td></td><td>株名:Leptotrichia wadei、略称:Lwa、タンパク質名:LwaCas13a</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液、1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>NxGenT7 RNAポリメラーゼ</td><td>Lucigen</td><td>30223-2</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カリウム溶液、5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95843-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Riobnucleotide Solution Mix</td><td>NEB</td><td>N0466L</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td></td><td>TCI TCI-S0111-500G</td><td></td></tr><tr><td>トレハロース二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-90210-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩溶液、1M、pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp ベーシックキット</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BluPAD デュアルLED ブルー/ホワイトライトトランスイルミネーター</td><td>Bio-Helix</td><td>BP001CU</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath Dual Block</td><td>ELITE</td><td>4-2-EL-02-220</td><td>モデル:EL-02</td></tr><tr><td>蛍光マイクロプレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>30050303</td><td>モデル: Infinite 200 Pro</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>LABCONCO</td><td>794001030</td><td>FreeZone Triad ベンチトップ凍結乾燥機</td></tr><tr><td>マイクロプレート 384 ウェル</td><td>Greiner</td><td>GDE0784076</td><td>F-Bottom, 小容量, Hibase, Med. バインディング, ブラック</td></tr><tr><td>リアルタイムサーマルサイクラー (CFX Connect リアルタイム PCR システム)</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5201</td><td>モデル: CFX Connect Optics Module</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>s-gene フォワード RPA プライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA</td></tr><tr><td>s-gene reverse RPA プライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG</td></tr><tr><td>n-gene フォワード RPA プライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG</td></tr><tr><td>n遺伝子逆RPAプライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA for the s gene</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUAGACUACCCAAAAACaaac GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA for the n gene</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUAGACUACCCCAAAACG AAGGGGACUAAAACAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC</td></tr><tr><td>FAM-polyU-IABkFQ レポーター</td><td>IDT</td><td></td><td>56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_F RPA プライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAAACCTTCACGCAATCG</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_R RPA プライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA</td></tr><tr><td>synT7crRNA13a_ O_hannah&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC</td></tr></tbody></table>

