Name: 脊髄損傷における細胞移植を検証するためのプラットフォームとしての長期マウス脊髄器官型スライス培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学ぶ長期マウス脊髄器官型スライス培養を用いた細胞移植の検証法。神経幹細胞の生存・統合・成熟を評価し、脊髄損傷における細胞置換治療の有効性を体外で検証する革新的プラットフォームです。

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この研究は、Wings for Life Foundation(WFL-IT-20/21)、欧州連合Next-Generation EU-National Recovery and Resilience Plan(NRRP)-mission 4 component 2、Investment n. 1.4-CUP N. B83C22003930001(Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8)、Marina Romoli Onlusの支援を受けました。この原稿は著者の見解や意見のみを反映しており、欧州連合(EU)も欧州委員会もそれらに対して責任があるとは考えられません。データとメタデータは、Zenodo 10.5281/zenodo で入手できます。10433147。 画像はBiorender https://www.biorender.com/ で生成しました。

脊髄器官型培養におけるh-SC-NES細胞の長期生着

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

SCI患者に対する効果的な治療法はまだなく、さまざまなアプローチが検証されており、最も有望なアプローチの1つは、再生戦略である細胞置換に基づいています。現在、再生医療分野の進歩により、細胞移植の有効性と安全性を単独で、または他のアプローチと組み合わせて検証するための新しいプラットフォームが求められています。その前臨床検証は、さらなる臨床研究を追求するために不可欠です。SC器官型培養は、神経変性、神経再生、および神経発生のさまざまな側面を研究し、新しい治療アプローチの有効性を調査するための有用なプラットフォームである23。特に、器官型培養物の特有の特徴である、元の組織構造の維持や細胞・微小環境組成は、細胞の生着、統合、分化、成熟などの移植動態を解明するのに有利です。
公表されたプロトコルと一貫して、SC器官型スライスは、健康な状態で約2〜3週間培養中に保持することができ、細胞療法の試験スキームに必要な長期調査および機能スクリーニングのためのそれらの使用を制限する。SC組織内に移植された細胞の正しい運命に向けた分化や成熟などの重要なプロセスを探求するには、長期的なモニタリングが必要です。これらの細胞プロセスは、動物モデルでの一般的な移植において重要です。in vivoに存在する多くの特徴を模倣したex vivoシステムが利用可能であることは、前臨床スクリーニング段階で役立つでしょう。
このため、本研究では、生存可能なSCスライスを最大90日間維持し、通常の培養期間を3倍にすることができる最適な長期(≥30日)のSC器官型培養法を提案します。また、h-SC-NES細胞のSCスライス内への安定した生着と、最大30日間の移植培養の維持が認められました。GFPの発現を観察することで、細胞の生着を経時的にモニタリングし、DPT 30までの細胞生存を確認しました。30 DPT後、細胞のアポトーシス率を評価しました。文献では、7 DPTでのSCスライスにおける移植されたh-SC-NES細胞のアポトーシスの評価が報告されている40。ここでは、DPT 30で細胞アポトーシス解析を拡張し、以前の時点(DPT 7)に対するアポトーシス速度を比較しました。その結果、私たちのデータは文献と一致しており、移植されたh-SC-NES細胞は、私たちの研究で最適化された培養条件に維持されていれば、後の時点でも生存することが示唆されていることがわかりました。この改良された長期 ex vivo プラットフォームを単独で、または移植構成で使用することで、研究者はSCIの幹細胞ベースの移植の前臨床スクリーニングに役立ちます。これにより、移植の成功を促進するさらなる in vivo 研究に最適な細胞候補を特定することができます。さらに、最初のスクリーニング後、SC器官型スライスを in vivo 研究と並行して使用して、動物モデルで観察された長期的な細胞動態と挙動を確認および裏付けたり、メカニズム研究をサポートしたりすることもできます。
私たちのプロトコルでは、この長期的な器官型モデルを生成する方法を詳しく説明していますが、いくつかの重要なステップについても説明する必要があります。SC器官型培養物の作製に関しては、手術中および培養の初期段階ではいくつかの課題があります。元の組織構造を維持するスライスを生成するには、適切に実施された手術手順が不可欠です。分離中にSCが台無しになると、スライスは典型的な解剖学的構造を失い、組織の損傷は過度の炎症誘発性損傷を誘発し、不健康な状態や細胞死につながる可能性があります。手術中の最も困難な段階は、背骨からのSCの抽出と、分離されたSCからの髄膜の除去です。これらの手順が成功するかどうかは、オペレーターの経験にかかっています。したがって、実験を開始する前にトレーニング期間を設けることをお勧めします。
