更新されたマルチプレックスLN34リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイによる動物の狂犬病の死後診断

狂犬病は100%致死的であり、最も必要な人に命を救う治療を提供するためには迅速かつ正確な診断が求められます。信頼できる検査室での検査は狂犬病の管理に非常に重要です。CDCは、検証済みリアルタイムのアリサウイルス検査LN34を用いて定量逆転写酵素PCRまたはRT-PCRによる狂犬病検査の段階的プロトコルを開発し、検査室が診断精度を向上させ、狂犬病予防活動を支援しています。

数十年にわたり、狂犬病の検査はDFAまたはFATと呼ばれる直接蛍光抗体検査に依存していました。しかし、多くの国際的な検査機関でも、その優れた感度と精度から狂犬病検査にRT-PCRを使用しています。狂犬病のDFA検査は専門的な顕微鏡、コールドチェーン保管、スタッフの専門的な訓練、試薬の不足が経験しています。PCRやRT-PCRは現在、病原体検査に広く使われています。

多くの検査室はすでにPCRおよびRT-PCR機器と専門知識を持ち、必要な試薬は商業ベンダーから入手可能です。コストは、人間の狂犬病患者が最も多い地域での狂犬病検査の大きな障壁です。CDCはLN34アッセイの多重化形式を開発し、品質管理を改善し、検査サンプルあたりのコストを削減しました。

RT-PCRは他の病原体の検査に広く使われており、結果の解釈が容易なため、狂犬病診断にますます導入されています。しかし、検証済みテストの使用は非常に重要であり、テストが期待通りに動作していることも同様に重要です。当社のステップバイステッププロトコルには、品質管理、安全性の考慮事項、PCRのベストプラクティスが含まれており、検査室の開始を支援します。

まずは、安全メガネ、クローズド式のフロントガウン、手袋2組などの個人用防護具を着用してください。作業面は四級アンモニウム化合物または狂犬病ウイルスを不活化するための他の適切な消毒剤で清掃・消毒してください。作業面にプラスチック製の吸収パッドを敷き、清潔な使い捨てメスで脳幹と小脳の全断面を表現します。

均質化とRNA抽出のためには、使い捨てメスで必要な組織を細かく刻みます。ミンチ組織を綿棒で塗り、均質緩衝液とビーズが入ったチューブに綿棒を移します。外側の手袋を1:256で希釈したQAC消毒液で捨てた後、作業台、機器、サンプルチューブの外側を清掃・消毒します。

ミニビーズビーダーで60秒間均質サンプルを整形します。そしてチューブを目視で点検してください。サンプルを室温で5分間置きます。

最後に、作業台、機器、サンプルチューブの外部をQAC消毒剤で清掃・消毒し、その後RNA抽出に進みます。まず、1:256に希釈したQACを使って生物安全キャビネットの表面除染を行います。ほこりやその他の環境汚染物質を除去するために追加の清掃を行いましょう。

作業台の上にプラスチックの裏地付き吸収作業パッドを敷きます。その後、試薬とサンプルをバイオセーフティキャビネットに並べます。マイクロ遠心分離機用チューブ用に、すべての収集チューブをきれいな環境に配置してください。

各脳サンプルごとに1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブを1本、100%エタノール300マイクロリットルを充填してください。均質化されたシート脳サンプルを10,000〜16,000Gで2分間、卓上マイクロ遠心分離機で遠心分離します。透明なピンク色の上澄液を100%エタノール入りの新しい滅菌チューブに移し、ピペットを上下に動かして600マイクロリットルのエタノール上清液混合物を混合し、収集管内のスピンカラムに移します。

液体がカラムを通過するまで1分間遠心分離し、流れを捨てて各カラムを新しい収集チューブに移します。各カラムに400マイクロリットルのRNAプレウォッシュバッファーを加えます。混合液を10,000から16,000Gで30秒間遠心分離し、流れを捨てます。

各カラムを同じ収集チューブに戻し、プリウォッシュの手順を2回繰り返します。次に、各カラムに700マイクロリットルのRNAウォッシュバッファーを追加します。遠心分離機で10,000から16,000Gを2分間。

そして慎重にRNaseフリーチューブに移します。フロースルーと収集チューブを廃棄し、外側の手袋を外して捨てます。次に、50マイクロリットルのDNaseおよびRNaseフリー水を直接カラムマトリックスに加え、30秒間インキュベーションします。

その後、10,000〜16,000Gで1分間遠心分離機にします。RNAを新しいスクリュートップ・フラットボトムのアクセクションに移し、ラベルの付いたマイクロ遠心分離チューブにRT-PCRアッセイ用に慎重に移してください。まず、マスターミックスの準備空間で、1段階のRT-PCRバッファーを解凍し、テンプレートコントロールなし、ヌクレアーゼフリーの水、プライマー、プローブを氷上に置きます。

ワンステップRT-PCR酵素を氷の上に置きます。LN34多重化およびベータAマスターミックスの各試薬の体積を計算します。LN34多重アッセイ用に96ウェルプレートマップを用いて、各サンプルごとに3倍のウェルを指定します。

渦巻きとスピンの後、割り当てられた各LN34井戸に23マイクロリットルのLN34マルチプレックスマスターミックスを注入します。ネガティブテンプレートコントロール反応を設置するには、各ネガティブテンプレートコントロールウェルにPCRグレードの水を2マイクロリットル加えます。96ウェルプレートを氷の上に置きます。

作業台を70%エタノールで清掃します。現在、テンプレートエディションの作業空間で、人工RNAの氷上のRNAサンプルと陽性対照の単回使用アリコットを解凍します。ボルテックス後、RNAサンプルを短時間遠心分離機に入れ、2マイクロリットルのサンプルまたは陽性対照RNAを対応するウェルにピペットで注入します。

すべてのサンプルを追加した後、光接着カバーをウェルに貼り、完全に密封します。プレートを500Gで室温で1分間遠心分離し、密封されたプレートをFAMおよびVIC Hexレポーターダイに対応したリアルタイムまたは定量PCR機器に入れます。機器を適切なサイクルパラメータに設定してください。

走査終了後、閾値をLN34に0.2、ベータアクチンに0.05に設定されます。コントロールサンプル曲線で品質の問題がないか確認してください。LN34アッセイでは、対数スケールで異なるサイクル閾値で閾値を超える増幅曲線が成功し、陽性の結果が認められました。

また、LN34とベータアクチンの両方の線形スケールでのシグモイド増幅曲線も示しています。陰性の結果は増幅なしで平坦な線を示しました。異常な増幅曲線が確認され、一部は蛍光がシグモイドではなく線形増加を示し、非定型結果を示しました。

対応する多成分プロットでは、予想される滑らかな曲線ではなく、不規則な波状蛍光信号が示されました。サイクル閾値だけに頼るのではなく、増幅プロットを解析する必要性を強調しています。