Name: ラット顎骨髄間葉系幹細胞の単離および培養技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: 学ぶラット顎骨髄間葉系幹細胞の単離法。ニッチベース法で高純度MSCsを短時間に安定して取得し、骨組織工学や再生医療の骨欠損修復研究に応用する。

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この研究は、軍事委員会兵站部(19BJZ22)、北京自然科学基金会(7232154)、および第四ミル医科大学の臨床研究プロジェクト(2021XB025)のヘルスケアプロジェクトの支援を受けました。

このプロトコルは、中国人民解放軍総合病院の施設動物倫理委員会によって承認されました。実験には、13週齢の雄のWistarラットを使用しました。動物、試薬、機器の詳細については、 資料表に記載されています。
1. 実験の準備
<ol><li>眼科用ハサミ、ピンセット、骨管を含むすべての手術器具を高温高圧で滅菌します。</li>
	<li>事前に培地を準備してください。<ol><li>10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むα-MEM完全培地を調製します。</li>
		<li>0.1%II型コラゲナーゼをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で調製します。</li>
		<li>使い捨ての滅菌50mL遠心分離チューブに1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBS50mLを調製します。.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ラットJBMMSCの単離と培養
<ol><li>以下の手順に従って、ラットの下顎骨を分離します。 注:サンプルの無菌性を維持するために、すべての金属製の手術器具は、使用前にアルコールランプの炎で少なくとも3秒間高温で消毒する必要があります。<ol><li>腹腔内注射により、ラットに2%ペントバルビタールナトリウム(2 mL / kg)で麻酔をかけます。.</li>
		<li>麻酔をかけたラットを頸椎脱臼(施設で承認されたプロトコルに従う)で犠牲にします。呼吸数が減少し、筋肉が完全に弛緩した後です。</li>
		<li>ラットを75%エタノールに30分間浸して消毒し、超清潔なテーブルに移します。</li>
		<li>ラットを使い捨ての滅菌布または滅菌容器に置き、仰臥位に保ちます。.</li>
		<li>口角から角筋から枝に沿った関節まで皮膚と筋肉を切開して分離し、さらに顎関節椎間板と両側末梢靭帯を眼科用ハサミで水平に切断することで、関節窩から顆を分離します。 注:下顎骨を動かし、顆の位置を外部から観察することにより、顎関節の位置を決定します。</li>
		<li>下顎の頬側の前庭溝から左右にハサミで外側下顎の筋肉と結合組織を切断し、分離します。</li>
		<li>下顎骨の舌筋を舌小帯から下顎骨の後部まで切開します。</li>
		<li>頭蓋骨から下顎骨を取り外します。</li>
		<li>下顎骨を眼ハサミで下切歯の間の結合を切って、下顎骨を半分に分割します。</li>
		<li>下顎骨に残っている付着した筋肉、筋膜、その他の軟部組織を、眼科用ハサミと鉗子を使用して慎重に取り除きます。</li>
	</ol></li>
	<li>JBMMSC を分離します。<ol><li>切歯と第一大臼歯の近心部分の接合部にロンジャーのくちばしを置き、ロンジャーで下切歯と下顎骨との間の接続を切り取り、下部切歯を完全に抽出します。</li>
		<li>骨ロンジャーですべての大臼歯を取り除きます。</li>
		<li>骨ロンジャーで下顎枝を切除し、下顎骨の中央部分を最後の大臼歯16の遠位端に沿って分離することにより、骨髄腔を露出させます。</li>
		<li>α-MEMコンプリート培地を1mLの使い捨て滅菌シリンジで吸引します。針を骨髄腔に挿入し、骨が白くなるまでα-MEM完全培地で骨髄を培養皿に繰り返し流します。</li>
		<li>骨髄フラッシング溶液を15 mLの遠心チューブに集め、800 x g で室温で3分間遠心分離します。</li>
		<li>上清をピペットで捨て、細胞を10 mLのα-MEM完全培地で再懸濁し、新しい10 cm培養皿にプレートします。</li>
		<li>洗い流した下顎骨をロンゲールで1〜3 mm³の骨スライスに分割し、3 mLの0.1% II型コラゲナーゼで3 mL、200 rpm/minのシェーカー、37°Cで90分間消化します。</li>
		<li>消化した下顎骨を800 x g で室温で3分間遠心分離し、上清を捨てます。</li>
		<li>採取した細胞と消化した骨スライスを、α-MEM完全培地で5%CO2 加湿インキュベーターで37°Cで培養します。</li>