チョッパーによるSCの冠状切片化も困難な段階です。分離されたSCは、ブレードに対して正確に垂直なカッティングデッキに配置する必要があります。また、オペレーターはブレードをカッティングデッキに対して垂直に配置する必要があります。これらの予防措置は、同じ実験と異なる実験間で再現性のあるスライスを確実に生成するために必要です。もう一つの重要な問題は、手術の時間が限られていることです:スライス生成手順全体は~30分かかります。オペレーターが手術や切断により多くの時間を費やすと、SC組織が損傷し、培養の成功と実験の次のステップが損なわれる可能性があります。
スライスを培養膜に置いたら、正しく供給することが重要です。GDNFは、組織の回復と生存を維持するために必要です。チョッパーによる切断は組織にとって外傷性であり、このため、切断後すぐにスライスを氷冷解剖培地に入れて、過剰な炎症誘発性分子と死促進分子を洗い流します。次に、GDNFで修飾した新鮮な培地でスライスを培養メンブレン(細胞培養インサート)に置き、より迅速な回収とメンブレンへのスライス接着を促進します。GDNFは、半減期が短いため、培養の最初の1週間は毎日培地に追加する必要があります50,51。その結果、スライスは、組織の回復と生存率を促進するために、培養の最初の数日間はGDNFが継続的に存在する必要があることがわかりました。いずれにせよ、GDNFの存在は培養期間全体にとって重要であるため、それ以上の時点でGDNFの管理を中断することは強くお勧めしません。
培養の最初の1週間は、目視と顕微鏡でスライスを肉眼的にチェックすることも重要です。半透明の組織と境界の透明性は、スライスがメンブレンと生存組織に適切に接着していることを示しています。壊死組織は、最初は肉眼的には非常に白く見え、顕微鏡では壊死領域は濃い灰色に見えます。数週間培養すると、組織の形態が変化することがあります:細胞の動きと膜への組織の接着がこのプロセスに影響を与える可能性があります。例えば、細胞で満たされた一部のスライスでは中央内腔の喪失や、背側および腹側の角の形態の喪失が観察されました。これは主に小さなスライスで発生しますが、それらのほとんどは元のスライスに近い解剖学的構造を維持します。スライスは通常、腰部または胸部から生成されます。このようにして、元の組織構造を長期にわたって維持するための適切なサイズを持つことができるため、小さすぎるとアーキテクチャが失われ、大きすぎると中央領域が壊死する可能性があります。したがって、マウスの子犬の腰部を使用して、最適な長期培養に適したサイズのスライスを生成しましたが、原則として、他のセグメントも考慮できます。さらに、腹側と背側の領域が互いに区別しやすいため、腰部を使用することを選択しました。さらに、この領域は、SCIの細胞補充療法で関心のある部位である運動ニューロンと灰白質の割合が高い組織領域を示しています。細胞を通過させるための穴が大きすぎると、マイクロインジェクション中にSC組織に損傷を与える可能性があります。小さすぎると、細胞のスタッキングが針を詰まらせ、移植プロセスを妨げる可能性があります。移植手順は、細胞の苦痛と死を最小限に抑えるために1時間以内に完了する必要があります。
提案されたプロトコルは、さまざまなタイプの調査に最適で汎用性の高いツールを提供します。ここでは、長期プラットフォームを適用して、マウスSC組織内での分化の最初の段階でh-SC-NES細胞を30日間移植することを検証します。提案されたアプローチの主な新規性は、共培養プロトコルの最適化です。GMの成分は、SCスライスと移植されたh-SC-NES細胞の長期的なニューロン生存を維持します。実際、GMは、無血清培地であるため、以前に器官型スライス培養に使用された培地47に関して、移植された細胞のニューロン運命への分化を維持する。
SCIの提案モデルについては、通常、成体マウスで実験が行われます。これまでのところ、新生児と成体SCとの間の最も重要な違いは、成体マウス52に関して新生児に見出されるより高い再生能に関連している。しかし、このような違いは、私たちが提案しているプロトコルのタイプに影響を与えることはありません、なぜなら、ここでは、常在ニューロンの再生能力ではなく、宿主組織環境に対する移植細胞の応答に焦点を当てているからです。SCI後の新生児マウスと成体マウスの別の違いは、成体に発生するグリア瘢痕の形成に関連しています。この側面は、一次および二次損傷に起因する複雑な生理病理学的プロセスを考慮していない提案されたモデルでは考慮されていません。
アプリケーションに関しては、このプラットフォームは、移植された細胞とSC器官型モデルに存在する常在回路との間の統合を調査するためにも使用できます。遺伝子工学ツールは、シナプス結合性を評価するためにCNSですでに使用されており、この点で活用できる可能性があります53,54,55。特に、生着細胞とSC ex vivo組織との間のシナプスの形成を評価することにより、この統合を調査および検証できます。これらの長期的な器官型培養物は、神経保護剤や神経再生剤、新規の分子/材料の試験、またはSCが関与する神経変性疾患の研究にも利用できる可能性があります。特定の神経変性疾患を研究するためには、特定の病理関連変異を持つトランスジェニックマウスなどの関連モデルから生成されたSCスライスを、病理学の関連段階(すなわち、新生児、若年性、成人)で培養するために、プロトコルを適合させる必要があります。結論として、私たちのプロトコールおよび器官型培養は、特定の臓器の外植片であり、2D細胞培養とin vivoモデルとの間のギャップを埋める特徴を示しており、基礎研究と前臨床試験の両方にとって非常に貴重なツールであることが確認されています。

