Name: 頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: 学ぶ頭蓋挙筋長耳骨格筋のin vivoエレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせによる神経筋接合部再生メカニズム。マウスを用いた最小侵襲プロトコルで筋由来タンパク質の役割を評価し、シナプス安定性と再生過程の理解に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>マウス長耳挙筋におけるエレクトロポレーションと神経損傷

<ol><li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of motor nerve terminals.</a> Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).</li>
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<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#5/45 デュモン鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>使用前に滅菌</td></tr><tr><td>アンチ 2H3</td><td>DSHB</td><td></td><td>希釈 1:300</td></tr><tr><td>アンチ S100 すぐに使用できる</td><td>Dako</td><td>IR504</td><td>希釈 1:5</td></tr><tr><td>アンチ SV2</td><td>DSHB</td><td></td><td>希釈 1:50</td></tr><tr><td>グルコン酸クロルヘキシジン 2%</td> <td>DifenPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷光解剖実体顕微鏡</td><td></td><td>Motic モデル SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Dilute 1 : 100</td></tr><tr><td>デュモン #5SF フォーセプス</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp;</td><td>11252-00</td><td>デュ</td></tr><tr><td>モンミニ鉗子を使用する前に滅菌してください。スタイル5</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>11200-14</td><td>使用前に滅菌してください</td></tr><tr><td>ECM830エレクトロポ</td><td>レーターBTXハーバード装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金針型電極&nbsp;</td><td>Genetrodes, BTX</td><td>45-0114</td><td>10 mm ストレート</td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ&nbsp;</td><td>ハミルトン</td><td>80400</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>吸入麻酔器</td><td>SciVerma Scientific</td><td>M3000 テーブルトップ</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>218-082</td><td></td></tr><tr><td>マウス</td><td>Instituto de Salud Publica - チリ</td><td></td><td>成人 (3-6 か月齢) CF-1 マウス、男女ともに (30-45 g)&nbsp;</td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td>Schick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>縫合糸Glicosorb 5/0</td><td>TAGUM</td><td>GS0812。J</td><td>吸収性ポリグリコール酸糸&nbsp;</td></tr><tr><td>tdTomato プラスミド</td><td>Addgene</td><td>54642</td><td>cmv promoter</td></tr><tr><td>Tramadol hydrochloride 5% (Triamcol)</td><td>Drag Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>91500-09</td><td>使用前に滅菌してください</td></tr><tr><td>WGAアレクサフロー488</td>イン<td>ビトゲン</td><td>W7024</td><td>希釈</td></tr><tr><td>&α;-BTXアレクサフロー488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>B13422</td><td>希釈 1 : 500</td></tr></tbody></table>