		<li>72時間後に培地の半分を新鮮な培地と交換し、その後2日ごとに完全に交換します。 注:最初の3日間は培養皿を動かさないでください。</li>
		<li>接着細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、1:2の比率で接着細胞を継代します。2回目の継代培養中に骨スライスを取り除きます。P2世代またはP3世代の細胞を実験に用いてください。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 細胞表面マーカーの同定のためのフローサイトメトリー
<ol><li>P2世代のJBMMSCをフローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、濃度を3 × 106 細胞/mLに調整します。</li>
	<li>各微量遠心チューブに100 μLの細胞懸濁液と2 μLのモノクローナル抗体(CD11b/c、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90)を加えます。4°C17,18で30分間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを200 μLのフローサイトメトリーバッファーで2回洗浄し、室温で250 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。</li>
	<li>各チューブに100 μLのフローサイトメトリーバッファーと2 μLのPE標識蛍光二次抗体を添加します。4°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>手順3.3を繰り返します。</li>
	<li>JBMMSCをチューブあたり300-500 μLのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。</li>
	<li>フローサイトメーターを使用してフローサイトメトリー解析を実施します。 注:抗体の非特異的な組み合わせによって引き起こされるバックグラウンド染色を排除するために、相同抗体をネガティブコントロールとして使用します。</li>
</ol>4. 細胞増殖の判定
<ol><li>P3世代のJBMMSCを、ウェルあたり5×103 セルの密度で96ウェルプレートに播種します。</li>
	<li>各ウェルに10 μLのCCK-8溶液を加えます。</li>
	<li>96ウェルプレートをインキュベーターに2時間置き、マイクロプレートリーダーを使用して吸光度(450 nmでのOD値)を測定します。 注意: テストは、7日間連続して毎日同じ時間に実行します。</li>
</ol>5.コロニー形成能力
<ol><li>通路3から1000個のJBMMSCを10cmの培養皿に播種し、5%CO2で37°Cで培養します。</li>
	<li>培地は3日ごとに交換してください。</li>
	<li>クリスタルバイオレット染色は、15日間連続培養した後、行ってください。</li>
	<li>次に、細胞をメタノールで5分間固定し、2%クリスタルバイオレットで5分間染色します。</li>
</ol>6. JBMMSCの多系統化
注:多系統の分化には、P3世代のJBMMSCを使用してください。対照群は、α-MEM完全培地で培養しました。
<ol><li>骨形成分化を行います。<ol><li>6ウェルプレートでウェルあたり1×10個の5JBMMSCを接種します。</li>
		<li>細胞の合流が70%に達したら、培地を骨形成誘導培地に変更します。 注:骨形成誘導媒体は3日ごとに交換してください。</li>
		<li>骨形成導入の7日後にアルカリホスファターゼ(ALP)染色を行います。</li>
		<li>6ウェルプレートから培地を取り出し、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定し、PBSで3回洗浄します。</li>
		<li>ALP染色液で室温で30分間染色し、光から保護します。</li>
		<li>染色液が残らなくなるまで細胞をすすぎ、顕微鏡で試料を観察します。</li>
		<li>骨形成導入の21日後にアリザリンレッド染色を行います。</li>
		<li>細胞を4%パラホルムアルデヒドで30分間固定した後、Alizarin赤色染色溶液で5分間細胞を染色します。</li>
		<li>アリザリン赤色染色液が残らなくなるまで、細胞をPBSで洗浄します。</li>
		<li>カルシウム結節の数を顕微鏡で観察します。</li>
	</ol></li>
	<li>脂肪分化を行います。<ol><li>6ウェルプレートでウェルあたり1個×10個の5 個のJBMMSCを接種します。</li>
		<li>細胞のコンフルエンスが70%に達したら、培地を脂肪形成誘導培地に変更します。 注:脂肪原性誘導培地は3日ごとに交換してください。</li>
