Name: 初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶライトシート顕微鏡を用いた初期ゼブラフィッシュ胚の高解像度ライブイメージング手法。被膜内の胚を適切にマウントし、細胞スケールの解像度で動的な発生過程を可視化する戦略を解説します。

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<meta charset="utf8"></head><body>ゼブラフィッシュ胚のための洗練されたマルチビューライトシート顕微鏡法

<ol><li>Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+and+its+potential+for+understanding+developmental+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Keller, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+morphogenesis%3A+Technological+advances+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168(2013).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+Light+sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+Light+sheet+microscope+for+imaging+mouse+pre-implantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development.</a> Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+Light+sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+image+fusion+improves+resolution+in+three-dimensional+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy.</a> Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).</li>
<li>Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+imaging+axis+microscopy+improves+resolution+for+thick-sample+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications.</a> Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+for+long-term+light+sheet+microscopy+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+symmetry+of+zebrafish+embryos+requires+somite+surface+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension.</a> Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).</li>
<li>Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+imaging+and+analysis+identify+pan-embryo+cell+dynamics+of+germlayer+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish.</a> Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hörl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigStitcher%3A+Reconstructing+high-resolution+image+datasets+of+cleared+and+expanded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples.</a> Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).</li>
<li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Icha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+sheet+fluorescence+microscopy+to+image+zebrafish+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development.</a> J Vis Exp. (110), e53966(2016).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+Light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).</li>
<li>Aigouy, B., Prud'homme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantitative+analysis+of+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues.</a> Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).</li>
<li>Mancini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+size+and+deltaA+expression+predict+adult+neural+stem+cell+decisions+along+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression.</a> Science Adv. 9, 7519(2023).</li>
<li>Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+timing+of+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis+to+external+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+remodeling+of+extracellular+matrix+orients+epithelial+sheet+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding.</a> Science Adv. 9, 2154(2023).</li>
<li>Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+multicellular+specimens+with+real-time+optimized+tiling+Light+sheet+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy.</a> Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+Light+sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>York, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+early+endosomal+maturations+emerge+from+a+stochastic+trigger-and-convert+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism.</a> Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathfinding+by+identified+zebrafish+motoneurons+in+the+absence+of+muscle+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers.</a> J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).</li>
<li>Rohde, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+timing+drives+the+vertebrate+segmentation+clock%27s+wave+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern.</a> eLife. , 13:RP93764 (2024).</li>
<li>Haynes, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLC4+shapes+axon+arbors+during+development+and+mediates+adult+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior.</a> eLife. 11, e74270(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アガロース、低ゲル化温度</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12022</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>バージョン: ImageJ 1.54f</td></tr><tr><td>ラテックスビーズ、カルボン酸変性ポリスチレン、蛍光赤、0.5 &mu;m 平均粒子径、水性懸濁液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 転写キット</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM1340</td><td>H2A-mCherryプラスミド</td></tr><tr><td>カリウムChhloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性のin vitro転写用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>PTFE スリーブ AWG 15L - 内径 1.58 mm x 壁 0.15 mm +/-0.05&nbsp;</td><td>フッ素樹脂</td><td>STW15</td><td>PTFEチューブ</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>Labman</td><td>LMUC3</td><td>超音波装置</td></tr><tr><td>ツァイス LightSheet 7 システム</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

