Name: がん免疫サイクルを再現するためのin vitro共培養システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶがん免疫サイクルのin vitro共培養システムによるモニタリングと解析手法。マルチパラメトリックフローサイトメトリーと腫瘍オンチップモデルを用いて、がん細胞と免疫細胞の相互作用を簡便かつ信頼性高く評価し、免疫監視と免疫回避のメカニズム解明に貢献します。

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フローサイトメトリーによるがん免疫サイクルのモニタリング 

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-immunity+cycle%3A+Indication%2C+genotype%2C+and+immunotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.</a> Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).</li>
<li>Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+privilege+of+cancer+stem+cells%3A+A+key+to+understanding+tumor+immune+escape+and+therapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure.</a> Cells. 10 (9), 2361(2021).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Es+of+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The three Es of cancer immunoediting.</a> Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).</li>
<li>Musella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+promote+cancer+cell+stemness+by+triggering+the+epigenetic+regulator+KDM1B%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B.</a> Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+immune+resistance+archetypes+in+solid+cancer+to+inform+next-generation+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (6), e006533(2023).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+cancer+cell+immunogenicity+and+antigen-specific+T-cell+cytotoxicity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Front Mol Biosci. 7, 612801(2020).</li>
<li>Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+automated+cytometry+in+the+new+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy.</a> Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).</li>
<li>Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+cytometry+practices+for+immuno-oncology%3A+A+multifaceted+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge.</a> Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).</li>
<li>Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> JoVE. (170), e61895(2021).</li>
<li>Mattei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoimmunology+meets+organs-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oncoimmunology meets organs-on-chip.</a> Front Mol Biosci. 8, 627454(2021).</li>
<li>Businaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+cancer+and+immune+cells%3A+exploring+complex+dynamics+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).</li>
<li>Vacchelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+antitumor+immunity+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1.</a> Science. 350 (6263), 972-978 (2015).</li>
<li>Maulana, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+cancer-on-chip+models+to+assess+immuno-oncology+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).</li>
<li>Lorenzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+control+antigen+retention+and+survival+of+CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+after+uptake+of+tumor+apoptotic+cells+leading+to+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.</a> J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).</li>