		<li>脂肪形成導入の14日後にオイルレッドO染色を行います。</li>
		<li>6ウェルプレートから培地を取り出し、細胞をオイルレッドO固定溶液で20〜30分間固定した後、PBSで3回洗浄します。</li>
		<li>固定液を取り出し、細胞を蒸留水で2回洗浄します。</li>
		<li>細胞を60%イソプロパノールに20〜30秒間浸します。</li>
		<li>60%イソプロパノールを除去し、細胞をオイルレッドO染色で20〜30分間染色します。</li>
		<li>染色液を取り出し、細胞を60%イソプロパノールで20〜30秒間すすぎ、蒸留水で洗浄します。</li>
		<li>核をヘマトキシリン溶液で1〜2分間染色します。</li>
		<li>ヘマトキシリン溶液を取り除き、細胞を蒸留水で2〜3回洗浄します。オイルレッドOバッファーを1分間追加し、取り外します。</li>
		<li>顕微鏡で脂肪滴の数を観察します。</li>
	</ol></li>
	<li>軟骨分化を行います。<ol><li>6ウェルプレートでウェルあたり1個×10個の5 個のJBMMSCを接種します。</li>
		<li>細胞の結合が70%に達したら、培地を軟骨形成誘導培地に変更します。 注:軟骨誘発培地は3日ごとに交換してください。</li>
		<li>軟骨導入の21日後にアルシアンブルー染色を行います。</li>
		<li>6ウェルプレートから培地を取り出し、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定し、PBSで3回洗浄します。</li>
		<li>細胞をアルシアンブルー染色で37°Cで1時間染色します。</li>
		<li>染色液が残らなくなるまで細胞を洗い流し、顕微鏡で観察します。</li>
	</ol></li>
</ol>7. リアルタイムPCR
<ol><li>RNA抽出キットを使用して全RNAを抽出し、酵素マーカーでRNA濃度を測定します(製造元の指示に従ってください)。</li>
	<li>500 ngのRNA19を使用してcDNAを合成します。</li>
	<li>1 μL の cDNA、3.5 μL の二重蒸留水、5 μL の SYBR、および 0.5 μL のプライマーミックス (0.1 μM) を含む 10 μL の qRT-PCR ミックスを使用して、リアルタイムシステムで qRT-PCR を実施します。 注:プライマー配列を 表1に示します。熱サイクル条件は、50 °C で 2 分間、95 °C で 2 分間、続いて 95 °C で 15 秒、60 °C で 2 分間のサイクルを 40 回繰り返し、その後 60 °C から 95 °C まで 0.5 °C で 5 秒間ずつ増やして融解曲線を経ます。</li>
	<li>内部統制としてGAPDHを使用する16.</li>
</ol>

ラット顎骨髄間葉系幹細胞のニッチベースの単離

<ol><li>Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+of+bone+marrow.+Analysis+of+precursor+cells+for+osteogenic+and+hematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.</a> Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).</li>
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<li>Yamaza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+mandible+contains+distinctive+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells.</a> J Dent Res. 90 (3), 317-324 (2011).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+homing+of+glycosylation-modified+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+for+bone+defect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Directional homing of glycosylation-modified bone marrow mesenchymal stem cells for bone defect repair.</a> J Nanobiotechnology. 19 (1), 228(2021).</li>
