Name: げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学ぶライトシートイメージングを用いたげっ歯類心臓のマイクロ構造解析法。非侵襲的に心筋の細胞レベル構造を可視化し、心臓発生とリモデリングの理解を深める革新的な手法を紹介します。

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動物モデルを惜しみなく共有してくれたUTサウスウェスタンメディカルセンターのエリックオルソン博士のグループに感謝の意を表します。UTダラスのDインキュベーターメンバーから提供されたすべての建設的なコメントに感謝します。この研究は、NIH R00HL148493(Y.D.)、R01HL162635(Y.D.)、およびUTダラスSTARSプログラム(Y.D.)の支援を受けました。

動物実験は、テキサス大学ダラス校の動物管理・使用委員会(IACUC #21-03)の監督下で承認され、実施されています。この研究では、出生後1日目(P1)の新生児と8週齢の成人を含むC57BL6マウスを使用しました。雄と雌の間に差は観察されませんでした。すべてのデータ取得と画像後処理は、研究または教育ライセンスを取得したオープンソースソフトウェアまたはプラットフォームを使用して実行されました。リソースは、合理的な要求に応じて著者から入手できます。
1.サンプル調製と組織透明化(6〜10日)
<ol><li>組織透明化手順を開始する前に、組織透明化方法に必要なすべての化学溶液を材料 表 で調製してください。 注意: 特に有毒化学物質を取り扱う場合は、適切な個人用保護具を着用しながら、ドラフトですべての手順を実行してください。</li>
	<li>動物をCO2 で安楽死させるには、P1や8週間などの所望の時点でCO2 チャンバーに入れて心臓全体を採取し、新たに分離した心臓を室温(RT)で0.2M KClに浸して拡張期16で停止します。</li>
	<li>心臓の解剖学的構造を4°Cで保存するために、ロッカーで一晩穏やかに攪拌しながら、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を浸して心臓を固定します( 表1を参照)。 注意: PFAは有毒な化学物質であり、ドラフトの下で実行する必要があります。</li>
	<li>室温で1x PBSで心臓を30分間、3回洗浄します。 注:オプション:心臓をアガロースゲルに埋め込み、以下に説明するように、ステップ2でカスタムビルドLSMシステム用の心臓アセンブリを作成します。<ol><li>アガロースをPBSに溶解して1%アガロース溶液を調製し、混合物を完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。溶液を型に流し込み、溶液が40°Cに冷えるまで最下層を作ります。</li>
		<li>心臓を型に入れ、固まるまで型にアガロースゲルを充填します。アガロースゲル内の気泡を除去して、イメージングのアーチファクトを最小限に抑えます。 注:サンプルを埋め込むことで、取り付け中に心臓の解剖学的構造が損傷するリスクが軽減されます。 注意:低融点のアガロースを使用し、サンプルを高温にさらすリスクを軽減するために、心臓を加熱されたアガロースに直接置かないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>メタノールと脱イオン水(図1B)を混合したグラジエントを用いて心臓を脱水し、 表1に概説されているように、20%、40%、60%、80%、80%、および100%の連続濃度で処理します。新鮮な100%メタノール1xで繰り返して、完全な脱水を確実にします。新生児マウスの心臓を各メタノール混合物中で1時間、振とうしながら脱水します。8週齢のマウスの心臓とラットの心臓の潜伏時間を2時間に調整します。 注意:メタノールは揮発性で刺激性があり、可燃性の化学物質です。</li>
	<li>心臓を新鮮な100%メタノールと交換し、4°Cで10分間冷やします。</li>
	<li>溶液を交換し、体積比1:5(30%H2O2〜100%メタノール)を使用してメタノール中の5%過酸化水素(H2O2)で心臓を漂白し、4°Cで一晩かけて色素を除去します。 注:顔料を除去することで、光子の吸収を最小限に抑えることができ、アーチファクトを減らして画質を向上させることができます。</li>
	<li>溶液を交換し、100%メタノール中で室温で1時間心臓をインキュベートします。</li>
	<li> </li><li> </li></ol><ol><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li><li></li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq01.jpg" style="margin: auto;"> </li><li></li></ol><ol><li> </li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li></li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li></ol></li><li> </li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li><li><li><li></li></ol><ol><li> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq03.jpg" style="margin: auto;"> </li><li> </li><li></li><li><li> </li><li><li> </li><li></ol>