プレミックス試薬とフリーズドライ試薬によるポイントオブケアcrisprベースの診断

Point-of-care CRISPR-based Diagnostics with Premixed and Freeze-dried Reagents

SARS-CoV-2の s 遺伝子と n 遺伝子の組み合わせ検出によるFAM蛍光シグナル生成の動態と、凍結乾燥されたプレミックス反応製剤の最適条件を決定するためにその情報がどのように使用されたかに焦点を当てます。いずれの場合も、Ct 値が決定された検出限界(LoD)内に十分収まるサンプル(Ct ~31-33)と、LoDにCt があるサンプル(Ct ~35-37)7を含め、より感度の高いプロトコルを区別できるようにしました。
凍結乾燥されたプレミックスRT-RPAの場合、プレミックス反応にKOAcが含まれていると、反応感度に悪影響を与えることがわかりました(図2A)。したがって、プレミックス反応からKOAcを省略し、RNAサンプルを添加した後、反応開始剤であるMg(OAc)2とともに添加しました。また、同様のアッセイを使用して、凍結保護剤トレハロースの最適濃度(図2B)と凍結乾燥RT-RPA反応におけるトリグリシン7 の効果(図2C)を決定しました。したがって、最適な凍結乾燥されたプレミックスRT-RPA反応を、KOAcを含まない6%トレハロースで調製し(ただし、RNAサンプルの後に後で追加しました)、プロトコルセクション1に記載されているように、トリグリシンを添加しました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig02.jpg"> 図2:凍結乾燥されたプレミックスRT-RPA反応の最適化。 RT-RPA反応は、SAR-CoV-2の n 遺伝子を標的とするプライマーを用いて調製した。Mg(OAc)2 は、すべてのプレミックス反応から除外されました。プレミックス反応に(A)KOAc、(B)トレハロース、(C)トリグリシンを添加した場合の効果を評価した。生成されたFAM蛍光による反応モニタリングは、リアルタイムサーマルサイクラーまたは蛍光マイクロプレートリーダーを使用して行いました。トリプリケート測定の個々のデータが表示されます。略語:RT =逆転写;RPA = リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;CRISPR = クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。Cas = CRISPR関連タンパク質;SAR-CoV-2 = 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;Ct =サイクルしきい値;FAM =カルボキシフルオレセイン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
凍結乾燥されたプレミックスCas13aベースの反応では、正しい凍結保護剤を使用することの重要性を検証しました:6%トレハロースまたは2%スクロース19 のいずれかがうまく機能しましたが、1%または5%w / vの低ショ糖PEG20000凍結乾燥後の反応効率を維持しませんでした(図3)。MgCl2 はすべての反応から省略され、再水和ステップで追加されました。最適な凍結乾燥Cas13ベースの検出反応は、プロトコルセクション2に示すように、6%トレハロースで調製しました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig03.jpg"> 図3:凍結乾燥されたプレミックスCas13ベースの検出反応の最適化。検出反応は、SARS-CoV-2 n遺伝子由来のRPA産物を用いて37°Cで行いました。試験は凍結乾燥の前後に行われました。MgCl2は、すべてのプレミックス反応から除外した。(A)トレハロース、(B)PEG20000、(C)スクロースの凍結乾燥後の反応効率保存能力を評価しました。生成されたFAM蛍光による反応モニタリングは、リアルタイムサーマルサイクラーを使用して実施しました。「凍結乾燥後」条件の三重測定と「凍結乾燥前」条件の1回の複製からの個々のデータを示しています。図3A,BはPatchsung et al.7から引用した。略語:RPA =リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;SAR-CoV-2 = 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;FAM =カルボキシフルオレセイン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
RT-RPAおよびCas13ベースの反応用の凍結乾燥プレミックス試薬は、-20°Cで少なくとも8か月間安定です[図4]。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig06.jpg"> 図4:凍結乾燥、プレミックスRPAおよびCRISPR-Cas13a試薬の-20°Cでの安定性試験。 (A)30日後、(B)45日後、(C)3ヶ月後、(D)5ヶ月後、(E)8ヶ月後の安定性試験。トリプリケート測定の個々のデータが表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
SARS-CoV-2の s 遺伝子と n 遺伝子を検出するための凍結乾燥RT-RPAおよびCas13ベースの反応のLoDを 図5に示します。シグナル生成の動態は、1つの遺伝子のみが検出された場合と比較して、デュアル遺伝子検出によって改善できます。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig04.jpg"> 図5:単一遺伝子検出と二重遺伝子検出の分析感度(A)凍結乾燥シングルプレックスRT-RPAのLoDと、SAR-CoV-2のs遺伝子を標的としたCasベースの検出。(B)凍結乾燥シングルプレックスRT-RPAのLoDとSAR-CoV-2のn遺伝子を標的としたCasベースの検出。(C)凍結乾燥マルチプレックスRT-RPAのLoDと、s遺伝子とn遺伝子を標的とするデュアルCasベースの検出。LoDは、段階希釈したSARS-CoV-2 RNAを使用して決定し、そのCt値はn遺伝子を標的とするRT-qPCRアッセイを使用して決定しました。3〜6回の反復測定からの個々のデータが表示されます。略語:LoD =検出の制限;RT = 逆転写;RPA = リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;CRISPR = クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。Cas = CRISPR関連タンパク質;SAR-CoV-2 = 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;Ct =サイクルしきい値;qPCR = 定量的ポリメラーゼ連鎖反応。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ウイルス検出だけでなく、CRISPR診断に基づくPOCジェノタイピングツールのプロトタイプを展示し、タイ固有の毒ヘビ種の特定を支援します(図6)。咬傷から採取したDNAサンプルを通じてヘビ種をより迅速かつ正確に同定することで、抗毒素の迅速な投与が可能になり、患者の生存率が向上します。我々は、Ophiophagus hannah(キングコブラ)を含む8種のヘビのミトコンドリアシトクロムb(cytb)遺伝子内の領域を標的とし(図6A)、O. hannah cytb遺伝子の合成DNA代理の検出がアトモルレベルの感度に達することを示しました(図6B、C)。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig05.jpg"> 図6:ヘビ咬傷の毒物からヘビ種を特定するためのCRISPRベースの検出のプロトタイプ(A)Ophiophagus hannahのcytb遺伝子を検出するためのRPAプライマーとLwaCas13a crRNAデザイン。T7プロモーター(T7オーバーハング)は、フォワードRPAプライマーの5フィート端に配置されました。(B)60分間にわたるFAMシグナル生成の動態と(C)LwaCas13aを介したO.hannahのcytb遺伝子セグメントに対応する合成dsDNAインプットの検出によるエンドポイントFAM蛍光。異なるインプット濃度(0、10-9、10-12、10-15、10-18 M)を使用しました。データは、三重測定からの平均± s.d. です。略語:RPA =リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;CRISPR = クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。Cas = CRISPR関連タンパク質;FAM =カルボキシフルオレセイン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="5">CRISPR-Cas13aプレミックス検出試薬の凍結乾燥</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">歩</td>
			<td>ランプレート</td>
			<td>シェルフ温度</td>
			<td rowspan="2">時間 (hh:mm)</td>
			<td>バキューム</td>
		</tr><tr><td>(°C/分)</td>
			<td>(°C)</td>
			<td>(mbar)</td>
		</tr><tr><td>フリーズ1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>オフ</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>ドライ1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>オフ</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>ドライ2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>01:00</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>ドライ3</td>
			<td>3</td>
			<td>20</td>
			<td>∞</td>
			<td>0</td>
		</tr></tbody></table>表1:プレミックスRT-RPAおよびCRISPR-Cas13a検出試薬の凍結乾燥機設定。 略語:RT =逆転写;RPA = リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;CRISPR = クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。Cas = CRISPR関連タンパク質。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">パラメーター</td>
			<td>設定</td>
		</tr><tr><td colspan="2">温度</td>
			<td>37°C</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">キネティックサイクル</td>
			<td>所要時間</td>
			<td>02:00 (分秒:秒速)</td>
		</tr><tr><td>インターバル時間</td>
			<td>02:30 (分分:ss)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">揺さぶり</td>
			<td>所要時間</td>
			<td>1秒</td>
		</tr><tr><td>モード</td>
			<td>リニア</td>
		</tr><tr><td>振幅</td>
			<td>1ミリメートル</td>
		</tr><tr><td>蛍光強度</td>
			<td>励起波長</td>
			<td>488 nmの</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>発光波長</td>
			<td>520 nmの</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>モード</td>
			<td>ページのトップへ</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Zポジション</td>
			<td>24470</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>得</td>
			<td>71</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>統合時間</td>
			<td>20μ秒</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>フラッシュの数</td>
			<td>25</td>
		</tr></tbody></table>表2:核酸検出用の蛍光マイクロプレートリーダープログラム。