<li>Hong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+mandibular+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats.</a> J Vis Exp. (162), e61532(2020).</li>
<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+biological+characteristics+of+high-purity+orofacial-bone-derived+mesenchymal+stem+cells+of+the+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Zhongguo+Zuzhi+Gongcheng+Yanjiu%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats.</a> Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 25 (1), 67-72 (2021).</li>
<li>Lee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+from+rat+mandible+to+regenerate+critical+sized+calvarial+defect%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from rat mandible to regenerate critical sized calvarial defect.</a> J Tissue Eng. 10, 2041731419830427(2019).</li>
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骨髄間葉系幹細胞(BMMSC)は、骨髄に存在する非造血幹細胞のサブセットであり、自己複製能力、多方向分化能、および造血の支持機能を特徴としています。これらの細胞は、組織再生、血管新生、細胞活動の調節など、さまざまな生理学的プロセスにおいて極めて重要な役割を果たしている20。その結果、BMMSCは、最適なシード細胞源として、組織修復および再生工学において頻繁に利用されている21。
顎骨髄間葉系幹細胞(JBMMSC)は、2005年に松原らによってヒト顎骨髄穿刺動物から最初に単離され22、他の骨格部位と比較して、顎のユニークな起源と発生経路に起因する独特の分化特性を示す4,23。頭蓋顔面骨を支配する明確な発生的および病理学的メカニズムを考えると、頭蓋顔面骨欠損の修復においてJBMMSCを優先することは、それらの相同な発達特性のために不可欠であるように思われます23。さらに、JBMMSCは、それらの共有された胚組織起源24,25のために、口腔微小環境との組織適合性が高いことを示している。これらの利点にもかかわらず、JBMMSCの標準化された安全な分離プロトコルは依然としてとらえどころがなく、JBMMSCに関する研究は比較的限られています。
BMMSCの単離と培養は、現在標準化されておらず、免疫磁気ビーズソーティング、フローサイトメトリーソーティング、密度勾配遠心分離、全骨髄接着培養などの方法が一般的に採用されています26。このうち、免疫磁気ビーズ法やフローサイトメトリーソーティング法は、細胞表面上の特定の抗原を認識することで細胞を単離します。しかし、これらの方法は面倒な操作を伴い、特殊な器具を必要とし、高純度の細胞を産出するにもかかわらず細胞活性に影響を与える可能性がある27。密度勾配遠心分離法は、遠心分離と成層によって細胞を分離し、細胞の微小環境を変化させ、細胞増殖の遅延と細胞老化の増加につながる可能性がある28。一方、全骨髄付着培養法は、骨髄中の異なる細胞種間での付着能の違いに基づいて、培地を断続的に交換し継代することでBMMSCを分離・精製します。この方法は、細胞に与えるダメージを最小限に抑え、簡単に実行できます16。
大腿骨と比較して、顎のサイズは小さく、骨髄腔が狭く、歯や歯根膜の細胞からの干渉があります。骨髄のフラッシングおよび接着法は、比較的大量の骨髄を必要とし、大型動物およびヒトに適している29。従来の骨髄フラッシング法を適用して抽出されたラットのJBMMSCは、数が少なく、増殖が遅く、品質が悪い30,31。骨髄中のJBMMSCの含有量は非常に低く、主にコンパクトな骨と骨内膜に見られます。Bu-Kyu Lee et al.32は、下顎吸引物を使用してJBMMSCを分離しましたが、下顎骨の骨髄血10 mLの総吸引時間は腸骨稜の5倍長く、下顎骨からのMSCの初期収量は腸骨稜からのそれよりも3倍低かった。骨髄を洗い流すだけでは、コンパクトな骨と骨内膜の細胞を効果的に分離することはできません。
