Name: ヒト腸オルガノイドを使用して、単一細胞転写レベルでの小腸上皮の理解 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶ単一細胞トランスクリプトミクスとヒト腸オルガノイド技術を統合した解析手法。小腸上皮の細胞異質性と転写ランドスケープを詳細に解明し、腸疾患のバイオマーカー同定と個別化医療への応用を推進します。

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著者らは、U19 AI157984、U01 DK103168、U19 AI144297、P30 DK56338、P01 AI057788、U19 AI116497助成金、および NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A を認めています。

シングルセルトランスクリプトミクスとヒト腸管オルガノイドの統合

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li>
<li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+human+intestine+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization of the human intestine at single-cell resolution.</a> Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).</li>
<li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus%2C+stomach%2C+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).</li>
<li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).</li>
<li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

シングルセルゲノミクスプラットフォームを使用すると、腸上皮をモデル化する組織由来のHIO培養物などの複雑な生物学的システムを分解して、全体的な生物学的応答に対する個々の細胞の寄与を得ることができます4,5,6。細胞の不均一性や希少な細胞集団も同定し、調査することができます。シングルセルトランスクリプトームベースのプラットフォームを使用してアウトプットを最大化するには、細胞インプットを最適化する必要があります。ここでは、非常に生存率が高く、高品質のシングルセル懸濁液が得られ、下流の高品質なトランスクリプトームデータが得られる可能性を高めるプロトコールについて説明します。プロトコールに精通していることは最も重要であり、ライブラリ調製を進める前に数回の練習を行うことをお勧めします。細胞をライブラリー調製に使用する前に、生存可能な単一細胞懸濁液の再現性のある達成が推奨されます。プロトコルの実装の迅速さは、速度が生存率の結果に正比例するため、最も重要です。これに基づいて、一度に処理されるサンプルの数を制限することをお勧めします。トラブルシューティングを支援するために、これらのプロトコルを開始する前にライブラリを準備するエンティティと対話することをお勧めします。
HIOの生存率は、シーケンシングに送られるDNAライブラリに直接影響します。HIOの細胞生存率は、解離、遠心分離、バッファー、ピペッティング、カウント精度など、シングルセル懸濁液の調製におけるいくつかのステップに依存します。このプラットフォーム用にHIOを準備する目標は、細胞生存率の維持とサンプル品質のバランスを取ることです。高品質のデータを得るためには、細胞凝集体、死細胞、非細胞核酸、逆転写の生化学的阻害剤を最小限に抑えることが重要です。死にかけている細胞は核酸ノイズを増加させ、細胞凝集の一因となり、データおよびプラットフォームの障害につながります7,8,9,10,11,12。適切なフィルター サイズでフィルタリングすると、大きな集計を削除してデータ品質を向上させるのに役立ちます。
単一細胞懸濁液を調製する際にHIO細胞死を最小限に抑えるには、いくつかの要素を考慮する必要があります。少なくとも80%の生存細胞を得ることが必要であり、>90%の生存率がさらに望ましいです。生細胞が不活性な細胞の数が多いサンプルは、カラムベースのマイクロビーズなど、死細胞を除去する戦略を用いて改善することができますが、これらの細胞は取り扱い中に損失するため、より多くの初期細胞と大量のサンプルを必要とします。HIOは特にバッファーに敏感であり、特定のバッファーでRTに長時間放置すると細胞死を起こします。オルガノイド培地は、細胞の損失と凝集体の形成を最小限に抑えます。ピペッティングは、解離中のHIO生存率にも影響を与える可能性があります。通常のボアチップはオルガノイドをせん断し、単一細胞懸濁液に解離するのを助けることができます。しかし、通常のボアチップで急ぎすぎるピペッティングは、せん断力によるHIO細胞の損傷を引き起こす可能性があります。ワイドボアチップによるゆっくりとしたピペッティングにより、HIO細胞へのストレスが最小限に抑えられ、下流の生細胞数が大幅に向上します。遠心分離、洗浄、および再懸濁は、HIO単一細胞懸濁液の品質に影響を与える可能性のある他の要因です。スイングバケット遠心分離により、HIO細胞のペレット化が穏やかになり、細胞損失を最小限に抑えながら死細胞の数を減らすことができます。最後に、濃度を決定するためのカウント精度は、ライブラリ合成のためにプラットフォームに到達する細胞の最大数を確保するために不可欠です。これらの詳細に注意を払うことで、単離プロセス中のHIO細胞へのストレスを最小限に抑え、処理後のデータリターンの可能性を最大限に高めることができます。
シングルセルトランスクリプトミクスは、シングルセルレベルで生物学的プロファイルと応答を解剖するための強力なツールですが、この技術をヒト腸オルガノイド培養の解析に応用する際には、いくつかの制限を考慮する必要があります。まず、ライブラリの調製およびシーケンシング中に生じる技術的なばらつきや、サンプル調製によるバッチ効果により、転写に大きなばらつきが生じる可能性があります。さらに、シーケンシングでは、遺伝子や細胞間でシーケンシングの深さが不均一である場合、カバレッジバイアスが生じる可能性があります。これは、低発現遺伝子を検出したり、希少な細胞集団を同定したりする際に課題を引き起こします。第二に、オルガノイド培養物の細胞および転写の不均一性、および天然の腸上皮と比較した場合の細胞プロファイルの分化が少ないため、細胞タイプの同定が困難になる可能性があります。転写応答を機能的な表現型に結合させることも課題であり、他のアプローチやアッセイを用いた追加の検証が必要です。第三に、このアプローチには、細胞の空間的文脈や時間的ダイナミクスの考慮は含まれていません。解離手順により、転写データから細胞間相互作用を推測する能力が失われます。それは、生物学的連続体ではなく、細胞状態の単一のスナップショットを提供するだけです。最後に、シングルセル転写アプローチはコストがかかる可能性があり、専門的な計算ツールとバイオインフォマティクスの専門知識が必要です。しかし、このアプローチは、細胞の不均一性を理解し、新しい細胞タイプを特定するための主要な最先端ツールであることに変わりはありません。