頭蓋挙筋長耳骨格筋の in vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

tdTomato protein20は蛍光量子収率が高いため、エレクトロポレーション効率に適したトレーサーです。そこで、in vivoエレクトロポレーションによるLAL筋におけるtdTomatoタンパク質の発現を評価しました(図1)。LAL筋は、エレクトロポレーションの21日後に解剖されました。ホールマウント調製は、2つの神経支配領域を持つLAL筋の細い尾側バンド(cLAL、シアン多角形)と、5つの神経支配領域8,10を持つ太い吻側バンド(rLAL、黄色の多角形)を示しています(図1B)。DNA注入部位と電極の位置によると、特にrLAL部分からの筋線維の割合が高いことがtdTomatoの発現に陽性でした(図1B)。横方向のクライオ切片を、手順の効率を評価するために、説明16に従って実施した(図1C)。定量化では、tdTomatoの発現に対する陽性繊維の66.70%±5.95%が示されています(図1D)。次に、筋線維の損傷を評価するために、筋膜をWGAで標識し、核をDAPIで標識し(図1C)、損傷/再生サイクルの兆候として中心核(矢印)の存在を特定しました。コントロール筋とエレクトロポレーションLAL筋の間で、中心核を持つ線維の割合に有意差は見られませんでした(図1E)。
顔面神経の後耳介枝を粉砕すると、LAL筋6が除神経されます(図2A)。対照マウスおよび神経損傷の5日後、10日後、および60日後のマウスからのLAL筋を、前述の方法16,21を用いて解剖し、固定し、染色した。簡単に言えば、SV2抗体はシナプス小胞を標識し、ニューロフィラメントに対する2H3抗体と共に使用され、シナプス前ドメイン6,16,22,23,24全体を明らかにする。S100B抗体はシュワン細胞の染色に使用され、α-BTXはシナプス後AChRsを検出しました。共焦点顕微鏡イメージングでは、神経損傷の5日後に完全なNMJ除神経が示されました(図2B)。シナプス後領域は、神経損傷の10日後に再神経支配されるようです(図2B)。60日後(図2B)、再生されたNMJは対照と同様の表現型を示しました。
最後に、 in vivo エレクトロポレーションと顔面神経クラッシュプロトコルの併用がテストされました。このために、LDAL筋にtdTomatoタンパク質を発現するベクターをエレクトロポレーションし、3日後に神経損傷を行いました。9日後、LAL筋を解剖、固定、染色して、NMJのシナプス前およびシナプス後領域を明らかにしました(図3A)。筋線維におけるtdTomatoタンパク質の発現は、除神経NMJ(緑色の矢印)および再神経支配NMJ(黄色の矢印)とともに観察できます(図3B)。定量化により、繊維の58.37%±4.63%がtdTomatoの発現に陽性であり(図3C、左バー)、シナプス後ドメインの47.00%±10.69%が再神経支配されていることが明らかになりました(図3C、右バー)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig01.jpg"> 図1:LAL筋の効率的なin vivoエレクトロポレーション媒介遺伝子導入。tdTomatoタンパク質をコードするプラスミドを、成体マウスのin vivoエレクトロポレーションによりLAL筋で発現させた。DNA溶液をrLAL筋筋膜の下に注入し、金針型電極を筋肉の上に配置して、1Hz(A)で20msの持続時間で100V/cm2の5パルスを送達しました。ホールマウントされた筋肉をエレクトロポレーションの21日後に解剖し、α-BTX(白色)を使用してAChRについて染色しました。rLAL筋(B)ではtdTomato(赤)を発現するエレクトロポレーション繊維が認められた。rLAL筋を横切開し、WGA(黄色)とDAPI(シアン)(C)で染色して、それぞれ筋肉膜と核を検出しました。この手順の効率は、WGA染色(D)を介して全繊維に占めるtdTomato発現繊維(Cの赤)の割合として定量化されました。中心核(矢印)の割合は、筋線維の損傷/再生(E)のパラメータとして定量化されました。統計は、Nの平均±SEMを表しています:グループあたり3匹の動物(コントロールおよびエレクトロポレーション)。スケールバー = 1 mm (B)、50 μm (C)。ns = 非有意;t 検定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig02.jpg"> 図2:神経挫傷プロトコルを使用した短期NMJ再生。 特定の神経挫傷の場合、顔面神経の後耳介枝(シアン)は、いくつかの解剖学的指標(後耳介静脈、二腹部筋の腹、軟骨性外耳道)を特定することにより、効率的に露出させることができます。対照から得られた、または成体マウスの神経潰の5日後、10日後、および60日後に解剖されたLAL筋NMJの代表的な共焦点顕微鏡画像。NMJは、モーター軸索と終末(シナプス小胞のSV2とニューロフィラメントの2H3;シアン)、シュワン細胞(抗S100 B;黄色)、およびAChRs(α-BTX;マゼンタ)(B)を標識することによって同定されました。下のパネルには、モーター軸索(左パネル)とAChR(右パネル)のチャンネルが別々に表示されています。灰色の形状は、シナプス後領域の位置を区切り、神経支配の状態を評価するために描かれました。スケールバー = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig03.jpg"> 図3: in vivo エレクトロポレーションと神経挫傷のプロトコルの組み合わせ。 LAL筋は、tdTomatoタンパク質(赤)をコードするプラスミドでエレクトロポレーションされました。顔面神経の後耳介枝は、エレクトロポレーションの3日後に粉砕されました。9日後、LAL筋を解剖し(A)、運動軸索と終末(SV2と2H3抗体、シアン)およびAChRs(α-BTX;マゼンタ)(B)を標識することにより、シナプス前およびシナプス後成分を同定した。除神経(緑色の矢印)と再神経支配のNMJ(黄色の矢印)が示されています。tdTomatoタンパク質発現陽性の繊維の割合(左のバー)と、再生された運動軸索が接触するシナプス後ドメインの割合(右のバー)(C)の定量化。結果は、Nの平均±SEMを表しており、グループあたり3匹のマウスです。スケールバー = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...