包括的な心臓イメージングのためのライトシート顕微鏡検査と組織透明化

著者には、開示すべき利益相反はありません。

イメージング、計算、および組織透明化方法の進歩は、心臓の構造と機能を広範囲に調査する比類のない機会を提供しました。これは、無傷のげっ歯類の心臓モデルを使用して、心臓の形態形成と病因の理解を深める大きな可能性を秘めています。同様のアプローチを用いたゼブラフィッシュの心臓のin vivo研究40,41,42,43とは対照的に、高度なLSM技術と組織透明化法の統合により、げっ歯類モデルをイメージングする際の空間分解能と浸透深さの間の課題を克服することができます9,44.組織透明化技術は、脂質やその他の光散乱要素を除去することによって心臓を光学的に透明にし、より深いイメージング浸透を可能にする45。LSMと組み合わせると、心筋を画像化することができます。この組み合わせにより、イメージングの深さが向上し、複雑な心筋の微細構造の観察が可能になります。数多くの清浄法が確立されているが18、iDISCO20は、他の組織清浄法15と比較して、無傷の心臓を迅速に透明化するように適応し、心筋からの自家蛍光のイメージングに容易に利用できるようにした。特異的な蛍光標識では、オリジナルの iDISCO および Adipo-Clear46 プロトコルを、インキュベーション期間が長いにもかかわらず、このカスタマイズされたイメージングシステムで免疫染色と組み合わせることができます。一方、内因性蛍光を保持し、処理時間を短縮する方法が提案研究に好まれます。他の方法とは対照的に、このプラットフォームには次の利点があります。まず、組織透明化に適応したiDISCOプロトコルを利用し、心筋の自家蛍光を維持しながら、1週間未満で心臓を迅速に透明化することができます。第二に、画像スティッチングやマルチビューデコンボリューションなどの計算手法を、この確立された心臓イメージング用のライトシートシステムに組み込みます。最後に、ASLMシステムを設計および同期して、大きなFOV全体で軸方向の分解能を向上させ、ほぼ等方的な分解能で心筋の圧迫と線維柱帯のマルチスケールイメージングと分析を可能にします。
げっ歯類モデルの心臓画像を撮影するために、LSMに基づく4つのアプローチを提供しました:i)スクリーニング目的の従来の方法19、ii)画像スティッチング、iii)マルチビューデコンボリューション、およびiv)ASLMスキャン。モデルによって心臓のサイズが異なることを考慮して、空間分解能、取得速度、FOVの基本的なトレードオフに対処しようとしました。画像スティッチングは、空間分解能を損なう大きなFOVを可能にしますが、マルチビューデコンボリューションまたはASLMと組み合わせることで、拡張FOV全体でほぼ等方的な解像度が得られ、成体マウスの心臓全体をカバーします。さらに、これらの方法の統合により、深部組織の画質とコントラストが向上し、心筋の線維柱帯や心室内の圧迫などの微細構造の3Dモデルの包括的なデジタル再構築が可能になります。しかし、データセットの氾濫、膨大な計算処理コスト、正確な画像レジストレーションの必要性、マルチビューデコンボリューションやイメージングスティッチングにおけるアーティファクトの可能性などが、幅広い用途の妨げとなっています。ASLMは新たな代替手段ですが、システム同期の複雑さ、レーザースキャン戦略、および組織の透明性への依存は、システムの堅牢性に影響を与え、心臓への光損傷のリスクを高める可能性のある課題をもたらします。
LSMイメージングと組織透明化を含むこの方法論は、新生児から成人までの心臓構造を調査するための出発点となります。これは、心臓発生中の特殊な心臓系統とその機能の分布を局在化させる可能性を秘めています47。心臓アプリケーション6,48,49,50,51,52,53に合わせた計算解析の開発により、このフレームワークは、特に心筋梗塞に応答した心臓リモデリングプロセスを調査するために拡張することができます。最終的に、この全体的な戦略は、心臓の形態形成の根底にあるメカニズムを解明し、治療的介入の開発を前進させる可能性を秘めています。

