Name: RGD官能化アビジン-ビオチンテザーを用いた血小板遊走を研究するためのIn vitroアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 学ぶRGD官能化アビジン-ビオチンテザーを用いた血小板遊走のin vitroアッセイ。最適なリガンド密度で血小板が効果的に遊走し、細胞骨格の調節機構を解明する手法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>3層コーティングシステムによる単血小板移行のイメージング

<ol><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+thrombosis--insidious%2C+unpredictable+and+deadly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Arterial thrombosis--insidious, unpredictable and deadly.</a> Nat Med. 17, 1423-1436 (2011).</li>
<li>Kaiser, R., Escaig, R., Nicolai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostasis+without+clot+formation%3A+how+platelets+guard+the+vasculature+in+inflammation%2C+infection%2C+and+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hemostasis without clot formation: how platelets guard the vasculature in inflammation, infection, and malignancy.</a> Blood. 142 (17), 1413-1425 (2023).</li>
<li>Gaertner, F., Massberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+the+vascular+borders%3A+Platelets+in+immunity+to+infection+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patrolling the vascular borders: Platelets in immunity to infection and cancer.</a> Nat Rev Immunol. 19 (12), 747-760 (2019).</li>
<li>Gaertner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+platelets+are+mechano-scavengers+that+collect+and+bundle+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Migrating platelets are mechano-scavengers that collect and bundle bacteria.</a> Cell. 171 (6), 1368-1382.e23 (2017).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+platelets+seal+neutrophil-induced+vascular+breaches+via+GPVI+during+immune-complex-mediated+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single platelets seal neutrophil-induced vascular breaches via GPVI during immune-complex-mediated inflammation in mice.</a> Blood. 126 (8), 1017-1026 (2015).</li>
<li>Nicolai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+surveillance+by+haptotactic+blood+platelets+in+inflammation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">Vascular surveillance by haptotactic blood platelets in inflammation and infection.</a> Nature Comm. 11, 5778(2020).</li>
<li>Kaiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+via+a+GpIIb%2FSrc%2F14-3-3zeta+axis+critically+regulates+platelet+migration+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing via a GpIIb/Src/14-3-3zeta axis critically regulates platelet migration in vascular inflammation.</a> Blood. 141 (24), 2973-2992 (2023).</li>
<li>Sarkar, A., LeVine, D. N., Kuzmina, N., Zhao, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+driven+by+self-generated+integrin+ligand+gradient+on+ligand-labile+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration driven by self-generated integrin ligand gradient on ligand-labile surfaces.</a> Curr Biol. 30 (20), 4022-4032 (2020).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+Bidirectional%2C+allosteric+signaling+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines.</a> Cell. 110 (6), 673-687 (2002).</li>
<li>Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+as+biomechanical+sensors+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20, 457-473 (2019).</li>
<li>Shattil, S. J., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+Dynamic+scaffolds+for+adhesion+and+signaling+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Integrins: Dynamic scaffolds for adhesion and signaling in platelets.</a> Blood. 104 (6), 1606-1615 (2004).</li>