外傷性脊髄損傷 (SCI) は、患者と介護者に壊滅的な身体的、心理的、経済的影響を及ぼします1.SCIにおける軸索再生を促進するために、さまざまなアプローチで多くの試みが行われてきました2,3,4そして、細胞補充療法を通じて損傷部位の近位ニューロンと遠位ニューロンの間にニューロンリレーが形成されることによって、いくつかの有益な効果が実証されました。移植された細胞は、栄養サポート、免疫調節、可塑性の誘導による失われた神経回路の再生、細胞置換、軸索再髄鞘形成6など、多くの役割を果たすことができるため、細胞治療への関心は依然として高まっています5。
最近、この分野での主な取り組みは、ヒト神経幹細胞/前駆細胞(NSC/NPC)に焦点を当てています7。いくつかの研究は、NSC/NPCがアストロサイトの応答を調節し8、再生促進因子9,10の分泌を促進し、SCI11,12で欠落しているニューロン細胞を置き換えることを示唆しています。しかし、移植された細胞が機能的なニューロンに分化することを裏付ける研究はまだ不十分です。さらに、損傷した脊髄(SC)での移植細胞の生存率と分化率は低く、おそらく移植された細胞が生体内で分化するのに数週間、場合によっては数か月かかるためである。さらに、現在の研究では、細胞補充療法の多くの生化学的、分子的、細胞的、および機能的側面が完全に解明されていません。このような状況では、細胞生着のメカニズム、つまり生着した細胞が増殖し、特定のタイプまたは細胞の亜集団に分化し、常在ニューロンとシナプスを形成する能力を研究するために、シンプルで高速かつ費用対効果の高いモデルが必要です。
組織学的研究を電気生理学的記録とトランスクリプトームおよびプロテオームプロファイリングに統合することは、細胞移植後に発生する分子カスケードを完全に理解するために必要です。これにより、前臨床モデルや臨床研究における新しい細胞置換療法の設計と検証が確実にスピードアップします。実際、今日まで、げっ歯類、大型動物、およびヒト以外の霊長類の使用は、移植後の多くの細胞プロセスを解明する上で価値があった14。しかし、高コスト、高い倫理的影響、および生物の複雑さのために、それらの使用はしばしば一筋縄ではいかず、生化学的および分子的プロセスを解明するのに適切ではありません。さらに、それらは、種間(代謝)と種内変動(性別、年齢)の両方である生物学的差異と相関する多くの欠点を提示する可能性があります。 これらの要因は、ストレスの多い状況などの外的要因とともに、実験の結果と、ヒトへの治療的翻訳の観点からのそれらの予測可能性を変える可能性がある15,16,17。
そのため、多くのグループでは、動物モデルに加えて、2D in vitro細胞培養やex vivo器官型スライス(ex vivo培養)を採用しています。2D細胞培養は、単一細胞および/または細胞集団レベルで特定の生物学的プロセスを研究するために最も一般的に使用されるシステムです。それにもかかわらず、単層細胞培養は、生物全体に見られる複雑さを反映していません。組織構造および生理学的環境の欠如は、2D培養システムが調査対象の組織18,19,20の主要な構造的、形態学的、および機能的側面を完全にエミュレートすることを可能にしない。器官型培養は、これらの問題のいくつかを克服することができます。器官型モデルは、組織または器官の断片を移植し、それを限られた期間21,22 ex vivoで維持することに基づいています。特に、外植された組織のスライスは、栄養素がスライス内のほぼすべての細胞に容易に到達できるように、正確な厚さで生成されます。それらは、海馬、視床下部、小脳、視床、大脳皮質、黒質および線条体、ならびに脊髄23のような中枢神経系の様々な領域から生成することができる。器官型培養は、起源の器官の組織構造、細胞の空間分布、細胞の多様性、および環境(すなわち、細胞外マトリックス組成)を保持します。さらに、それらは元の神経活動、細胞間の接続、特に外植片後の短距離回路を保持します。