心不全は、主に成熟した心筋細胞の再生能力の欠如により、世界中で依然として主要な死亡原因となっています1。心臓の複雑な構造は、その機能において重要な役割を果たし、発達過程への洞察を提供します。心筋梗塞に対する心臓の形態形成やリモデリングの根本的な過程を解明するためには、心臓の構造を深く理解することが不可欠です。近年の進歩により、新生児マウスは損傷後に心機能を回復できるが、成体マウスにはそのような再生能力がないことが示されている2。これにより、マウスモデルの構造的および機能的異常に関連する手がかりを調査するための基盤が確立されます。共焦点顕微鏡などの従来のイメージング方法には、透過深度の制限、低速な点走査方式、レーザー光への長時間の曝露による光損傷などの技術的な制限があります。これらは、無傷の心臓の包括的な3次元(3D)イメージングを妨げます。これに関連して、ライトシート顕微鏡(LSM)は強力なソリューションとして浮上し、高速イメージング、写真による損傷の低減、および卓越した光学セクショニング機能の利点を提供します3,4,5。LSMのユニークな特徴は、従来の技術の限界を克服するための有望な方法として位置付けられ、心臓の発生とリモデリングプロセスに関する前例のない洞察を提供します6,7,8。
このプロトコルでは、高度なLSMと適応した組織透明化アプローチ9を組み合わせたイメージング戦略を導入し、特定の標識や機械的切片化を必要とせずにマウス心臓全体のイメージングを可能にします。さらに、従来のLSMイメージングは、マルチビューデコンボリューション10または軸方向に掃引されたライトシート顕微鏡(ASLM)技術11,12,13,14,15によって強化され、軸方向の分解能を向上させることができることを提案する。さらに、これらの方法のいずれかと画像スティッチングを統合することで、空間分解能と視野(FOV)のトレードオフを効果的に克服し、成体マウスの心臓のイメージングを進歩させることができます。疎水性、親水性、およびハイドロゲルベースの方法を含む多数の組織透明化アプローチを組み込むことにより、心臓全体の形態を捕捉するためのより深い光透過が可能になります16,17,18,19。
現在のLSMシステムとは複数のクリアリング方法と互換性がありますが、目標は、脂質を屈折率に近い媒体に置き換えることにより、光子散乱を最小限に抑え、心臓などの組織への光の透過性を高めることです。iDISCOは代表20,21として選択され、その迅速な処理と高い透明性により、このプロトコルの自家蛍光イメージングに適合しました(図1A)。全体として、高度なLSMアプローチと組織除去技術の統合は、げっ歯類の心臓の複雑な心臓解剖学的構造を解明するための有望なフレームワークを提供し、心臓の形態形成と病因の理解を深めるための大きな可能性を秘めています。

<table><tbody><tr><td>1% アガロース</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロー</td>ス <td>サーモフィッシャー</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>組織清澄用化学薬品&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118184</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&trade; 332</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31185</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&trade; 736</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31191</td><td></td></tr><tr><td>ジベンジルエーテル (DBE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン(DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ビーズ</td><td>Spherotech</td><td>FP-0556-2</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素(H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216736</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>47392</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79383</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Software and algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2021.2</td><td></td></tr><tr><td>BigStitcher</td><td>H&ouml;rl et al.22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>Schindelin et al.20</td><td>1.54f</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>4.6.1.2</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>2017 SP1</td><td></td></tr><tr><td>カスタマイズライトシートシステムの主要コンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.63 - 6.3倍ズームボディ</td><td>オリンパス</td><td>MVX-ZB10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X 照明対物レンズ</td><td>Nikon</td><td>MRH00105</td><td></td></tr><tr><td>1X 検出対物レンズ</td><td>Olympus</td><td>MV PLAPO 1X/0.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>473nm DPSS</td><td>レーザーLaserglow Technologies</td><td>LRS-0473-PFM-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>532nm DPSS</td><td>レーザーLaserglow Technologies</td><td>LRS-0532-PFM-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>589&thinsp;nm DPSSレーザー</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0589-GFF-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>BNCコネクタ</td><td>National Instrument</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>シリンドリカルレンズ</td><td>Thorlabs</td><td>ACY254-050-A</td><td></td></tr><tr><td>DCモータコントローラ、4軸</td><td>Physik Instrumente</td><td>C-884.4DC</td><td></td></tr><tr><td>ETL</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>ETLケーブル</td><td>Optotune</td><td>CAB-6-300</td><td></td></tr><tr><td>ETLレンズドライバー</td><td>Optotune</td><td>EL-E-4i</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>Chroma</td><td>ET525/30</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>Chroma</td><td>ET585-40</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>Chroma</td><td>ET645-75</td><td></td></tr><tr><td>フィルターホイール&nbsp;</td><td>シャッター計測器</td><td>LAMBDA 10-B</td><td></td></tr><tr><td>電動翻訳ステージ</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.20DG10</td><td></td></tr><tr><td>電動翻訳ステージ</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.40DG10</td><td></td></tr><tr><td>電動翻訳ステージ</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-403.4PD</td><td></td></tr><tr><td>NIマルチファンクションI/O</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>sCMOSカメラ</td><td>浜松</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>ステッピングモーター</td><td>ポロル</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>チューブレンズ</td><td>オリンパス</td><td>MVX-TLU</td><td></td></tr></tbody></table>

げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

ライトシート顕微鏡(LSM)は、心臓の複雑な3次元(3D)構造を理解する上で極めて重要な役割を果たし、基本的な心臓生理学と病理学的反応に関する重要な洞察を提供します。ここでは、マウスモデルにおける心臓のマイクロアーキテクチャを解明するためのLSM技術の開発と実装を掘り下げます。この手法は、カスタマイズされたLSMシステムと組織透明化技術を統合し、体積イメージングのための心臓組織内の光散乱を軽減します。従来のLSMと画像スティッチングおよびマルチビューデコンボリューションアプローチを組み合わせることで、心臓全体をキャプチャできます。軸方向の分解能と視野(FOV)の間の固有のトレードオフに対処するために、焦点の合っていない光を最小限に抑え、伝搬方向全体で心臓を均一に照らす軸方向に掃引ライトシート顕微鏡(ASLM)法をさらに導入します。一方、iDISCOなどの組織透明化法は、光の透過性を高め、深部構造の可視化を容易にし、心臓全体の心筋を包括的に検査することができます。提案されたLSMと組織透明化法の組み合わせは、げっ歯類の心臓の心臓構造を解明する上で研究者にとって有望なプラットフォームを提供し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。

LSMは、明視野および点走査技術6,8,38,39,40のような他の光学イメージング方法とは対照的に、光損傷のリスクが最小限であり、高い空間分解能、および光学切片化により、心臓研究31,32,33,34,35,36,37を促進することが実証されている.したがって、3D心筋アーキテクチャをよりよく理解するために、適応されたiDISCOクリアリング、画像スティッチング、マルチビューデコンボリューション、ASLMなどの主要なアプローチに基づいてプロトコルを確立しました。マウスモデルを用いて結果を提示しましたが、ラットや他のげっ歯類モデルも提案手法に適していることに注意することが重要です。適合した組織透明化プロトコルにより、P1マウスの心臓を4日以内に透明にし、8週齢のマウスの心臓を7日以内に透明にすることができます(図1B)。このステップは、無傷の心臓における光子の吸収と散乱を最小限に抑えるための出発点として機能します。マルチビューデコンボリューションは、複数の視点からの画像を1つのモデルに融合させることで、軸方向の解像度を向上させることができます。同じ心臓の6つのビューから画像を連続的に記録した後、マルチビューデコンボリューション法は、15時間の計算後、横方向4.68μm、軸方向5.06μmのほぼ等方的な解像度を達成します(図8A)。計算の複雑さを軽減するために、ETLベースのASLMをさらにカスタマイズして、新生児から成体のマウス心臓までの画像化を行いました。この方法では、従来のLSM法と比較して、焦点の合っていない背景を最小限に抑え、画像のコントラストを高めて、緊密に集束したレーザービームで心筋をスキャンできます(図8B)。現在のASLM設計では、システムの平均横方向分解能と軸方向分解能はそれぞれ2.18μmと2.88μmを達成し、心室内の心筋線維柱帯の詳細な調査を可能にします。さらに、画像スティッチングは、単独で、またはマルチビューデコンボリューションまたはASLMと組み合わせて、より大きなサンプルサイズにFOVを拡張するために利用することができます。ステッチングとASLMを統合することで、8週齢のマウスの心臓全体を均一な解像度でカバーすることができ(図8C)、心臓全体の断面を調べるための効果的なソリューションが得られます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig01.jpg"> 図1:組織透明化プロセス(A)疎水性法では、組織の脱水、脂質抽出、およびジベンジルエーテル(DBE)を有機溶媒として使用して屈折率マッチングを行います。(B)心臓を4%ホルムアルデヒド(PFA)溶液の混合物に浸し、メタノールと脱イオン(DI)水混合物の勾配で脱水します。4°Cでメタノール中の5%H2O2を使用して心臓を漂白します。 サンプルがチューブの底に沈むまで、ジクロロメタン(DCM)とメタノール溶液で心臓を脱脂します。最後に、目的の屈折率を得るために、DBEで心臓をインキュベートします。グリッド線 5 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig02.jpg"> 図2:軸方向に掃引されたライトシート顕微鏡の概略図(A)カスタマイズされた3Dプリントチャンバー、(B)チャンバーマグネット、(C)クランプホルダー、および(D)ASLMシステム。略語:CL:シリンドリカルレンズ;ETL:電子チューナブルレンズ;IL:照明レンズ;DL:検出レンズ;FW:フィルターホイール;TL:結像レンズ。この図は参考文献16から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig03.jpg"> 図3:画像スティッチングとマルチビューデコンボリューション(A-B)画像スティッチングは、マウスの心臓全体を覆うために使用され、各タイルは隣接するタイルと10%のFOVオーバーラップを持ちます。(C)画像ステッチのためのマウス心臓の動きパターン。(D)ガラス管の端に蛍光ビーズを貼り合わせて画像レジストレーションを容易にし、心臓をDBE入りガラス管の内側に配置することで、マウスの心臓と蛍光ビーズを同時にイメージングすることができます。(E)マルチビューデコンボリューションは、6つの異なる視点から画像を取得し、それぞれが異なる方向から画像を収集します。(F)0°、60°、120°、180°、240°、および300°のさまざまな角度でのP1マウス心臓とビーズの生データ。スケールバー:500μm。この数字は16から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig04.jpg"> 図4:ASLMシステムのブロック図。 DAQカードを使用してETLカメラとsCMOSカメラを同期します。ETLドライバのハウジングは、信号線とアース線をPCBにはんだ付けするために開かれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig05.jpg"> 図5:LabViewコントロールパネル LabVIEWコントロールパネルは、ETLとsCMOSカメラのアクティブ化されたピクセルを同期するトリガを生成します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig06.jpg"> 図6:ライトシートの焦点とアクティブ化されたピクセルの同期(A)ライトシートのスキャン範囲の開始点と終了点の識別は、ETLトリガーに適切な電圧を構成することによって実現されます。