近年、研究により、緻密骨がBMMSCの新しく信頼できる供給源であることがわかり、BMMSC単離の比較的簡単な方法である骨切片消化培養法が導出されている33。この方法で単離されたBMMSCは、高純度34を有する。Guoら35は、骨切片消化培養法を用いて、マウス大腿骨から骨間葉系幹細胞を単離することに成功しました。Yamazaet al.12 およびCheng et al.15 は、マウス下顎骨髄間葉系幹細胞の単離に骨切片消化培養法を適用し、細胞増殖、免疫表現型、および多系統分化によるMSC特性を検証しました。この実験では、フラッシュした全骨髄接着と骨スライス消化の組み合わせを使用して、初代ラットJBMMSCを分離して培養しました。骨髄は、骨髄の元の細胞組成と成長因子を維持するために、濾過せずに空洞から完全に洗い流されました。次に、骨切片を細かく切断し、II型コラゲナーゼを使用して消化して、細胞が骨片から這い上がるのを促進しました。最後に、骨スライスを培養皿に接種し、骨スライスから細胞が這い出るように培養しました。この組み合わせ法により、初代細胞の培養系には、造血幹細胞、海綿骨、皮質骨の成分が同時に含まれ、体内の骨髄間葉系幹細胞の微小環境をよりよくシミュレートでき、細胞の元の生物学的特性を維持するのに役立ちます。したがって、この方法は「ステモネスに関するニッチベースのアプローチ」36と呼ばれています。Luet al.37 はまた、BMMSCの単離における幹細胞ニッチの重要性を強調しましたが、それらは皮質骨のない骨髄の微小環境のみに関与していました。この方法は、マウスの顎38からの骨髄間葉系幹細胞の単離に成功裏に適用されている。
また、このニッチベースのアプローチにより、ラットJBMMSCの単離と培養にも成功しました。まず、単離された細胞は線維芽細胞様の形状を示し、 in vitroでプラスチック製の培養プレートに接着しました。次に、細胞はCD90、CD29、およびCD44表面マーカーを正に発現し、CD45、CD34、およびCD11b/cを負に発現しました。第三に、細胞は骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化する可能性があります。得られた細胞は、良好な形態、速い増殖速度、および分化能力を有し、これは国際細胞療法学会が提唱するヒト由来間葉系幹細胞を同定するための最低基準を満たしていた17。
JBMMSCの単離は、ヒトの細胞を単離するために開発され、使用されています。Matsubara et al.22 は、口腔外科手術中にヒト歯槽骨髄サンプルからJBMMSCを最も早く単離した研究者です。下顎骨の吸引過程では、隣接する組織への損傷、口腔内細菌汚染による感染など、合併症が発生する可能性があります。Zongら39 は、海綿骨標本片の骨髄腔を洗い流してヒトJBMMSCを取得しました。Parkら40 は、インプラント穿孔中に得られた歯槽骨チップからヒトJBMMSCを逐次消化法を使用して分離しました。Mason et al.41 は、顎骨髄コアからヒト JBMMSCS を直接分離し、定期的な歯科インプラント埋入を受けている患者の吸引液から分離しました。吸引物またはコアのいずれかから細胞を単離する成功率が高く、組み合わせの成功率も高かった。しかし、上記の方法ではJBMMSCをヒトから分離することに成功していますが、方法間の有効性の違いを比較する必要があります。現在、この提示された方法はマウスとラットにのみ使用されており、この方法をヒトJBMMSCの単離に適用した研究はありません。この方法には、特に人間に適用する場合、制限があります。まず、骨髄のフラッシングと骨切片の消化を組み合わせるこの方法は比較的複雑で、より多くのステップが必要です。第二に、複雑なプロセスにより、プロトコルにとって重要な操作の無菌性に対する要求が高くなります。第三に、ヒトの顎骨の骨髄腔全体を洗い流すことは不可能であるため、海綿骨片を洗い流すなど、同等の方法を模索する必要があります。
要約すると、この研究では、「幹細胞ニッチ」の原理に基づいて、骨髄フラッシングと骨スライス消化の組み合わせを使用して、ラットJBMMSCを分離および培養することに成功しました。細胞同定の結果、この方法では、十分に高純度のJBMMSCを単離できることが確認され、顎骨組織工学、特に骨欠損修復に十分な細胞源を提供できることが確認されました。

間葉系幹細胞(MSC)は骨髄で最初に発見され、培養中に接着コロニーを形成する能力と強力な骨形成能力を示しました1。Pittingerら2はさらに、骨、脂肪、軟骨に対する多方向の分化の可能性を発見しました。異なる供給源由来のすべての間葉系幹細胞は多方向の分化の可能性を秘めていますが、骨髄間葉系幹細胞は、他の組織に由来する間葉系幹細胞と比較して最も軟骨形成性分化能が高いため、骨組織工学の最良の候補細胞と考えられています3.しかし、多くの研究により、異なる起源のBMMSCは、骨形成分化能力や細胞増殖活性などの部位特異的な特性と特性を示すことが証明されています4,5。これは、顎と付属肢の骨、または腸骨稜6の間の異なる胚葉が原因である可能性があります。