これらの側面は、単層培養と動物モデルの両方に関して、ex vivo培養にいくつかの利点を提供します。それらは、生体内で見られる主要な組織の特徴を保持していますが、コストを削減し、培養環境パラメータ24,25,26,27,28,29の正確な制御により、さまざまな種類の分子、細胞、および機能実験を実行する可能性があります.器官型スライスは、特定の疾患の主要な組織病理学的特徴に類似させることにより、さまざまな神経障害のモデルを開発するためにも利用することができる30。さらに、元の多細胞組織環境が保持されているため、薬物スクリーニングや神経保護分子および神経再生分子および材料の試験に適したプラットフォームになります。
この研究では、NSC移植を最適化するためのモデルとして、SC器官型培養の使用を提案します。宿主(SC組織)と移植(NSC)の両方の生存を数週間保証するには、最適な培養条件が必要であるため、これは簡単なことではありません。器官型培養、脳由来およびSC由来の様々な種類の細胞に移植された異なる研究グループ。ほとんどの研究は、間葉系幹細胞31,32,33、嗅覚被覆細胞34、またはNSCs35,36,37,38,39,40の移植を示し、生着細胞と宿主細胞との相互作用、システム全体の生存、および移植された細胞がニューロンまたはニューロン様細胞に分化するかどうかを評価しましたex vivo組織環境32,33,41の内部。彼らの一部は、移植後の細胞の再生能を評価し、組織37,40,41内の軸索成長を観察し、オリゴデンドロサイトの生着前駆体の髄鞘形成能力42、生着した細胞の宿主組織43への移動、および移植された細胞が再生促進環境31に向けて推進する因子を放出したかどうかを観察した.現在の研究の1つの制限は、彼らが長期間にわたって生着を調査していないことです。
NSCがin vivoで分化するのに数週間かかると思われることを考慮する 44,45、この研究では、マウスSCスライスを最大90日間、長期間(≥30日間)生成および維持する方法に焦点を当てています。スライスは、元の解剖学的構造を保持し、長期にわたって低く安定したアポトーシス率と高い細胞生存率を維持することがわかった。神経細胞マーカーであるRNA binding fox-1 homolog 3(RBFOX3)とニューロフィラメント軽鎖(NFL)のびまん性発現が観察され、後者は時間の経過とともにスライスの周囲に軸索の発芽が増加する傾向を示し、それらの健康状態を証明しています。さらに、神経細胞の分化初期段階において、GFP発現ヒトSC由来神経上皮幹細胞(h-SC-NES)をSCスライスに移植することに成功しました。NSC移植片は移植後30日間維持され、細胞は培養中の全期間にわたってGFP発現を示しました。移植後日(DPT)30における細胞のアポトーシス速度も、同じ細胞40のDPT7で観察されたアポトーシス速度値に関して一致していることがわかった。 細胞は組織環境に生着したようで、数週間まで生存しました。
要約すると、私たちのデータは、SC器官型スライスを元の細胞構造と組織環境を損なうことなく、培養中に3か月間維持することが可能であることを示しています。最も重要なことは、 in vivo 実験を進める前に細胞治療の試験に活用できるため、コストと実験時間を短縮できることです。ここでは、マウスSC器官型スライスを生成するためのすべてのパッセージと、それらを長期間(≥30日間)維持する方法を詳細に説明します。また、スライスへのNPC移植の方法や、ダウンストリーム解析のための維持方法についても深く解説します。