小腸上皮には、腸幹細胞(ISC)を収容する陰窩と、分泌系統と吸収系統の分化細胞で構成される絨毛の2つの異なるゾーンがあります。この複雑さに加えて、上皮の局所特異性があり、小腸の領域間に独自の機能特性を提供します。先駆的な研究により、ヒトの小腸陰窩と絨毛ゾーンの両方を手術組織または組織生検から 生体外で 生成できる培養条件が確立されました1。これらの培養物は、動物実験と臨床試験の間のギャップを埋め、これまで認識されていなかった消化管の細胞生物学、生化学、生理学を明らかにしています。HIOは、幹細胞の生存率を促進する成長因子と細胞外支持マトリックスを備えた培地を使用して、3D球状構造として増殖します。これらの条件により、主に前駆細胞と幹細胞で構成される陰窩のようなHIOモデルが得られます。成長因子の除去は、ISCの分化(絨毛様モデル)と成熟腸上皮細胞(杯、腸内分泌、房、腸細胞)の適切な比率での産生を促進し、細胞の増殖と分化、分極、バリア完全性、局所特異的特徴、および適切な生理学的応答とともに促進します2.HIO培養物は遺伝的に安定しており、陰窩のような状態で無期限に増殖することができます。これらの培養物の頂端表面への容易なアクセスは、単層フォーマット3での増殖を可能にする培養条件によって提供されます。HIOはまた、遺伝学、年齢、性別、民族性、疾患状態などの宿主の個体差の考慮を生物学的分析に含めることを可能にします。分析的および機能的評価ツールは、形質転換細胞株を中心としたアプローチで使用されるものと同じであり、フローサイトメトリー、顕微鏡法、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなどのさまざまな分子技術が含まれます。
シングルセルトランスクリプトミクスは、各細胞タイプの生物学的プロセスへの個々の寄与についての洞察を提供することにより、小腸の生物学と生理学の理解に革命をもたらしています。この技術を用いた先駆的な研究は、天然のヒト腸内に存在する細胞型の風景を提供してきた4,5,6。シングルセル転写プロファイリングプラットフォームは、個々の細胞の転写ランドスケープの探索を可能にし、細胞の不均一性を科学的探索の最前線に浮かべることができます。一部のシングルセル転写プロファイリングプラットフォームでは、マイクロ流体分割とバーコード化を使用して、サンプルあたり最大10,000個の細胞から得られた細胞ポリアデニル化mRNAからcDNAライブラリを生成します。このプラットホームでは、単一細胞、バーコード付きオリゴヌクレオチド、逆転写試薬、および油を含む液滴が反応小胞を形成し、その結果、同じバーコードを持つ単一細胞からのすべてのcDNAが得られます。バーコード化されたcDNAは、次世代シーケンシングを使用して効率的にシーケンシングできます。生成されたデータは、バーコード化された配列を視覚化マップと単一細胞転写プロファイルに変換するソフトウェアと視覚化ツールで処理できます。細胞集団は、ヒト小腸上皮の公開データベースを使用して同定できます4,5,6。このプラットフォームを利用してマウスの腸オルガノイドをシングルセルレベルで調べる研究は数多くありますが、HIOのシングルセル転写応答の解析は7,8,9,10,11,12に遅れをとっています。
ここでは、小腸のHIOから生細胞を単離し、シングルセル転写プロファイリングプラットフォームで処理するためのステップバイステップのガイドを提供します(図1)。培養と分化のガイドラインと、上皮分化に最適化された培地成分を提供します。ここでは、プラスチックまたは膜細胞培養インサート上での3次元(3D)培養および単層培養の3つの異なる培養フォーマットの細胞回収方法の概要を説明します。オープンソースソフトウェアを用いて得られたクラスタリングデータのサンプルを提供し、各クラスターで発現差のある遺伝子を導出します。