(B)蛍光ビーズの同期結果は、画像の対角線に沿って明らかです。(C-F)FOV全体にわたる不均一な空間分解能は、sCMOSカメラを使用したETLの非同期操作から生じます。ETL は、アクティブ化されたピクセルよりも遅い (C) または (D) 早くスキャンを開始します。(E-F)焦点領域が画像の対角線と平行ではなく、スキャン速度と起動速度に互換性がないことを示しています。ETLは、sCMOSのアクティブピクセルのスイープよりも(E)高速または(F)低速でスキャンします。スケールバー:200μmこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig06large.jpg" target="_blank">図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig07.jpg"> 図7:ASLMのトラブルシューティング(A)ライトシートは、検出レンズの焦点距離に正確に配置されます。ETLは、sCMOSセンサーの活性化されたピクセルと同期しながら、伝搬方向に沿ってライトシートの焦点をスキャンします。(B)ETLが正しく整列および同期されている場合の蛍光ビーズのXYビュー。(C-D)焦点面上の蛍光ビーズと断面画像の焦点が合っていない結果、ETLスキャンとレーザー伝搬の間のずれを示しています。スケールバー:挿入図に200μmと10μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig08.jpg"> 図8:マウス心臓のライトシートイメージング(A)心室腔内の小柱帯を強調したマルチビューデコンボリューションP1マウス心臓のボリュームレンダリング画像。(B)従来のLSM(左)とASLM(右)で作製した8週齢マウス心臓の断面画像。画像は生データとして提示されます。(C)8週齢のマウス心臓を画像化するための画像スティッチングとASLMの組み合わせで、水平に3つのタイルと垂直に4つのタイルに配置された12個のタイルを含む。スケールバー:500μm。略語:LV:左心室、LA:左心房、RV:右心室、RA:右心房。この図は参考文献16から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">プロシージャ</td>
			<td>時間(P1マウス心臓)</td>
			<td>時間(8週齢のマウスの心臓)</td>
			<td>温度</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">4%PFAで固定</td>
			<td>一夜</td>
			<td>一夜</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="5">サンプル調製</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1x PBSで洗浄</td>
			<td>30分</td>
			<td>30分</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1x PBSで洗浄</td>
			<td>30分</td>
			<td>30分</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">1x PBSで洗浄</td>
			<td>30分</td>
			<td>30分</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">アガロースゲルを埋め込む</td>
			<td>1時間</td>
			<td>2時間</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20%メタノール/80%脱イオン水でインキュベートします。</td>
			<td>1時間</td>
			<td>2時間</td>
			<td>RT</td>
			<td rowspan="6">脱水</td>
		</tr><tr><td colspan="3">40%メタノール/60%脱イオン水でインキュベートします。</td>
			<td>1時間</td>
			<td>2時間</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">60%メタノール/40%脱イオン水でインキュベートします。</td>
			<td>1時間</td>
			<td>2時間</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">80%メタノール/20%脱イオン水でインキュベートします</td>
			<td>1時間</td>
			<td>2時間</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">100%メタノール中でインキュベート</td>
			<td>1時間</td>
			<td>2時間</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">新鮮な100%メタノールでインキュベートします</td>
			<td>1時間</td>
			<td>2時間</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">新鮮な100%メタノールでインキュベートします</td>
			<td>10分</td>
			<td>10分</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="3">色素脱失</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5%H2O2/メタノールを含む漂白剤</td>
			<td>一夜</td>
			<td>一夜</td>
			<td>4°C</td>
		</tr><tr><td colspan="3">100%メタノール中でインキュベート</td>
			<td>1時間</td>
			<td>1時間</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