<table><tbody><tr><td>切断防止カスパーゼ-3,&nbsp;(ASP175)(5A1E) (ウサギ)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9661S</td><td>1:400</td></tr><tr><td>抗GFP (マウス) - モノクローナル</td><td>Sigma/Merck</td><td>G6539</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Human Nuclei (マウス) - モノクローナル、クローン 235-1&nbsp;</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1281</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Human Nuclei (Rabbit)</td><td>NeoBiotechnologies</td><td>RBM5-346-P1</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) - ポリクローナル</td><td>Sigma/Merck</td><td>ABN78</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL (Mouse)</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1615</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal</td><td>Biologend</td><td>840801</td><td>1:500</td></tr><tr><td>アクアポリマウント</td><td>Poly-sciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Gibco</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>ブレード</td><td>ライカ</td><td>118364227</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養等級水</td><td>Sigma/Merck</td><td>W3500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ラットテールからのコラーゲン</td><td>Sigma/Merck</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡 - A1 共焦点顕微鏡 (Eclipse Ti)</td><td>ニコン&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-グルコース</td><td>Sigma/Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma/Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma/Merck</td><td>gf144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>ステムジェント</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>シグマ/メルク</td><td>SRP3200</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー、3.5インチ&nbsp;</td><td>ドラモンド・サイエンティフィック・カンパニー</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG アレクサ・フルーア 488</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ・アンチ・マウス IgG アレクサ・フルーア 647</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A21236</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ・アンチウサギ IgG アレクサ・フルーア 568</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A11011</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ-抗ウサギ IgG アレクサ フルーア 647</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A21244</td><td>1:500</td></tr><tr>統計<td>分析用</td><td>グラフパッド-プリズム</td><td>ドットマティクス</td><td></td>ソフトウェア</tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ/メルク</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>シグマ/メルク</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルス調製</td><td>Addgene</td><td>17446-LV</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 生存率/細胞毒性アッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L32250</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダーのヒント</td><td>エッペンドルフ</td><td>移植</td><td>用針に細胞をロードする5242956003</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>631-0909</td><td></td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養膜</td><td>Sigma/Merck</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>ミスクロスコープカバーメガネVWR</td><td>&nbsp;</td><td>ECN 631-1572</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (35mm)</td><td>VWR</td><td>734-2317</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma/Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックパスツールピペット</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>空気圧 PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Microinjector for transplantation</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma/Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No 10 滅菌ステンレス鋼</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel ハンドル #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Springはさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>501235</td><td></td></tr><tr><td>イメージングおよび取得用実体顕微鏡</td><td>ニコン&nbsp;</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>手術用実体顕微鏡</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers-Dumont #5-inox</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissers, 8.5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Micropipette puller</td><td>Shutter Instrument</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>R&Dシステムズ</td><td>1254/50</td><td></td></tr></tbody></table>