combined-vivo-electroporation-short-term-reinnervation-cranial

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、挙筋オーリス筋（LAL）若い成体マウスの筋肉にムスカリン性シグナル伝達の阻害剤の反復投与のためとwholemountsにおける神経筋接合部のその後の免疫染色（NMJs）するための手順を説明します。...

皮下ムスカリン拮抗薬の管理およびマウスにおける挙筋オーリスの筋筋のトリプル免疫染色

頭蓋顔面軟骨は他の組織と緊密に連絡を開発し、生きている動物で操作するのが難しいです。我々は、初期胚の影響を迂回しながら顎顔面骨格の成長中に分子ツールを提供するためにエレクトロポレーションを使用しています。このアプローチは、私たちは効率的に候補分子をテストすることができます...

顔面間葉のエレクトロポレーション

嗅神経鞘細胞（たOEC）が、一次嗅覚ニューロンの成長を可能にする神経堤細胞である。この特定のプロパティは、細胞移植のために使用することができる。ここでは喉頭神経損傷モデルでたOECの使用に基づいて細胞移植のモデルを提示。...

末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

咬筋神経をドナー神経として使用することは、顔面神経麻痺における交差神経移植と自由筋移動の基準標準である二段階の手順に代わる一段階の代替手段を表しています。グラシリス筋移植でこの技術を安全に実行するための詳細な説明を提供し、適応症と制限について説明します。...

フリー機能性筋肉転送により不可逆顔面神経麻痺が笑うの単段ダイナミック蘇生

本稿で説明されたプロトコルは、神経筋接合部で自然を記録するマウス挙オーリス長(ラル) 筋とシナプス後電位の神経誘発 (電流クランプ) と電流 (電圧クランプ)...

オーリスの挙筋哺乳類の神経筋伝達電圧クランプ条件下での試験のための準備

人工内耳装用の動物モデルは、電気刺激で永久的な難聴の治療の技術基盤の知識を進めることができます。本研究は、急性耳をつんざくと聴性脳幹反応と機能性の評価と同様に、マウスで電極アレイの人工内耳の手術のプロトコルを示します。...

人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音

エレクトロポレーションは、興味の遺伝子を細胞に提供する効果的なアプローチです。このアプローチは生体内で成体マウス後根神経節 (DRG)...

成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション

このプロトコルは、様々な傷害パターンの記述を含む、ラットモデルにおける顔面神経手術への再現可能なアプローチを記述する。...

軸索抑制と再生を研究するラットモデルにおける顔面神経外科

ここで提示される、呼び起こされた、自発的な筋電図電位のin...

慢性生体内筋電図用埋め込み型システム

体積筋喪失(VML)損傷は内因性再生能力を超え、永続的な機能障害をもたらします。現在のVMLの研究は、主に手足と体幹の筋肉に焦点を当てています。VMLの機構研究を頭蓋顔面筋に拡張するために、この記事では、VML損傷前およびVML損傷後の咬筋機能の縦断的評価のための in vivo...

体積筋損失(VML)損傷の外科的作成後のラット咬筋のin vivo機能評価

学ぶ頭蓋挙筋長耳骨格筋のin vivoエレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせによる神経筋接合部再生メカニズム。マウスを用いた最小侵襲プロトコルで筋由来タンパク質の役割を評価し、シナプス安定性と再生過程の理解に貢献します。

頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ

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