<li>Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+assessment+of+dendritic+cell-mediated+uptake+of+cancer+cell+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies.</a> Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).</li>
<li>Lucarini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Type+I+Interferons+and+5-Aza-2%27-Deoxycitidine+to+improve+antitumor+response+against+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).</li>
<li>Gutiérrez-Martínez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+cell-associated+antigens+by+MHC+Class+I+in+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets.</a> Front Immunol. 6, 363(2015).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+spatial+omics+in+dissecting+tumour+microenvironment+and+the+role+of+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI.</a> Front Oncol. 13, 1172314(2023).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics%3A+Navigating+to+the+golden+era+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research.</a> Clin Transl Med. 12 (1), 696(2022).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).</li>
<li>Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+flow+cytometry+automated+data+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Current trends in flow cytometry automated data analysis software.</a> Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
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著者には、開示すべき利益相反はありません。

抗がん免疫応答のモニタリングは、TMEで作用し、覇権をめぐる絶え間ない戦いを支える複雑な分子的および細胞的相互作用を解明し理解するために最も重要である23。ここでは、がん免疫サイクルを構成するステップのモニタリングと特性評価のための簡単なmFCおよびToC支援プロトコルについて詳しく説明します。マウス細胞株とマウス由来免疫細胞をベースにしたこのプロトコルは、わずかなバリエーションで、ヒトの不死化がん株や初代がん株、さらにはヒト末梢血由来免疫細胞の両方に適応させることができます。さらに、特定の経路の遺伝的または薬理学的阻害とそれらの同族に適した制御を組み合わせることで、このプロトコルは免疫サーベイランスを調節するバイオマーカーの同定を可能にし、したがって、免疫原性および免疫療法に対する応答を可能にします。
mFCは、多様な免疫パラメータのハイスループット解析を可能にし、短時間で数百万の細胞を解析する能力と、希少なイベントの特定、細胞増殖および細胞死の評価、少量のサンプル中の複数のパラメータの同時検出、および蛍光ベースの細胞ソーティング後の下流の分子および機能解析の実行を可能にします9.これらの機能は、低コストと相まって、mFCのアクセシビリティと研究および臨床検査室での幅広い使用を支持されています。それにもかかわらず、いくつかの重要な制限が残っています。まず、mFC解析では、サンプル調製中に単一細胞懸濁液を得るために組織解離が必要であり、したがって腫瘍組織の空間情報を破壊します。過去10年間のハイプレックス空間トランスクリプトーム、プロテオミクス、エピゲノムなどの空間技術の出現により、がん細胞、免疫細胞、間質細胞の位置とそれらの相互作用を分析することにより、TMEをプロファイリングする能力が拡大した24。次に、mFCは一度に最大16(または約)のパラメータを検出できるため、1つのサンプルですべての細胞同定、成熟、および活性化ステータスマーカーを網羅しているわけではありません。繰り返しになりますが、上記の最先端技術により、25,26,27以前のように、シングルセルおよび細胞内分解能で最大100のパラメータを同時に検出できます。第三に、縦断的および比較的研究の免疫モニタリングには、再現性のあるプロトコルと、データ取得や分析を含むワークフローのすべてのステップの標準化が必要です。従来の手動ゲーティングは主観的なものであり、機器のメンテナンスや品質チェックは異なる場合があり、データのマイニングと解釈に影響を与えます。データ解析を実装する自動集録とプラグインは、データのばらつきを最小限に抑えるのに役立ちます28。
ToCは、TMEのいくつかの特徴を密接に再現し、少なくとも一部の実験環境ではin vivo 腫瘍12を置き換える能力により、がん研究において大きな注目を集めています。ToCは、腫瘍-組織構造、多細胞の複雑さ、およびTMEの細胞構成要素間の動的相互作用の非常に現実的なモデルを提供する一方で、全身性免疫応答の複雑さ、特にがん免疫サイクルの各ステップの律速ステップの出現に関与する一連のメカニズムを反映するという点で、動物研究を完全に置き換えることはできません12。29.この側面を超えて、腫瘍免疫学の分野は、ラウンドと科学的革新の速度がそれらを ますますin vivo モデル12に近づけているため、ToCの使用から利益を得て利益を得るでしょう。
結論として、ここで説明するプロトコルは、TMEのダイナミックな複雑さを解明するための強力でシンプルな分析および発見ツールとして機能します。また、このプロトコルの時間とコストに関連する特性により、大規模での実現可能性が可能になります。今後の課題は、がん患者の治療決定をより適切に通知し、導くために、臨床使用のために標準化することです。