脊髄損傷における細胞移植を検証するためのプラットフォームとしての長期マウス脊髄器官型スライス培養

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

脊髄損傷(SCI)の解決策は、複雑な病態生理学のためにまだ不足しています。最も有望な再生アプローチの1つは、失われた組織を置き換え、機能回復を促進するための幹細胞移植に基づいています。このアプローチは、より高価で時間のかかる動物試験を進める前に、安全性と有効性のために in vitro および ex vivo でさらに検討する必要があります。この研究では、マウス脊髄(SC)器官型スライスにヒト神経幹細胞を移植して、SCIの細胞補充療法をテストするための長期プラットフォームの確立を示します。
標準的なSC器官型培養物は、 in vitroで約2〜3週間維持されます。ここでは、最大90日間の長期メンテナンス(≥30日間)に最適化されたプロトコルについて説明します。SCスライスの長期培養に用いた培地は、神経幹細胞を器官型モデルに移植するためにも最適化されました。緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターを有するヒトSC由来神経上皮幹(h-SC-NES)細胞をマウスSCスライスに移植した。移植から30日経っても、細胞は依然としてGFP発現を示し、アポトーシス率は低いことから、最適化された環境が細胞の生存と組織内での統合を維持していたことが示唆されています。このプロトコールは、SC組織における細胞補充療法を効率的に試験するための堅牢なリファレンスです。このプラットフォームにより、研究者はさまざまな細胞移植療法の ex vivo 事前スクリーニングを行うことができ、 in vivo 実験を進める前に最も適切な戦略を選択するのに役立ちます。

記載された方法は、ステージP3のマウスからのSC器官型スライスの確立、および健康な条件で長期間培養中のそれらの維持を可能にする。さらに、スライスに細胞を移植し、最大30日間共培養するためのプロトコルを示します(図1)。まず、培養条件の最適化と、移植細胞を用いたSCスライスの長期培養に適したプロトコールを示します(図2A)。スライスは、OM内のDEV0からDEV2まで生成され、維持されるが、これはもともとSCスライス47の保守のための最適な媒体として提案されていた。しかし、血清タンパク質が存在するため、この培地は、移植された神経前駆細胞のニューロンの分化と成熟を維持するには最適ではない可能性がある。実際、DEV 3では、OMからGMへの切り替えをテストしました。これは、神経生存をサポートするNeurobasalとB27を含み、正しいニューロンの分化を阻害する血清を含まない製剤であり、代わりにグリア運命を促進します48,49。
図2Bは、DEV 3の培地をOMからGMに切り替えた場合の結果と、切り替えを受け取らなかったSCスライス(コントロールスライスをOMで培養した)と比較した結果を示しています。スライス内のNFL信号の分布をニューロンの完全性のマーカーとして使用しました(図2B、C)。DEV 7のスライスは、両方の培養条件で健康であり、その内部にニューロフィラメント(NFL、緑色)の拡散分布が示されました。DEV 10では、GMで培養されたスライスは、OMで培養されたコントロールスライスと比較して、NFL染色分布によって実証されているように、より健康的であるように思われました。また、図 2B の代表的な画像に示されているスライスの NFL+ 面積 (% NFL+ Area/DAPI+ Area) も推定しました。推定されたNFL+面積は図2Cのヒストグラムに表されており、NFL信号が両方の条件下でDEV 7のスライスに拡散的に分布していることが確認されています。しかし、DEV10では、OM培養条件ではNFL染色の推定面積が減少します。
これらのデータは、DEV 3 での GM への切り替えが、SC スライス (DEV 10) の長期培養に対して忍容性が高いことを示唆しています。次のステップとして、GMをより長い時間(DEV 30、DEV 60、DEV 90)でテストしました。図3A,Bに示すように、スライスはDEV90まで培養中において健康に保たれていた。NFL染色は、各時点でスライスに広く存在し、中央領域から出発する神経突起のスライスの周りに拡散発芽が見られました。実際、図 3A に示されているスライスの NFL+ 領域を推定し、図 3B のヒストグラムに示すように、時間の経過とともに増加しました。また、ニューロンマーカーRBFOX3に対する陽性性も観察され、スライスのニューロン分化の別の証拠を提供しました。各時点で、aCASP3に陽性の細胞の数を異なるスライスで評価することにより、アポトーシス率も確認しました(図4A、B<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank"></a>