顎骨髄間葉系幹細胞(JBMMSC)は神経外胚葉の神経堤細胞から発生し、大腿骨由来のBMMSCは中胚葉7に由来します。長骨や腸骨稜に由来するBMMSCと比較して、JBMMSCは増殖率、ALP活性、骨形成能が高い8。また、BMMSCの組織や臓器への適用効果は、細胞の種類や環境によって異なる場合がある9。顎の欠損の修復は、主に顎由来の間葉系幹細胞の動員に依存します。したがって、JBMMSCを研究することは、顎骨組織工学10におけるその臨床応用のための実験的基礎を提供することができる。しかし、基礎研究や臨床応用は、主に付属肢骨や軸骨に由来するBMMSCに焦点を当てています11。JBMMSCに関する研究は限られており、これは下顎骨の海綿骨の含有量が少ないことと、ラットの顎の海綿骨含有量がさらに少ないという事実によるものかもしれない12。したがって、付属肢骨または腸骨稜13からBMMSCを単離する際に一般的に使用される通常の骨髄フラッシング法を使用して、顎骨由来骨髄間葉系幹細胞を分離することは困難である。Hongら14 およびChengら15の方法に基づいて、高密度骨消化と骨髄フラッシング法の組み合わせにより、ラットJBMMSCを効率的に分離できるという仮説を立てました。 
本研究は、ラットJBMMSCを効率的に単離する方法を確立し、顎骨組織工学に十分なシード細胞源を提供することを目的としている。

<table><tbody><tr><td>Alizarin Red S Solution 0.2%</td><td>Solarbio</td><td>G1450</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT アルカリホスファターゼカラー現像キット</td><td>Beyotime</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Real-Time System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCK8 Kit</td><td>Dujindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿 10 cm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離チューブ 15 mL&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離チューブ 50 mL&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー3111</td><td></td></tr><tr><td>恒温発振器</td><td>Shanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td><td>ZWY-100H</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD</td><td>FACS C6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>倒立位相差顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>CKX41&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>間葉系幹細胞(ラット)表面マーカー検出キット&nbsp;</td><td>Oricell</td><td>RAXMX-09011</td><td></td></tr><tr><td>多機能マイクロプレートリーダー&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Synergy LX マルチモード</td><td></td></tr><tr><td>オイル レッド O ステイン キット</td><td>Solarbio</td><td>G1262</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 4%</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MACGENE</td><td>CC008</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン 0.25%</td> <td>MACGENE</td><td>CC004</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR グリーン マスター ミックス</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT マスターミックス&nbsp;</td><td>タカラ</td><td>RR036A</td><td></td></tr><tr><td>ラット骨髄間葉系幹細胞脂肪形成分化キット</td><td>オリセル</td><td>RAXMX-90031</td><td></td></tr><tr><td>ラット骨髄間葉系幹細胞軟骨分化キット</td><td>オリセル</td><td>RAXMX-90041</td><td></td></tr>ラット<tr><td>骨髄間葉系幹細胞 骨形成分化キット</td><td>オリセル</td><td>RAXMD-90021</td><td></td></tr><tr><td>RNA抽出キット</td><td>TIANGEN</td><td>DP419</td><td></td></tr><tr><td>スーパークリーンベンチ</td><td>北京Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.