過去数十年にわたり、免疫療法はがん治療の最先端の選択肢の最前線に立ってきました。免疫系を抗腫瘍目的で利用することで、歴史的に予後が不良な多様な血液学的および固形悪性腫瘍に対する患者の利益のための強力な概念実証が提供されました。免疫療法は、他の方法では治療が困難ながんに機会を提供しているため、驚くほど速いペースで進歩しています。このような進歩は、少なくとも部分的には、がん細胞と免疫細胞の相互作用についての高度な理解に起因する可能性があります。この相互作用は、免疫系ががん細胞を破壊するために発火するフィードフォワードの「エンジン」、いわゆるがん免疫サイクルに似ています。この抗がん免疫応答は、認識、処理、反応の3つの主要なレベルで進行します。まず、認識の段階では、腫瘍形成中に産生された腫瘍抗原(Ag)は、腫瘍微小環境(TME、ステップ1)で死にかけているがん細胞から放出され(TME、ステップ1)、腫瘍浸潤樹状細胞(DC、ステップ2)に飲み込まれます。次に、プロセシングの段階では、DCは、捕捉された腫瘍Agsのエピトープを主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子を介して提示し、その表面で高レベルの共刺激分子を発現し(ステップ3)、腫瘍排出リンパ節(dLN)に移動して、そのカーゴをナイーブCD8T細胞に交差提示します(CD8N、ステップ4)。これらすべてのステップは、腫瘍Ag特異的クロスプライミングCD8 T細胞(CD8C-P)が活性化され、エフェクターCD8 T(CD8E)細胞に成熟し、クローン増殖を受ける反応の最終プロセスに収束します(ステップ5)。その後、CD8E細胞はdLNを離れ、血液を介してTMEに帰宅し(ステップ6)、そこでT細胞受容体(TCR)と同族の腫瘍Agとの間の相互作用を通じてがん細胞を特異的に認識して結合し、細胞傷害性分子[すなわち、インターフェロン(IFN)-γ、パーフォリン、グランザイム(Grzs)]を放出し、がん細胞を殺します(ステップ7)1、2.がん細胞の死滅は、がん免疫サイクルを促進するためのさらなる腫瘍Agsの放出につながります。実際のところ、これらすべてのステップを通じて、免疫系は想定よりもはるかに頻繁にがん細胞を破壊し、拒絶します。しかし、がん患者では、これらのステップの少なくとも1つは適切に機能しません。我々と他の研究者は、がん細胞がより攻撃的で免疫特権的な変異体3,4,5に進化するか、T細胞の有効性6,7を妨げることによって、免疫応答を失速させようとしていることを示した。
がん研究とがん治療薬の開発はどちらも、がんと免疫細胞との関係を研究するための実験モデル、いわゆるがん免疫学に依存しています。ここでは、腫瘍免疫学サイクルの各ステップを包括的に再現し、免疫サーベイランス、そして最終的には免疫編集の表現型および機能的特徴セットを迅速かつ明確に把握できる、迅速で信頼性が高く、再現性があり、低コストの in vitro モデルについて説明します。
マルチパラメトリックフローサイトメトリー(mFC)は、がんの基礎研究、診断、およびがん臨床試験におけるトランスレーショナルリサーチにおいて、最も成功したシングルセル解析ツールの1つです。mFCは、各細胞のより多くの特徴を同時に捕捉できるため、腫瘍免疫学におけるゴールドスタンダード分析プラットフォームとしての地位を確立しています。高い感度と特異性を兼ね備えており、TME 8,9,10のような不均一な細胞懸濁液や異型細胞懸濁液から、単一細胞レベルで複数のタンパク質発現パターンと機能特性を迅速かつ再現性よく測定することができます。表現型と機能的発現パターンはどちらも時間に敏感であるため、実験デザイン、適切なパネル、コントロール、滴定抗体の選択、および適切なサンプル処理と装置の使用に細心の注意を払うことは、結果の信頼性、比較可能性、再現性、および実験結果を自信を持って解釈するために重要です11。
Tumor-on-a-chip Microfluidic Devices(ToC)は、がんと免疫細胞のダイナミクスと相互作用のin vitroマイクロスケールの生体模倣を可能にすることにより、TMEをモデル化します12,13,14,15。具体的には、ToCは、2次元(2D)または3次元(3D)培養設定で組織化された多様な細胞タイプをホストできるマルチチャネルマイクロ流体細胞培養デバイスであり、高い忠実度でモデル化し、TME12で生理学的に発生する異型細胞相互作用や化学勾配の流れなどの主要な構造的および機能単位を高精度で制御することができます。13、14、15。特に、免疫の化学引力と軌跡、ならびに免疫細胞とがん細胞との相互作用は、リアルタイムでモニタリングし、タイムラプス顕微鏡および自動追跡分析5,12,13,14,15,16によって定量化することができる。さらに、ToCは、がんの発症と進行、および治療への反応を調節する重要なプロセスを分析および操作する可能性を提供します17。
この記事では、mFCとToCを組み合わせて、がんAgsのDC媒介性食作用(ステップ1〜3)、T細胞クロスプライミング(ステップ4)、活性化およびクローン増殖(最後は5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびCu(I)触媒による環化付加[クリック]技術、高感度で正確な方法論による抗がん免疫応答のすべてのレベルを研究します。 ステップ5)、CD8E 細胞のTMEへのホーミング(ステップ6)、最後にCD8E細胞を介したがん細胞の死滅(ステップ7、 図1)。
この研究は、がん免疫サイクルを研究するためのシンプルで迅速、かつ信頼性の高い標準プロトコルを確立するための取り組みに貢献しています。mFCモデルとToCモデルの改善と統合は、これらのモデルが生物学的忠実度と実験的制御を提供するため、がん研究、TMEダイナミクス、および治療への反応に大きな可能性を秘めています。したがって、このプロトコルは、個々の細胞プレーヤーの役割と自然免疫および獲得免疫サーベイランスに対するそれらの相互相互作用を特徴付け、監視し、タイムリーに操作することを可能にすることにより、癌免疫サイクルを段階的に再現するのに役立ちます。これにより、最終的には動物実験の改良、削減、置き換えに役立ち、腫瘍を出し抜き、臨床ケアを導くための重要な洞察を得ることができます。最後に、mFCとToCの利点と限界について批判的に議論し、最先端の技術(シングルセルでの高プレックス空間解析や細胞内分解能など)と比較することで、腫瘍免疫学の研究と治療を前進させます。