この論文では、神経幹細胞を移植した脊髄器官型スライスを長期間生成および維持するための再現性のある方法を提供し、細胞置換療法をテストするための ex vivo モデルとして提供します。

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

私たちは、脊髄損傷に対処するための有望な再生アプローチの開発に関心があります。この論文では、脊髄研究における細胞補充療法をテストするための脊髄器官型モデルを検証します。これまで、脊髄器官型モデルはin vitroで2〜3週間培養されています。また、継代培養培地は、神経幹細胞の生着、分化、成熟には最適ではありません。細胞置換療法では、移植された細胞が失われた回路を再構成する能力を発表するための改善が依然として必要です。このプロトコルを通じて、生着神経幹細胞の生存、統合、成熟率などの細胞移植関連の問題に取り組むための新しい長期ex vivoプラットフォームを提供します。このプラットフォームは、研究者が細胞移植の最適な戦略を見つけるのに役立ち、in vivo検証に必要な動物の数を減らすことができます。当社のプロトコルは、概念実証と最適化研究の実施にシンプルで迅速、かつ費用対効果が高いです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

神経前駆体の移植は、保護および/または脊髄損傷（SCI）と運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索laterals硬化症（ALS）で失われた/機能不全子宮頸部横隔運動ニューロンを交換するための有望な戦略である。我々は、ALSとSCIの齧歯類モデルにおける頚髄前角に細胞送達のためのプロトコルを提供しています。...

筋萎縮性側索硬化症や外傷性脊髄損傷では頚椎前角をターゲットとするための髄腔内細胞移植

出典: Palma-Tortosa, S., et.al.ヒト幹細胞移植と検証のためのex vivoモデルとしての成人ヒト皮質の器官型培養J. Vis.

幹細胞由来の神経前駆細胞のヒト皮質スライスへの移植

スライス培養、遺伝子的および薬理学的摂動による胚の操作を容易にする。しかしながら、培養条件は、通常の開発では、スライスの低減環境内で進めることができることを確認する必要があります。我々は、少なくとも24時間にわたって進行する通常の脊髄の開発が容易にプロトコルを示している。...

ニワトリ胚脊髄スライス培養プロトコル

増殖因子を含むフィブリンマトリクスは、完全な脊髄切断の部位に移植された神経幹細胞を維持するために使用した。移植された細胞が完全に病変空洞を満たし、長距離のホスト脊髄に軸索を延長したニューロンを含む複数の神経細胞型に分化した。...

重度の脊髄損傷後のフィブリンおよび成長因子カクテル神経幹細胞の生存と分化の促進

前脳と小脳のスライス培養システムを使用してNG2細胞とオリゴデンドロサイトを研究する技術が説明されています。...

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

脊髄損傷は、深刻な罹患率および高い死亡率を引き起こす外傷性状態である。本研究では、具体的に、神経幹細胞の移植に続いて、マウスにおける脊髄損傷の挫傷モデルを記述する。...

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

ここでは、in vitroでの脊髄固有の接続の機能的再生を研究するために、マルチ電極アレイ上で培養脊髄スライスに基づいてされているプロトコルを提示します。...

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

この研究は、WT新生児マウスからのニューロンの単離のための技術を提示する。新生仔マウスから脊髄を注意深く切開し、続いて脊髄組織からニューロンを機械的および酵素的に切断することが必要である。...

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

この資料では、完全断裂後脊髄切り株とシュワン細胞 (SCs)...

シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・ セッション導管内

このプロトコルは、人工多能性幹細胞由来の皮質前駆細胞の ex vivo...

ヒト幹細胞移植および検証のための ex vivo モデルとしての成体ヒト皮質の有機型培養

学ぶ長期マウス脊髄器官型スライス培養を用いた細胞移植の検証法。神経幹細胞の生存・統合・成熟を評価し、脊髄損傷における細胞置換治療の有効性を体外で検証する革新的プラットフォームです。

脊髄損傷における細胞移植を検証するためのプラットフォームとしての長期マウス脊髄器官型スライス培養

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