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.4% Trypan blue</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS Ca-</td> <td>Mg-Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>24 mm Transwell</td><td>Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルNunclon delta表面組織培養皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro;m細胞ス</td><td>トレーナーFalcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro;m Flowmi チップストレーナー</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0040</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro;m Flowmi tip strainer</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0070</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1X</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM シングルセル 3'GEM、ライブラリ&ゲルビーズキットv3.1</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000128</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンIV</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C5533-5MG</td><td>33 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>Corning 細胞回収溶液&nbsp;</td><td>VWR</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>1X</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>L-WRN 馴染培地</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, phenol free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>mouse組換え EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>1X</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>500 &micro;M</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>10 & micro;M</td></tr><tr><td>トランズウェル</td><td>コーニング</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>幹細胞技術</td><td>72308</td><td>10 &micro;メートル</td></tr></tbody></table>

ヒト腸オルガノイドを使用して、単一細胞転写レベルでの小腸上皮の理解

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

シングルセルトランスクリプトミクスは、人体の細胞生物学の理解に革命をもたらしました。最先端のヒト小腸オルガノイド培養は、動物モデルと臨床研究の間のギャップを埋める ex vivo モデルシステムを提供します。シングルセルトランスクリプトミクスをヒト腸オルガノイド(HIO)モデルに応用することで、これまで認識されていなかった消化管の細胞生物学、生化学、生理学が明らかになりました。高度なシングルセルトランスクリプトミクスプラットフォームは、マイクロ流体分割とバーコードを使用してcDNAライブラリを生成します。これらのバーコード付きcDNAは、次世代のシーケンシングプラットフォームで簡単にシーケンシングでき、さまざまな視覚化ツールでマップを生成するために使用できます。ここでは、ヒト小腸HIOをさまざまな形式で培養および鑑別する方法と、シングルセル転写プロファイリングプラットフォームでの使用に適したこれらのフォーマットから生細胞を単離する手順について説明します。これらのプロトコルおよび手順は、小腸HIOの使用を促進し、さまざまな異なる環境の文脈における転写レベルでのヒト腸上皮の細胞応答の理解を深めることができます。