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLマイクロチューブ&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>100kV電子ビームリソ</td><td>グラフィーVistec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mmシャーレ&nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>ユーロクロン</td><td>&nbsp;ET3012</td><td></td></tr><tr><td>15 mL & 50 mL チューブ</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>352096; 352070</td><td></td></tr><tr><td>40 &MU;mセルストレーナー&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431750</tr><tr><td>5 mLポリスチレンチューブ&nbsp;</td><td>グライナー バイオワン</td><td>120180</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;mセルストレーナー&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431751</tr><tr><td>75 cm2細胞培養処理フラスコ</td><td>ユーロクロン</td><td>&nbsp;ET7076</td><td></td></tr><tr><td>吸着剤ワイプアルミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホイ</td><td></td><td></td><td></td></tr>ル<tr><td>抗マウスCD107a(LAMP-1)抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-319</td><td></td></tr>抗<tr><td>マウスCD25(7D4)抗体&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-678</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD3 (17A2) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiPlug Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555029</tr><tr><td>BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>US Biological, Salem</td><td>A1312</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Monoclonal Antibody (N418)</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)</td><td>eBioscience</td><td>17-1371-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3モノクローナル抗体 (17A2)</td><td>eBioscience</td><td>25-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 モノクローナル抗体 (IM7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>CD45 モノクローナル抗体 (30-F11)</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4528</td><td></td></tr><tr><td>CD69 モノクローナル抗体 (H1.2F3)</td><td>eBioscience</td><td>48-0691-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a モノクローナル抗体 (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a モノクローナル抗体 (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD95 (APO-1/FAS) モノクローナル抗体 (15A7)</td><td>eBioscience</td><td>53-0951-82</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting slides</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td></td></tr><tr><td>Chromium quartz masks</td><td>MB W&A, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 フローサイトメトリーアッセイキット</td><td>Invitrogen</td><td>C10635</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX フローサイトメーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デッドセル除去キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4053L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal wevine serum (FBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Flowjo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granzyme B Monoclonal Antibody (NGZB)</td><td>eBioscience</td><td>12-8898-82</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hotplate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humified cell culture incubator (37&deg;, 5% CO2)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice machine</td><td>Brema Ice Makers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>11-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2015 査読有 原著論文 研究論文(学術雑誌</td>)<td>アドビシステムズ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画像J</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte 2022A ソフトウェア</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Cytotox