</td><td>KLCZ-1220A</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA&nbsp; 0.25%</td><td>MACGENE</td><td>CC012</td><td></td></tr><tr><td>II型コラゲナーゼ</td><td>Solarbio</td><td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>Wistar ラット</td><td>北京Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM培地&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>C12571500BT</td><td></td></tr></tbody></table>

ラット顎骨髄間葉系幹細胞の単離および培養技術

Technique for Isolation and Culture of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

骨髄間葉系幹細胞(BMMSC)は、多方向の分化能を持つ幹細胞の一種です。付属肢骨由来のBMMSCと比較して、顎由来のBMMSCは増殖能力と骨形成分化能力が高く、徐々に顎欠損修復の重要な種子細胞になります。しかし、下顎骨は複雑な骨構造を持ち、付属肢骨よりも海綿状含量が少ない。従来の方法では、高品質の顎由来骨髄間葉系幹細胞を大量に取得することは困難です。この研究は、ラット顎骨髄間葉系幹細胞(JBMMSC)を単離および培養するための「幹細胞性に関するニッチベースのアプローチ」を示しています。初代ラットJBMMSCを単離し、全骨髄付着法と骨切片消化法を組み合わせて培養しました。単離された細胞は、細胞形態観察、細胞表面マーカーの検出、および多方向の分化誘導を通じてJBMMSCとして同定されました。この方法で抽出された細胞は、「線維芽細胞様」の紡錘体形状を示します。細胞は長く、紡錘形で、線維芽細胞様です。フローサイトメトリー解析では、これらの細胞はCD29、CD44、およびCD90に対して陽性であるが、CD11b/c、CD34、およびCD45に対しては陰性であり、これはBMMSCの特性と一致しています。細胞は強力な増殖能力を示し、骨形成性、脂肪形成性、および軟骨形成性の分化を受けることができます。本研究は、分化能の高い高品質なJBMMSCを短期間で十分に得るための効果的かつ安定した方法を提供し、生体機能の探索、再生医療、および関連する臨床応用のさらなる研究を促進する可能性があります。

細胞接種の72時間後、ほとんどの細胞は懸濁して丸い形をしており、壁に付着している細胞はほとんどありませんでした(図1B)。5日目までに、接着性細胞コロニーが出現し、紡錘体または線維芽細胞様の形状を示しました(図1C)。7日目までに、接着細胞は90%のコンフルエントに達し、少数の間欠的な懸濁細胞で「魚の群れ」の形を形成しました(図1D)。継代した細胞は急速に増殖し、3日ごとに継代されました。細胞形態は比較的均質で、主に紡錘形であり、コンフルエント後に渦状に配列されていました(図1E-G)。
フローサイトメトリー解析の結果、間葉系幹細胞表面マーカーCD90、CD29、CD44の発現レベルが高く、陽性率はそれぞれ97.2%、97.7%、95.7%であることが明らかになりました。逆に、造血幹細胞表面マーカーCD45、CD34、およびCD11b/cは、それぞれ1.37%、0.66%、および1.49%の陽性率で、低発現を示しました(図2A)。2週間の培養後、JBMMSCは、クリスタルバイオレット染色によって証明されるように、コロニー形成を示しました(図2B)。彼らはin vitroで安定した増殖能力を示し、細胞増殖曲線は典型的な「S様」パターンをたどりました(図2C)。細胞増殖過程には、潜伏期、対数増殖期、プラトー期がありました。急速な成長は2日後に始まり、6日後には減速しました。個々の細胞は、自己複製と増殖の特徴を示しました。