<li>Yuan, C., Chen, A., Kolb, P., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+streptavidin-biotin+complexes+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of streptavidin-biotin complexes measured by atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 39 (33), 10219-10223 (2000).</li>
<li>Florin, E. L., Moy, V. T., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+forces+between+individual+ligand-receptor+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs.</a> Science. 264 (5157), 415-417 (1994).</li>
<li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397, 50-53 (1999).</li>
<li>Jurchenko, C., Chang, Y., Narui, Y., Zhang, Y., Salaita, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-generated+forces+lead+to+streptavidin-biotin+unbinding+in+cellular+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Integrin-generated forces lead to streptavidin-biotin unbinding in cellular adhesions.</a> Biophys J. 106 (7), 1436-1446 (2014).</li>
<li>Fan, S., Lorenz, M., Massberg, S., Gaertner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+migration+and+bacterial+trapping+assay+underflow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Platelet migration and bacterial trapping assay underflow.</a> Bio-Protocol. 8 (18), e3018(2018).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+A+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: A physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Palecek, S. P., Loftus, J. C., Ginsberg, M. H., Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-ligand+binding+properties+govern+cell+migration+speed+through+cell-substratum+adhesiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrin-ligand binding properties govern cell migration speed through cell-substratum adhesiveness.</a> Nature. 385, 537(1997).</li>
<li>Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+integrin+tension+and+cellular+force+at+submicron+resolution+with+an+integrative+tension+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor.</a> J Vis Exp. (146), e59476(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アデノシン5&prime;-二リン酸ナトリウム塩(ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594ファロイジン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>血液カウンター</td><td>シスメックス</td><td>XN-1000</td><td></td></tr><tr><td>ボトムレス 6チャンネル スティッキースライド</td><td>IBIDI, スティッキースライド VI0.4</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>サイクロ [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(ビオチン-PEG-PEG)]</td><td>ペプチド 国際</td><td>PCI-3697-PI</td><td></td></tr><tr><td>FACS チューブ</td><td>コーニングブランド&nbsp;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>FITCコンジュゲートニュートラアビジン</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA2662</td><td></td></tr>ホル<tr><td>ムアルデヒド&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>位相差およびエピ蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ディーナー</td><td>116531</td><td></td></tr><tr><td>PLL (20)-g [3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-ビオチン (50%)</td> <td>Susos</td><td>PLL (20)-g [3.5]-PEG(2)/PEG (3.4)-ビオチン (50%)</td><td></td></tr> <tr><td>ポリ (L-リジン) -グラフト-ポリ(エチレングリコール)共重合体</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>プロスタグランジンI2ナトリウム塩(PGI2)</td><td>Abcam</td><td>ab120912</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>BANDELIN</td><td>SONNOREX RK514M</td><td></td></tr><tr><td>Ttriton X-100 20% v/v</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td></td><td></td>600217</tr><tr><td>U46619</td><td>エンツォ ライフサイエンス</td><td>BML-PG023-0001)</td><td></td></tr></tbody></table>