プレミックス試薬とフリーズドライ試薬によるポイントオブケアCRISPRベースの診断

Molecular diagnostics by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-based detection have high diagnostic accuracy and attributes ...

point-care-crispr-based-diagnostics-with-premixed-freeze-dried

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ampliPHOX比色検出技術は、マイクロアレイの蛍光検出に安価な代替手段として提示されます。光重合に基づいて、ampliPHOXはわずか数分で肉眼で見える固体高分子スポットを生成します。結果はシンプルかつ強力なソフトウェアパッケージと一緒にして撮像し、自動的に解釈されます。...

インフルエンザのためのDNAマイクロアレイ上ampliPHOX比色検出

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9...

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

本研究では、CRISPR-Cas12aと組み合わせたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅に基づくカン ディダトゥス...

CRISPR-Cas12aと組み合わせたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅を用いたフィールド展開可能な カンディダトゥス ・リベリバクター・アジアティカス検出(英語)

DNAウイルスの微量検出のための組換えポリメラーゼ増幅とCRISPR/Cas12aシステムを組み合わせたプロトコルを提示し、ポイントオブケアDNAウイルス検出のための人工知能支援分類を備えたポータブルスマートフォン顕微鏡を構築します。...

RPA-CRISPR/Cas12A-SPMとディープラーニングに基づくDNAウイルス検出システム

ここでは、逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMP)によりヒトサンプル中のSARS-CoV-2ウイルスを検出する方法を標準化し、実装するための完全なプロトコルを提供します。この方法は60分以内に完了し、低コストで安価な機器を使用して、あらゆる検査室やポイントオブケアに適応できます。...

逆転写ループを介した等温増幅によるSARS-CoV-2ウイルスの検出

このプロトコルでは、CRISPR-Casを介した多検体合成尿バイオマーカー検査について説明しており、腫瘍関連プロテアーゼ活性のex...

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

アシネトバクター・バウマニーの迅速かつ正確な検出を容易にするために、A.

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12aベースシステムを用いた Acinetobacter baumannii 感染症の迅速かつ特異的な検出

ここでは、増幅可能な細胞溶解、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、およびCRISPR/Cas12aアッセイを使用して、 Lotmaria passim や Nosema ceranae...

RPA/CRISPR/Cas12aシステムへのアルカリ溶解によるトリパノソーマ科寄生虫および Nosema ceranae のオンサイトDNA検出

学ぶプレミックス試薬とフリーズドライ試薬を用いたポイントオブケアCRISPR診断法。等温核酸増幅とCRISPR検出を組み合わせ、感染症病原体の遺伝物質を高感度かつ迅速に検出する方法です。

プレミックス試薬とフリーズドライ試薬によるポイントオブケアCRISPRベースの診断

さらに動画を探す