サンプルを正確に方向付けることは、顕微鏡セットアップを効率的に使用するために不可欠な部分です。ただし、マルチビューライトシートシステムを使用する場合、チューブ内でサンプルを調製する必要があるため、サンプルを手動で方向付けすることは不可能な場合がよくあります。そこで、絨毛膜内で胚が占めるステレオタイプな位置があるかどうかを調べるため、原腸陥入から早期体節までのタイムラプスイメージングが本研究の焦点であったため、ゼブラフィッシュの胚を70%エピボリー(受精後約7時間（hpf)で画像化しました。70%エピボリーでイメージングする直前にサンプルを調製したとき、胚はサンプル間で頻繁に観察される特定の配向を示さなかった。これは望ましくない場合が多いため、サンプルは原腸陥入のかなり前に調製し、イメージングが開始されるまで適切な温度で微量遠心チューブに保管しました。これらの条件下では、70%エピボリー(N = 3;n = 87個の胚)で、胚の向きは、(1)胚の動物-植物(AV)軸がポリマーチューブの長軸に直交している場合の水平、(2)AV軸がポリマーチューブの長軸に平行な場合の垂直、および(3)斜め、 AV軸が鋭角にあったとき(図3A)。水平位置は最も少なく、垂直位置と斜め位置は等しく観察されました(図4)。
胚をチューブに残したとき、胚はこれらのそれぞれの位置で90%エピボリーまで安定しており、その後、ほとんどの胚は向きを変えました。したがって、胚形成の芽の段階での向きの2回目の文書化(約10 hpf)は、向きの変化を説明するために必要でした。これは、独立して調製されたサンプルに対して実行されました。初期の体節期のイメージングには、ポリマーチューブの長軸に直交する脊索を持つ胚が、軸15に沿って形成される複数の両側体節を視覚化できるため、理想的な配向であることが以前に報告されていました。原腸陥入前にサンプルを調製した場合(N = 3、n = 93胚)、胚の約25%がこの向きを示し(図4)、これらの胚は少なくとも8体節期までこの向きで安定しており、以前の報告15と一致しています。残りの胚は、芽の段階で他のさまざまな向きを示しました( 図3B および 図4に分類)。しかし、それらの多くは、体節形成の初期に水平位置に向きを変えました。興味深いことに、サンプルが原腸陥入前、70%エピボリー、または芽期の直前に調製されたかどうかに関係なく、芽の段階で同様の割合の胚が水平方向を示しました。したがって、サンプル調製のタイミングは、70%エピボリーでのイメージングで観察されたものとは異なり、体節ステージのイメージングの対象の水平方向にとってそれほど重要ではないようです。
マルチビューシステムの利点は、同じサンプルを複数の角度から表示できることです。しかし、上記の段階のゼブラフィッシュの胚については、胚全体にわたって細胞分解能を得るために必要なビューの数は明らかではありません。これを特徴付けるために、ゼブラフィッシュの胚を検出アームの20x/1 NA対物レンズを使用して、ズーム係数1でイメージングしました。これは、4.57 μmの薄いシートの厚さに相当します。これらの設定では、胚は6.5μmのピクセルサイズと1920×1920ピクセルの領域を持つsCMOSカメラの視野全体を覆いました。アクチンフィラメント(Utr-GFP)を標識したトランスジェニック系統から得られた1細胞期胚にヒストンタグ付き蛍光色素(H2A-mCherry)にmRNAをマイクロインジェクションすると、胚の核と細胞膜の両方を可視化することができました。異なる角度間隔の胚のマルチビュー融合を行うために、ダブルトランスジェニック胚およびチューブ内のビーズの360°取得を、30°間隔(n = 70%エピボリーの胚、n = 芽期の3胚)または45°(n = 70%エピボリーの3つの胚、n = 芽期の3胚)ごとに、各角度で約100スライス、スライス間隔2μmで行った。画像処理中に交互の角度をスキップすることで、30°と45°の取り込みはさらに60°と90°のデータセットを提供しました。
次いで、取得した画像をビーズ情報を用いて登録し、登録詳細をプロトコールのセクションに記載したように胚データセットに転送した。BigStitcherプラグインを使用したレジストレーションは、90°データセットを除いて、さまざまな取得で成功しましたが、これは各角度からのサンプルのカバレッジが少ないためである可能性があります。これを克服するために、胚を90°ごとに、各角度で約400スライス、スライス間隔2μmで、70%エピボリーステージとバッドステージの両方でイメージングし、成功裏に登録されました(各ステージでn = 3胚)。
次のステップは、登録されたデータセットのマルチビューフュージョンとデコンボリューションを実行することでした。これは、計算を高速化するために4倍のダウンサンプリングで行われました。個々の視点からの核の表現とマルチビュー再構築された胚(図5)に見られるように、個々のビューはより小さな視野をカバーしており、融合すると胚全体の画像が得られました。表現のために、核はFIJIベースのプラグインであるMastodon(https://github.com/mastodon-sc/mastodon)を使用して検出され、これはFIJIの「ヘルプ」メニューの「更新サイトの管理」セクションに追加でき、追加するとプラグインメニューからアクセスできます。検出については、まずそれぞれの画像をXML/hdf5形式に変換し、次にMastodonの「Detection」プラグインとDoG検出器(Diameter 6 μm、Quality Threshold 80)を使用して核検出を行いました。
さまざまな融合画像の中で、90°のデータセットはサンプルの深部で非常に高いバックグラウンドを示しており、定量化の実行には適していませんでした。したがって、ショウジョウバエの胚のような小さなサンプルは、他の研究で90°間隔で頻繁に画像化されています9,22とは異なり、20x/1 NA対物レンズを使用して初期のゼブラフィッシュ胚をイメージングする場合には推奨されません。30°、45°、60°の融合データセット間では、定性的には、核情報に大きな違いはありませんでした(図6B、上段)。しかし、セル境界などのより微細な構造は、他のデータセットと比較して、30°融合データセットの方がはるかによく分解されているように見えました(図6C、上段)。
この観察結果を確認するために、Mastodonを使用して、30°、45°、および60°ごとのイメージングから得られた融合画像中の核を検出しました。融合した画像内の3つの領域(胚の表面から20μm(図6A)、50μm、および100μmの深さにそれぞれ1つずつ)を解析用に選択しました。画像間での核検出の効率を比較するために、検出は上記のように、異なる角度間隔からの融合画像間で同一のパラメータを使用して実行しました。解析したすべての領域で、30°、45°、または60°ごとのイメージングから得られた融合画像に関係なく、すべての核が検出されました(図6B、下段)。したがって、原子核のような球状構造は、情報を失うことなく、上記の角度間隔のいずれでも画像化することができます。