このプロトコルは、高度なライトシート顕微鏡法と適応した組織透明化法を利用して、げっ歯類の心臓の複雑な心臓構造を調査し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

私たちの研究は、ライトシートイメージングシステムをカスタマイズして、無傷のげっ歯類の心臓の心筋構造を細胞レベルで調べることを目的としています。私たちは、新生児から成虫のげっ歯類の心臓まで、ミクロンレベルで等方性の分解能を持つ無傷の心筋を探索するワークフローを開発しました。私たちの研究は、無傷の心室内の小柱などの複雑な心筋の微細構造を高い空間分解能で調査する際のギャップを埋めます。このイメージング戦略は、物理的なスライスなしで微細構造を評価するためのエントリポイントを提供し、心臓の発達とリモデリングの理解を深めることにつながります。心臓損傷やリモデリングに応答した心筋の構造変化を探ることに集中します。

light-sheet-imaging-to-reveal-cardiac-structure-in-rodent-hearts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この記事では、電位差色素（ジ- 8 -...

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

ここでは、成体マウスからの生存心室スライスの調製および鋭い電極活動電位記録のためのそれらの使用を記載する。これらの多細胞調製物は、 インビボでの電気生理学的および薬理学的研究のための貴重なモデルとなる組織構造のような保存されたインビボを提供する。...

電気生理学的研究のためのマウス短軸心室スライス

この研究は、マウスの心を研究するのに光クリアと組み合わせて両面イルミネーション ライト シート蛍光顕微鏡 (LSFM)...

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

光シート蛍光顕微鏡で 生体内...

ゼブラフィッシュ胚における高速心臓ダイナミクスの光シート顕微鏡

我々は、組織形質転換と染色の新たな進歩と軸走査型ライトシート顕微鏡の開発を組み合わせることにより、マウス心臓全体のメゾスコピック再構成法を報告する。...

マウス心臓全体のメゾスコピック光学イメージング

ここでは、小動物を対象とした高解像度陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法を用いて心機能と形態を定量化するための実験的イメージングプロトコルを紹介します。マウスとラットの両方を検討し、2つの種に対するコンピューター断層撮影造影剤の異なる要件について議論します。...

小動物用高分解能心臓陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影

このプロトコルはゼブラフィッシュの幼虫の心臓収縮機能を調査し、細胞追跡および相互分析によって心臓力学に洞察を得るのにライトシートイメージ投射を利用する。...

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

光学分解能光音響顕微鏡（OR -...

三次元光学分解能光音響顕微鏡

この原稿は、表面マーカー発現と細胞選別を使用して、定義された人工心臓組織の作成について説明しています。次に、定義された組織をマルチティッシュバイオリアクターで使用して、心臓細胞療法のメカニズムを調査し、機能的でありながら制御されたヒト心臓のモデルシステムを提供できます。...

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

この方法は、実験的に誘発された心筋虚血のマウスにおいて、心臓の形態、機能、灌流、代謝、および生存率を評価するための量子マイクロコンピュータ断層撮影法(MicroCT)の使用を概説しています。この技術は、ヒト心臓病のさまざまな動物モデルの非破壊ハイスループット縦断的in...

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

学ぶライトシートイメージングを用いたげっ歯類心臓のマイクロ構造解析法。非侵襲的に心筋の細胞レベル構造を可視化し、心臓発生とリモデリングの理解を深める革新的な手法を紹介します。

げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング

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