膜細胞培養インサート、単層、および3D HIOの2〜3ウェルからシングルセル懸濁液をプールして、十分な細胞収量を確保し、ウェル間のばらつきを減らしました。シングルセルライブラリーは、シングルセル転写プロファイリングプラットフォームに特異的な試薬を使用して調製しました。また、次世代のシーケンシングプラットフォーム上でペアエンドリードを使用してシーケンシングされ、30,000リード/セルです。リードは、シングルセルゲノミクス用の分析ツールを使用してマッピング、カウント、および分析されました。ミトコンドリアリードが20%を超える低品質の細胞、またはカウントされた遺伝子が200個未満の細胞は、分析から除外されました。細胞の品質を評価するために、遺伝子の数、UMI、および細胞あたりのミトコンドリアリードの割合をプロットしました(図3)。高品質の細胞には、約3500の遺伝子、15,000のUMI、および10%のミトコンドリアリードが含まれています。ろ過後、HIO増殖フォーマットに応じて4000〜9500個の単一細胞を取得しました。教師なしクラスタリングとUMAP次元縮小により、吸収性腸細胞や分泌細胞など、予想される細胞タイプを表す明確なクラスターが同定されました(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig01.jpg"> 図1:プロトコルの手順の概要。 HIOをさまざまな形式でシングルセルデータワークフローにプレーティングする主な手順を概説した概略図。この画像はBiorenderを使用して作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig02.jpg"> 図2:明視野画像。 処理の準備ができているHIOは、5倍の倍率で明視野顕微鏡を使用して画像化されました。左、3Dオルガノイド。中央、96ウェルプレート。そうです、トランズウェル。スケールバー = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig03.jpg"> 図3:データの品質管理。 96ウェルプレート上の単層として成長した空腸HIOから単離された単一細胞の分析指標の例。バイオリンプロットは、細胞あたりの遺伝子数(nFeature_RNA)、UMA(nCount_RNA)、およびミトコンドリアリード率(percent.mt)を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig04.jpg"> 図4:分析した単一細胞のUMAP.(A)合計9952個の単一細胞を、96ウェルプレートで増殖させた分化した空腸HIOから単離した。(B)膜細胞培養インサート上に増殖した分化空腸HIOから、合計5623個の単一細胞を単離した。(C)合計4402個の単一細胞が分化した回腸3D HIOから単離されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>WRNE成長培地</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>差別化媒体</td>
		</tr><tr><td>コンポーネント</td>
			<td>容積</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>L-WRNコンディショニング培地、ニコチンアミドおよびSB202190を含まないWRNE培地</td>
		</tr><tr><td>※Y-27632(5mM)オプション</td>
			<td>200μL</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>A 83-01 (500 μM)</td>
			<td>100μL</td>
			<td>500 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>アドバンスドDMEM/F12</td>
			<td>45ミリリットル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>B27 さん</td>
			<td>2ミリリットル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF(50μg/mL)</td>
			<td>100μL</td>
			<td>50 ng/mL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ガストリン (10 μM)</td>
			<td>100μL</td>
			<td>10 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GlutaMax(100倍)</td>
			<td>1 mLの</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPESの1メートル</td>
			<td>1 mLの</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-WRNコンメディア用</td>
			<td>50ミリリットル</td>
			<td>~50%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N2の</td>
			<td>1 mLの</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N-アセチルシステイン(500 mM)</td>
			<td>100μL</td>
			<td>500 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ニコチン酸アミド1 M</td>
			<td>1 mLの</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>SB202190 (10 mM)</td>
			<td>100μL</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>総ボリューム</td>
			<td>100ミリリットル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CMGF-ミディアム</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>アドバンスドDMEM/F12</td>
			<td>500ミリリットル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>グルタマックス</td>
			<td>5ミリリットル</td>
			<td>100倍</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>1 M ヘペス</td>
			<td>5ミリリットル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表1: 使用されるさまざまなメディアの組成。

このプロトコルは、ヒト腸オルガノイド技術とシングルセルトランスクリプトーム解析を組み合わせて、これまで未踏の腸内生物学に関する重要な洞察を提供します。

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

私たちは、小さな腸の陰窩からヒトの腸を、手術組織と生検の両方から採取した結腸の陰窩からコロノイドを確立する方法を説明しています。この方法論の記事では、ヒトエンテロイドとコロノイドの成長と維持を成功させるために不可欠な培養モダリティを紹介します。...

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このビデオプロトコルでは、一次腸上皮のオルガノイドにおけるレンチウイルス形質導入と、定量的RT-PCR、RNA-マイクロアレイ、免疫組織化学によるこれらの培養物の処理と下流分析について、段階的に説明します。...

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オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

生検由来の腸オルガノイドと臓器オンチップ技術は、領域特異的な腸機能を再要約するためにミクロ生理学的プラットフォームに組み合わされます。...

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

ここでは、ラット腸管オルガノイドを作製し、いくつかのダウンストリームアプリケーションで使用するためのプロトコルを紹介します。ラットはしばしば好ましい前臨床モデルであり、堅牢な腸オルガノイド系は、in vivo研究に付随するin...

ラット腸管オルガノイドの作製と操作

この研究では、小腸と大腸に由来するブタオルガノイドの2D単層を生成するためのプロトコルを概説しています。これらの単層の成長は、TEER値の増加によって特徴付けられ、堅牢な上皮の完全性を示します。さらに、これらの単分子膜は、フォルスコリンの適用後のUssingチャンバー実験で生理学的分泌応答を示します。...

天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド

ヒト腸オルガノイドは、天然のヒト腸の構造と機能をよりよく再現するために神経支配されなければなりません。ここでは、これらの構築物に腸神経系を組み込むための1つの方法を紹介します。...

ヒト腸オルガノイドの神経支配

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

学ぶ単一細胞トランスクリプトミクスとヒト腸オルガノイド技術を統合した解析手法。小腸上皮の細胞異質性と転写ランドスケープを詳細に解明し、腸疾患のバイオマーカー同定と個別化医療への応用を推進します。

ヒト腸オルガノイドを使用して、単一細胞転写レベルでの小腸上皮の理解

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