細胞境界を解析するために、細胞24、25、26のセグメント化に日常的に使用されるFIJIプラグインであるTissue Analyzer23を使用した。Mastodonと同様に、Tissue Analyzerプラグインは、FIJIの「ヘルプ」メニューの「更新サイトの管理」セクションに追加でき、追加するとプラグインメニューからアクセスできます。細胞境界は、デフォルトのパラメータと、組織の深さに応じて1.5から2の範囲の強いぼかしと1の弱いぼかしを使用して、流域アルゴリズムを使用してセグメント化されました。これらのパラメータはすべての分析で一定に保たれ、簡単な比較が容易になりました。セグメント化された画像を手動で元の入力画像と比較すると、ソフトウェアがセル境界の検出に失敗したか、存在しないセル境界を描画するエラーが観察されました(図6C、下段)。Tissue Analyzer プラグインによって行われたエラーの数は、その領域で検出された結合の総数に正規化され、「境界セグメンテーションエラー」として計算されました。これらの誤差は解析したすべての領域に存在しましたが、45°および60°の角度間隔でのイメージングから得られた融合画像では、30°と比較して誤差の数が大幅に増加しました(図6D)。これは、角度間隔が長くなると、融合した画像の解像度がますます悪くなることを示しています。したがって、細胞境界などのより微細な構造をセグメント化する場合、角度間隔が狭いほど、下流の処理が容易になります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig01.jpg"> 図1:ポリマーチューブを使用したサンプル調製。 (A)保管された微量遠心チューブからポリマーチューブを鉗子を用いて採取する。(B)チューブを200μLマイクロピペットの先端に取り付けます。(C)ピペットの助けを借りて胚をチューブに吸引します。(D,E)チューブの底に向かって芽期の胚が見えるポリマーチューブ。(F)ポリマーチューブをE3の入ったペトリ皿に載せて、アガロースを固めます。(G)E3を充填した微量遠心チューブにポリマーチューブを保管します。(H)ポリマーチューブが取り付けられたサンプルホルダー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig02.jpg"> 図2: ビーズを使用したマルチビュー画像解析のワークフローとレジストレーション。 (A)マルチビュー画像解析パイプライン。(B)画像は、FIJIプラグインであるBigStitcherの「Multiview Explorer」ウィンドウを示しており、各ビューは1行として表示され、角度、チャネル、登録、関心ポイント、およびPSFに関する情報が含まれています。プロトコルで説明されているすべてのコマンドは、ポップアップメニューに示すように、ビューを選択して右クリックすると表示されます。選択したビューは、次に示すように BigDataViewer ウィンドウで視覚化できます。(C)30°角間隔でのイメージングから得られたレジストレーション前(左)とレジストレーション後(右)の代表的なビーズ画像。すべての角度ビューが選択され、表示されています。スケールバー:75μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig03.jpg"> 図3: デフォルトの胚の向きの概要。胚が70%エピボリー(A)および芽期(B)で絨毛膜内に収まる向きの代表的な画像。各パネルの一番上の行はライトシートシステムから取得した明視野画像を示し、下の行は代表的な漫画を示しています。(B)の矢印は、向きの識別に使用された脊索の位置を示しています。AP、動物の棒;Vp、植物ポール;A、前方;P、後部。スケールバー:100μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig04.jpg"> 図4: さまざまな胚の向きの統計。(A)積み重ねられた列は、原腸陥入前にサンプルを調製したときに70%エピボリーで示された配向に落ちる胚の割合を示しています。(B)積み重ねられた列は、原腸陥入前にサンプルを調製した場合の芽期(左)、70%エピボリー(中央)、および芽期(右)で示された配向に該当する胚の割合を示しています。N、胚が得られた独立したクラッチの数。n、胚の総数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig05.jpg"> 図5: マルチビュー再構成胚からの核の表現。 (ア)3D散布図は、 30°の角度間隔で画像化されたマルチビュー再構成胚で検出された核を表しています。各円は原子核を表し、原子核の位置の重心がプロットされます。核座標は、FIJIのプラグインであるMastodonを使用して取得しました。(B)同じ胚の3つの代表的なビューからの核の3D散布図-描写は60°離れています。各原子核の色はランダムに割り当てられました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig06.jpg"> 図6: 融合画像におけるセルラースケール情報の比較。(A)左の画像は、表面から20μmの深さでマルチビュー再構成された胚のスナップショットを示しています。黄色の円は、詳細な解析に使用される領域を示しています。スケールバー:50μm(すべてのパネル)。(B)胚の表面から深さ20μmの核の代表的な生画像で、それぞれ30°、45°、60°ごとに画像化されたデータセットから得られたもの(上)。同じ画像で検出された核(緑色)は、FIJIのプラグインであるMastodon(下)です。(C)アクチンマーカーであるUtr-GFPを使用して、30°、45°、60°ごとに画像化された3つのデータセットから、胚の表面から深さ20μmの深さでの代表的な生画像(上)。FIJIのプラグインであるTissue Analyzerによってセグメント化された境界は、同じ画像に対して表示されます(下)。矢印は、Tissue Analyzer が境界セグメンテーションで行ったエラーを示しており、黄色の矢印は欠落している境界を表し、白い矢印は、視覚的に境界が存在しないように見える場合に誤って検出された境界を表しています。(D)箱ひげ図は、Tissue Analyzerが30°、45°、60°ごとに異なる深さで画像化されたマルチビュー再構築胚間で行ったエラーの割合を示しています。エラーバーは、四分位範囲の1.5倍を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