Dye for Counting Dead Cells</td><td>Sartorius</td><td>4632</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System&nbsp;</td><td>ザルトリウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JuLiスマート蛍光ライブセルイメージング顕微鏡</td>ブル<td>ドッグバイオ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラボラトリーベンチ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラボラトリー冷蔵庫(4°C;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラボ用安全キャビネット(クラスII)</td><td>Angelantoni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>MACS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201;〒130-042-401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACSセパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-10; 130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MCA205マウス線維肉腫細胞株</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC173</td><td></td></tr><tr><td>クラスII安全キャビン</td><td></td><td></td><td></td>を装備した微生物学的に制御された動物施設</tr><tr><td>MicroCL 21R 微量遠心機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002552</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>マイクロソフト、レドモンド&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス:C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, マウス</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-543</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT</td><td>ニコンインスツルメンツ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学リソグラフィー</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン G ナトリウム塩とストレプトマイシン硫酸塩</td><td>EuroClone ECB3001D</td><td>/1</td><td></td></tr><tr><td>ピペット補助</td>剤 <td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>&nbsp;4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PKH67蛍光細胞リンカーキット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH67GL-1KT</td><td>蛍光細胞リンカー&nbsp; キット</td></tr><tr><td>プラスチックカバースリップ</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Thermo Scientific</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>反応性イオンエッチングシステム</td><td>オックスフォードプラズマ研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロズウェルパークメモリアルインスティテュート1640(RPMI 1640)</td><td>ユーロクローン</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット(2 mL、5 mL、10 mL、25 mL)</td><td>コーニング-ミリポアシグマ;セントルイス、 </td><td>MO CLS4486;CLS4487;CLS4488;</td><td></td>CLS4489</tr><tr><td>SL 16 遠心分離機シリーズ</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004031</td><td></td></tr><tr><td>滅菌メス、外科用鉗子、はさみ、ペンチ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌チップ (1&ndash;10 &mu;L、20&ndash;200 &mu;L、1000 &mu;L)</td><td>EuroClone Spa、ミラノ、イタリア</td><td>ECTD00010;ECTD00020;ECTD00200;</td><td></td>ECTD01005</tr><tr><td>SU-8 3000シリーズ</td><td>MicroChem社、ニュートン、(MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真皮生検パンチカイ</td><td>メディカル、Tedpella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dowsil、ダウコーニング</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>TCRベータモノクローナル抗体(H57-597)</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-82</td><td></td></tr>サー<tr><td>モスタットバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タイマ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMCS&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン (0.4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA w/ フェノールレッド</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920</td><td></td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