rgd官能化アビジン-ビオチンテザーを用いた血小板遊走を研究するためのin vitroアッセイ

An In Vitro Assay to Study Platelet Migration Using RGD-Functionalized Avidin-Biotin Tethers

活性化血小板は、PLL-PEG-ビオチン-ニュートラアビジン-FITC-ビオチン-cRGDコーティングスライド(図1Cおよび図2A、0分および5分)上に容易に付着して広がり、続いて前縁にラメリポディウムを形成することにより分極します(図2A、10分)。この過程で、偽核(血小板の中心にある暗い領域)が血小板の中心から後部に移動しました(図2A)。その後、分極した血小板は明らかな方向性なしに移動を開始します(図2A、15分、20分、図2B)。PLL-PEG-ビオチン-ニュートラアビジン-FITC-ビオチン-cRGDコーティング上を移動する血小板は、移動経路に沿った蛍光強度の低下によって証明されるように、ニュートラアビジン-FITC-ビオチン-PLL-PEG結合を切断できることを観察しました(図1Cおよび図2A、B)。さらに、破壊されたニュートラアビジン-FITC-ビオチン-cRGD複合体が血小板表面に蓄積します(図2A、B)。この現象は、移動する血小板が基質からフィブリノーゲンを除去し、開放性小管系(OCS)内に蓄積した以前の知見と似ています4。
リガンド密度が血小板遊走にどのように影響するかを調べるために、最初のコーティング層でPLL-PEGに対するPLL-PEGの比率を変化させることにより、cRGD密度を調整しました。これらのデータから、マウスの血小板は2.5%濃度のPLL-PEG-ビオチンで最適な遊走を達成することが明らかになりました。PLL-PEG-ビオチンの濃度が低い(1%)と高い(10%)の両方で、移動が減少します(図3A、B)。これらの基質依存的な遊走行動の変化は、血小板形態の変化を伴います(図3C)。リガンド密度が低い(1%)と、血小板は十分に広がりません(これは、投影された血小板面積と周囲長が低いことからも明らかです(図3C)。これは、インテグリンの活性化とアウトサイドインシグナル伝達が不十分であることを示唆しています7。その結果、血小板はcRGDリガンドに力を加えることができず、基質のリモデリングに失敗し、移動しません(図3A、B)。
リガンド密度が中程度(2.5%)では、血小板の面積と周囲が有意に増加します(図3C)。血小板は効果的に広がり、不安定なcRGDリガンドを機械的に破壊し、遊走します(図3A、B)。しかし、リガンド密度が高い(10%)と、拡散は増加するものの、血小板は分極せず、アスペクト比が低下します(図3C)。これらの条件下では、血小板は粘着性基質に付着したままであり、不安定なcRGDリガンドを切断できないため、移動しません(図3A、B)。
これらの知見は、血小板の移動が基材の接着特性に大きく依存することを示しています。血小板は、それらが接着性配位子と十分に噛み合い、同時に接着性基材4,6,7,8の張力耐性を克服するのに十分な強度の牽引力を生成する場合にのみ移動することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig01.jpg"> 
図1:コーティング手順と血小板-基質相互作用のライブイメージング(A)組み立てられたチャンバーの写真。(B)議定書の原則。左:コーティングの概略図。プラズマ処理されたガラスカバースリップを3層でコーティングしました。最初の層は、PLL-PEGとPLL-PEG-ビオチンの混合物です(PLL-PEG骨格は細胞に対して不活性であり、非特異的な結合を防ぎます)。第2層はニュートラアビジン-FITCであり、第3層はビオチン-cRGDです。ニュートラアビジン-FITCは、PLL-PEG-ビオチンとビオチン-cRGDを架橋します。血小板は、原形質膜のインテグリンを介してビオチン-cRGDに結合します。右:血小板インテグリンによるビオチン-アビジンの結合解除の図。血小板は、インテグリン-cRGDの結合を通じて基質に力を及ぼし、上部cRGD-ビオチン-ニュートラアビジン-FITC-結合または下部ニュートラアビジン-FITC-PLL-PEG-ビオチン-結合のいずれかを破裂させます。ニュートラアビジン-FITCとビオチン-PLL-PEGとの間の下部結合の破裂は、蛍光シグナルの減少をもたらすが、ビオチン-cRGDとニュートラアビジン-FITCとの間の上部結合の切断は、そうではない。蛍光が減少した領域は血小板の移動経路を示し(図2Aも参照)、蛍光が増加した領域は、移動する血小板にFTIC-ニュートラアビジン-ビオチン-cRGDが蓄積していることを示します。スケールバー:5μmこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig01large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig02.jpg"> 
図2:リモデリングされた基質によってコードされた血小板遊走の免疫蛍光イメージング(A)単一血小板遊走の代表的な動画シーケンス。左:移動する血小板の位相差画像。血小板は、前縁にラメリポディウムを形成することによって分極し、その後移動します。右:ニュートラアビジン-FITCを基板から除去し、血小板移動の「フットプリント」を残しました。破裂したcRGD-ビオチン-ニュートラアビジン-FITCは、移動する血小板の中心に蓄積します。(B)リガンド不安定性cRGD-ビオチン-アビジンコーティング上の血小板遊走の代表的な画像。上:ファロイジン(Alexa FluorTM 594)で染色した血小板は、大きなラメリポジウム形成と、移動する血小板を連想させる偏光形状を示しました。移動する血小板は、cRGD-ビオチン-ニュートラアビジン-FITC結合を切断し、FITCシグナルの減少で示される遊走経路を基質上に生成します。下:拡大倍率でトリミングされた画像。(C)移民トラックは、フィジーで黄色の線で手動で描かれました。スケールバー:5μmこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig03.jpg"> 
図3:PLL-PEGに対するPLL-PEG-ビオチンの比率は、血小板の移動と形状を決定します。 (A)1%、2.5%、および10%のPLL-PEG-ビオチンコーティング上の血小板の代表的な画像、スケールバー:5μm。 (B)血小板接着、移動効率、および移動距離の定量化、n = 4独立した実験。平均値/SD;一元配置ANOVA/テューキー;**p &lt; 0.01;p &lt; 0.001;p &lt; 0.0001、ns:有意ではない (C)血小板形状記述子(面積、周囲長、真円度、およびアスペクト比)の定量化、n = 4独立した実験。平均/最小-最大;一元配置ANOVA/テューキー;**p &lt; 0.01;p &lt; 0.001;p &lt; 0.0001、ns: 有意ではありません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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