light-sheet-microscopy-imaging-mounting-strategies-for-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この記事では、ライトシート蛍光顕微鏡のサンプル調製について説明します。また、ゼブラフィッシュの生きた胚を長時間イメージングする方法も示しており、これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録することができます。...

ライトシート顕微鏡サンプル調製:長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚のマウント

ゼブラフィッシュの胚の発達は、低濃度のアガロースで光学的に透明なポリマーチューブに埋め込まれている光シート顕微鏡で日間にわたって追跡することができる。...

多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け

ライトシート蛍光顕微鏡は、胚発生をイメージングするための優れたツールです。これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録できます。私たちは、広い時空間スケールでのゼブラフィッシュの眼の発達のイメージングへの応用を実証し、マルチビューデータセットの融合とデコンボリューションのパイプラインを提示します。...

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

ここでは、正常な発達を乱すことなく、生きたゼブラフィッシュの胚の後部体の発達を長期間のタイムラプスイメージングを可能にする汎用性の高いマウント方法を紹介します。...

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

この記事では、長時間経過共焦点顕微鏡用に脆弱なゼブラフィッシュ胚を取り付ける方法について説明する。この低コストの方法は、任意の反転顕微鏡でイメージングするための通常のガラス底顕微鏡用皿を使用して簡単に行うことができます。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。...

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

ここでは、市販のライトシート顕微鏡および画像処理ワークステーションを用いて眼形態形成のタイムラプスイメージングを行い、得られたデータを解析するためのプロトコルが提供される。このプロトコルは、胚麻酔、低融解温度アガロースへの埋め込み、イメージングチャンバ内の懸濁、イメージングパラメータの設定、および最後に画像解析ソフトウェアを使用したイメージングデータの分析の手順を詳述しています。...

rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化

光シート蛍光顕微鏡で 生体内...

ゼブラフィッシュ胚における高速心臓ダイナミクスの光シート顕微鏡

ここで説明する方法は、焦点平面ドリフトを補正する光学切片および再調整の単純な戦略を実行することができる顕微鏡解剖蛍光を用いて、ゼブラフィッシュ胚における器官の発達の時間経過解析を可能にします。...

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

ここでは、透過光と蛍光顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングのためのニワトリ胚ex...

長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ例OVOタイムラプスイメージング

学ぶライトシート顕微鏡を用いた初期ゼブラフィッシュ胚の高解像度ライブイメージング手法。被膜内の胚を適切にマウントし、細胞スケールの解像度で動的な発生過程を可視化する戦略を解説します。

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

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