がん免疫サイクルを再現するためのin vitro共培養システム

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

がんの基礎研究と効果的な反撃療法の開発は、どちらもがんと免疫細胞との相互作用、いわゆるがん免疫サイクルを詳述した実験的研究に依存しています。マルチパラメトリックフローサイトメトリー(mFC)およびTumor-on-a-chipマイクロ流体デバイス(ToC)と組み合わせた in vitro 共培養システムにより、がん免疫サイクルの各ステップの簡単、迅速、かつ信頼性の高いモニタリングと特性評価が可能になり、がん免疫サーベイランスと免疫回避のバランスを崩すメカニズムの特定につながります。がんと免疫細胞の間のダイナミックな相互作用を完全に理解することで、腫瘍を出し抜くための重要な洞察が得られ、患者の治療の個別化と最適化のペースが加速します。具体的には、ここでは、マウスがん細胞株およびマウス由来免疫細胞におけるがん免疫サイクルの各ステップのダイナミックな複雑さを解明し、免疫サーベイランスに焦点を当てるための、mFCおよびToCを用いた簡単なプロトコールについて詳しく説明します。このプロトコルの時間とコストに関連する特性を考慮すると、大規模に実現可能であることは確かです。さらに、わずかなバリエーションで、このプロトコルは、ヒト癌細胞株およびヒト末梢血由来免疫細胞に適合させることができ、免疫応答のバイオマーカーを特定するために、特定の経路の遺伝的および/または薬理学的阻害と組み合わせることができます。

CD11c+ DCsは、交差提示21,22に特化し、図2Aに示すようにゲート化された広く知られている食細胞サブセットであり、以前にPKH67蛍光細胞リンカーで標識されたUV照射MCA205癌細胞からのアポトーシス体を飲み込む能力をmFCによって評価した。予想通り、CD11c+ DCは、37°Cではin vitroでアポトーシスMCA205細胞を効率的に捕捉しましたが、4°Cでは捕捉しませんでした(図2B、がん免疫サイクルのステップ1〜3)。腫瘍Ag取り込み後のDC成熟をさらに特徴付けるために、貪食前および食作用後のDCで共刺激および免疫チェックポイントリガンド分子の表面発現をチェックし、比較しました(それぞれDCNおよびDCPHAGO)。DCPHAGO細胞は、CD86およびMHC-IIのレベルが有意に増加し、PDL1のレベルが低下しました(図2C、がん免疫サイクルのステップ4)。さらに、DCPHAGO(CD8C-P)によってクロスプライミングされたCD8 T細胞のクローン増殖は、EdUチミジン類似体の取り込みを評価することによって評価されました(がん免疫サイクルのステップ5)。生きたCD3+CD8+ T細胞(図3A)を適切にゲーティングすることにより、CD95分子を発現し、腫瘍Ag特異的TCRを持つクローンを表すCD8C-Pの~20%(補足図1)が、ナイーブなCD8 T細胞(CD8N、図3B)と比較して増殖することがわかりました。ToCモデル(図3C)を用いて、がん細胞が放出するアラーミンによる化学引力を感知し反応するCD8C-Pの能力を評価し、腫瘍特異的なCD8 T細胞がTMEにホーミングすることを反映しました(がん免疫サイクルのステップ6)。具体的には、ToCを使用して、免疫室から腫瘍室に移動する非接着性免疫細胞と腫瘍室に静止している付着がん細胞との間の化学的および物理的引力と相互作用を可能にし、追跡するために使用されました。共培養後の異なる時点で撮影された顕微鏡写真では、マイクロチャネルを横切ることにより、CD8C-Pががん細胞に向かって進行的に移動することが示されました(図3C)。興味深いのは、接近する免疫細胞が24時間、48時間、および72時間で癌細胞と安定的かつ効率的に相互作用できることでした(図3D)。最後に、TMEにホームし、がん提示のAgs(CD8E)によって再刺激されたCD8C-Pの応答を、mFCを通じて、初期CD69(補足図2A)および後期CD44、CD25(図4A)活性化マーカーの表面発現レベル、ならびにCD137(図4B)およびCD107a(補足図2B)の膜発現をCD8NおよびCD8 C-Pと比較して評価することにより分析しました (がん免疫サイクルのステップ7)。また、細胞傷害性分子Grz-B(図5A)およびIFN-γ(図5B)の細胞内産生も評価しました。興味深いことに、これらすべてのマーカーレベルは漸進的かつ有意に増加し、共培養の72時間で発現の選択に達し、したがって、遅延した効果的な活性化を反映しています。したがって、同族の共培養MCA205細胞は、生細胞解析システムおよびmFC解析によって明らかにされたように、有意なレベルのCD8E媒介死を受けました(図6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig01.jpg"> 図1:がん免疫サイクルを研究するための実験プロトコルの概要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig02.jpg"> 図2:DC媒介性がん細胞Agの取り込みと提示(A)DC mFC解析のゲーティング戦略。mFCの取得およびデータ解析中に、サンプルを逐次ゲート化しました(1)FSC-AおよびSSC-Aをプロットすることにより、形態について。(2)FSC-AおよびFSC-Hをプロットすることによるシングレットの場合。(3)近赤外およびSSC-Aをプロットすることにより生存率について。(B)37°Cおよび4°CでPKH67標識UV照射MCA205がん細胞からのアポトーシス体を飲み込むCD11c+ DCの能力のmFC解析(がん免疫サイクルのステップ1〜3)。代表的なバイパラメトリックプロットと、CD11c + PKH67 +細胞の割合を示すヒストグラム(個々のデータポイントでの平均± s.e.m.、3つのうち1つの代表的な実験が示されています)。(C)食作用前および食作用後のDC上の共刺激性および免疫チェックポイントリガンド表面分子のmFC分析(それぞれDCNおよびDCPHAGO;癌免疫サイクルのステップ4)。ヒストグラムは、CD11c+CD86+、CD11c+MHC-II+、CD11c+PDL1+細胞の割合(平均± s.e.m.および個々のデータポイント、n = 3つの独立した実験)を表しています。(B) 対応のない両側スチューデントのt検定とウェルチの補正を4°Cと比較した結果 (C) 対応のない両側スチューデントのt検定とDCNを比較した図を<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig02large.jpg" target="_blank">大きく表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig03.jpg"> 図3:クロスプライミング後のCD8 T細胞の増殖とがん細胞への輸送。 (A)CD3+CD8+ T細胞解析のためのゲーティング戦略。mFCの取得およびデータ解析中に、サンプルを逐次ゲート化しました(1)FSC-AおよびSSC-Aをプロットすることにより、形態について。(2)FSC-AおよびFSC-Hをプロットすることによるシングレットの場合。(3)AquaとSSC-Aをプロットすることによる生存率。最終的に、生細胞の特異的増殖EdU染色について分析しました。(B)EdU技術によるCD8 T細胞のクローン増殖のmFC分析(がん免疫サイクルのステップ5)。モノパラメトリックヒストグラムは、増殖するEdU+ナイーブCD8T細胞およびクロスプライミングCD8 T細胞(それぞれCD8NおよびCD8C-P)の割合(個々のデータポイントで平均± s.e.m.、3つのうちの1つの代表的な実験が示されています)を表します。(C,D)TMEへのホーミングCD8 T細胞のToCマイクロ流体モデル(がん免疫サイクルのステップ6)。(C)ToCの概略的面積測定。免疫細胞とがん細胞を収容する2つの横方向の培養室は、ミクロンサイズのチャンネル(幅=12μm、長さ=10μm、高さ=10μm)で接続されています。細胞培養コンパートメントは、幅1 mm、長さ8 mm、高さ100 μmです。タイムラプス記録中に生成された顕微鏡写真は、異なる時点(0〜72時間、スケールバー、100μm)でのCD8C-Pのがん細胞への移動を表しています。(D)24〜72時間以内の標的がん細胞(黒点)に向かう個々のCD8C-P(n = 100細胞/条件)の軌跡を表すプロットが示されています(スケールバー、10μm)。(A) Welchの補正を用いた不対応の両側スチューデントのt検定とCD8Nの比較。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig04.jpg"> 図4:生きたがん細胞による再刺激後のCD8 T細胞腫瘍反応性(A)がん提示Ags(CD8E)によって再刺激されたCD8 T細胞上のCD44、CD25活性化マーカーの表面発現レベルのmFC分析(がん免疫サイクルのステップ7)最大72時間。代表的なバイパラメトリックプロットと、48時間および72時間でのCD8N、CD8C-P、CD8EのCD44+CD25+ CD8 T細胞の割合を示すヒストグラム(平均± s.e.m.および個々のデータポイント、n = 3つの独立した実験)。(B)CD8E上の腫瘍反応性マーカーCD137の膜発現のmFC分析。代表的なバイパラメトリックプロットと、48時間および72時間でのCD8N、CD8C-P、CD8EにおけるCD137+ CD8 T細胞の割合を示すヒストグラム(平均± s.e.m.および個々のデータポイント、3つのうちの1つの代表的な実験が示されています)。(A,B)通常の一元配置ANOVA検定とそれに続くBonferroniの補正をCD8Nと比較。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig05.jpg"> 図5:CD8 T細胞によるGrz-Bの産生とIFN-γ (A)CD8E上のGrz-Bの細胞内発現レベルのmFC解析(がん免疫サイクルのステップ7)。48時間および72時間でのCD8N、CD8C-P、CD8EのGrz-B+ CD8 T細胞MFIを示す代表的なヒストグラムプロット(平均± s.e.m.および個々のデータポイント、n = 3つの独立した実験)。(B)CD8E上の細胞内IFN-γのmFC解析。48時間および72時間におけるCD8N、CD8C-P、CD8EにおけるIFN-γ+ CD8 T細胞の割合を示す代表的なヒストグラムプロット(平均± s.e.m.および個々のデータポイント、n = 3つの独立した実験)。(A、B)です。通常の一元配置ANOVA検定とそれに続くBonferroniの補正をCD8Nと比較。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig06.jpg"> 図6:CD8 T細胞媒介性腫瘍死((A)共培養の72時間後(がん免疫サイクルのステップ7)後のCD8Eによって駆動されるCD45細胞死のmFC解析。ヒストグラムは、死にかけているPI+CD45−細胞の割合(平均± s.e.m.および個々のデータポイント、n = 3つの独立した実験)を表しています。(B)CD8Eを介したがん細胞死の生細胞解析。代表的な写真と、死にかけているがん細胞と死んだがん細胞によるCytotox Redの取り込みを示すプロット(3つのうち1つの代表的な実験が示されています)。(A)対応のない両側スチューデントのt検定とがん細胞単独(CTR)の比較。(B) 両側マン・ホイットニー検定とCTRの比較。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:ヒストグラムプロットは、CD95+TCR-β+ CD8N およびCD8C-PのMFIを表しています。対応のない両側スチューデント のt検定とCD8Nの比較 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%201_revised.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:CD8 T細胞の活性化。(A)CD8E上の初期CD69活性化マーカーの表面発現レベルのmFC解析(がん免疫サイクルのステップ7)。代表的なバイパラメトリックプロットと、48時間および72時間でのCD8N、CD8C-P、CD8EのCD69+ CD8 T細胞の割合を示すヒストグラム(平均± s.e.m.および個々のデータポイント、3つの実験のうち1つ)。(B)CD8E上のCD107aリソソーム関連タンパク質の膜発現のmFC分析。代表的なバイパラメトリックプロットと、48時間および72時間でのCD8N、CD8C-P、CD8EにおけるCD107a + CD8 T細胞の割合を示すヒストグラム(平均± s.e.m.および個々のデータポイント、3つのうちの1つの代表的な実験が示されています)。(A、B)です。通常の一元配置ANOVA検定とそれに続くBonferroniの補正をCD8Nと比較。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%202_revised%20.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:抗体の混合物ステップ3.3.2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、がん免疫サイクルを構成するステップをモニターし、特性評価するための、シンプルで高速、かつ信頼性の高いマルチパラメトリックフローサイトメトリーおよびTumor-on-a-chip支援プロトコルについて詳しく説明します。実際、がんと免疫細胞の相互作用を完全に理解することで、腫瘍を出し抜き、臨床ケアを導くための重要な洞察が得られます。

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