細胞は7日目に 青紫色のALP染色粒子を示し、21日目に 赤色の石灰化結節を示しました。さらに、脂肪形成誘導の14日後、細胞は赤いビーズ状の脂肪滴を示し、軟骨形成分化誘導は青色の軟骨様組織の形成をもたらしました(図3A)。さらに、骨形成誘導の7日後、JBMMSCにおけるALP、OCN、およびRunx2のmRNA発現レベルは上昇しました15 (図3B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66765/66765fig01.jpg"> 図1:JBMMSCの分離と培養 (A)プロトコルの概要。(B-D)初代培養でそれぞれ3日間、5日間、7日間培養した細胞の画像。(E-G)P1、P2、P3 セルの画像。スケールバー:100μmこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66765/66765fig01large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66765/66765fig02.jpg"> 図2:JBMMSCの同定 (A)ラットJBMMSCのフローサイトメトリー解析結果 フローサイトメトリー解析の結果、これらの細胞はCD29、CD44、CD90に対して陽性であり、BMMSCの特性と一致することが明らかになりました。逆に、CD11b/c、CD34、CD45は陰性であった。(B)クリスタルバイオレット(スケールバー:100μm)で染色されたJBMMSCsコロニーの代表的な画像。(C)細胞増殖曲線は細胞増殖速度を示した。データとエラーバーは、平均±標準偏差n = 3を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66765/66765fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66765/66765fig03.jpg"> 図3:JBMMSCの多系統(骨形成性、脂肪形成性、軟骨形成性)の分化 (A)骨形成誘導の7日後、ALP活性の増加が観察されました。骨形成導入後21日で、多数の石灰化結節がアリザリンレッド染色で赤く染色されました。オイルレッドO染色では、かなりの数の脂肪滴が明らかになりました。アルシアンブルー染色は、軟骨誘発後に軟骨細胞に誘導された細胞を強調しました。(B)骨形成誘発術後、JBMMSCの骨形成関連遺伝子ALP、OCN、Runx2のmRNA発現を7日間実施。(***P &lt; 0.001、 対対照群)。データとエラーバーは、平均±標準偏差n = 3を示します。スケールバー:100μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66765/66765fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>遺伝子</td>
			<td>プライマー配列 (5'-3')</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">ガドフ</td>
			<td>F: ACCCAGAAGACTGTGGATGG</td>
		</tr><tr><td>R: CACATTGGGGGTAGGAACAC</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">アルプ</td>
			<td>F: CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA</td>
		</tr><tr><td>R: CCTTGTAACCAGGCCCGTTG</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">OCNの</td>
			<td>F: GGTGGTGAATAGACTCCGGC</td>
		</tr><tr><td>右:GCAACACATGCCCTAAACGG</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Runx2 さん</td>
			<td>F: GCACCCAGCCCATAATAGA</td>
		</tr><tr><td>R: TTGGAGCAAGGAGAACCC</td>
		</tr></tbody></table>表1:リアルタイムPCRで使用されるプライマー。

顎骨髄由来の間葉系幹細胞は、多様な分化、自己複製、免疫調節に重要な機能を持っています。それらは、遺伝子治療、組織工学、および再生医療における前駆細胞の重要な貯蔵庫として浮上しています。ここでは、ラットの顎骨髄間葉系幹細胞を単離する独自の方法を紹介します。

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学ぶラット顎骨髄間葉系幹細胞の単離法。ニッチベース法で高純度MSCsを短時間に安定して取得し、骨組織工学や再生医療の骨欠損修復研究に応用する。

ラット顎骨髄間葉系幹細胞の単離および培養技術

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