Name: 針の開口部のフィードバックのための一定の空気圧を利用したマイクロインジェクション針の湿式面取り (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学ぼう、一定の空気圧を利用した湿式面取り法でマイクロインジェクション針を鋭利に仕上げる技術を。ホウケイ酸ガラス製針の開口部サイズを精密に制御し、遺伝子組み換え昆虫研究の効率を向上させる。

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<meta charset="utf8"></head><body>一定の空気圧下でのマイクロインジェクション針の湿式面取りのプロトコル

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+Element+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+systems+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation systems in insects.</a> Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+Transgenesis%3A+Methods+and+Applications%22">Insect Transgenesis: Methods and Applications</a>. , CRC Press. Boca Rato. (2000).</li>
<li>Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).</li>
<li>Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable%2C+germ-line+transformation+of+Culex+Quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).</li>
<li>Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+transgenesis+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transformation+of+the+South+American+malaria+vector%2C+Anopheles+albimanus%2C+with+a+piggyBac%2FEGFP+transposon+vector+is+routine+and+highly+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.</a> Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+The+immune+deficiency+pathway+impacts+vector+competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major.</a> mBio. 10 (4), e01941(2019).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html">https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html</a> (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.0 mm O.D. マイクロキャピラリー</td><td>ワールド精密機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベベラー 台座オイル</td><td>サッター機器</td><td>008</td><td></td></tr><tr><td>自転車 フェンダー クリップ</td><td>VeloOrange</td><td>Rクリップ 4パック</td><td>https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack</td></tr><tr><td>ブームスタンド 顕微鏡</td><td>AmScope</td><td></td><td>AMScope 3.5X-90X 三眼 LED ブームスタンド ステレオ顕微鏡または</td></tr><tr><td>同等品 BV-10 ベベラー</td><td>サッターインスツルメント</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンド砥粒板&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>104F</td><td>Diamond Abrasive Plate - extra fine (0.2 &micro; to 1.0 &micro; tip sizes)</td></tr><tr><td>ガスケット, Buna-N</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>11761-2-pkg</td><td>T&nbsp; または L コネクタの接続をシールするために使用されます。これらの部品にまだ含まれていない場合は</td></tr>、<tr><td>Hose Clamp</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>5000-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>ホースコネクタ</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>CT4-pkg</td><td>5ホースコネクタが必要</td></tr><tr><td>マイクロインジェクション ニードルホルダー</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ</td><td>MPH3-10</td><td>外径1mmのマイクロキャピラリー用ニードルホルダー</td></tr><tr><td>P-2000</td><td>サッターインスツルメンツ</td><td></td><td>任意のニードルプーラー</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 Solution</td><td>B&H 写真、ビデオ、オーディオ</td><td>BH #KOPF200P&nbsp;MFR#1464510</td><td>湿潤剤</td></tr><tr><td>圧力計</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>PG-100</td><td>0-100 psi ゲージ</td></tr><tr><td>基準芯</td><td>サッター計器</td><td>X050300</td><td></td></tr><tr><td>基準芯ホルダー</td><td>サッター計器</td><td>M100019</td><td></td></tr><tr><td>レギュレータ</td>ー <td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>01-Mar</td> Danco Model # 59849 T fitting Clippard Instrument Laboratory, Inc. の<td>接続に #10-32 ポートが必要</td></tr><tr><td>ゴム パッキン シート 6 inx 6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>15002-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>ねじ付きバー</td><td></td><td></td><td>ねじ付きロッドまたはねじ付き端部付きバーのいずれか。スレッドは 10 から 32 である必要があります。</td></tr><tr><td>ウレタンチューブ</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>URH1-0804-BLT-050</td><td></td></tr></tbody></table>

針の開口部のフィードバックのための一定の空気圧を利用したマイクロインジェクション針の湿式面取り

Wet Beveling of Microinjection Needles Utilizing Constant Air Pressure for Feedback on Needle Opening

上記の手順により、一貫して鋭いマイクロインジェクション針が得られます。鋭利な針は、蚊の胚などの柔らかい絨毛膜昆虫の胚に、胚膜からの抵抗がほとんどまたはまったくないのが特徴です。蚊の胚を遺伝子組み換えのためにマイクロインジェクションすると、胚の膜は比較的弾力性があります。鈍い針を胚の膜に押し付けると、胚の膜がへこみます(図4B)。針を引っ張ると、メンブレンは元の形状に戻ります。十分な圧力がかかると、鈍い針は最終的に膜を引き裂き、胚形質が漏れ出す可能性があります。針が鋭いほど、針が胚の膜に押し付けられるときに発生するくぼみは少なくなります(図4E)。膜を引き裂く代わりに、鋭い針が膜をすり抜け、胚にほとんどまたはまったく損傷を与えません。理想的な針を使用すると、針が胚に滑り込むときに胚膜のへこみがほとんどなくなります。
メリーランド大学昆虫変換施設(UM-ITF)は、学界や産業界のクライアント向けに遺伝子組み換え昆虫を作製するサービス施設です。この施設では、蚊の胚のマイクロインジェクションに斜めの針を使用しています。2023年1月から2023年12月までの期間に、UM-ITFは56のクライアントプロジェクトに12,795個のネッタイシマカの胚を注入した(表1)。面取り針の使用により、UM-ITFはプロジェクト全体で注射後の平均ハッチを31%に維持することができました(表2)。さらに、UM-ITFは、プロジェクト後のクライアントへのフォローアップによって決定される96%の注入成功率を維持することができた(表2)。注入の成功は、注入された注入材料(CRISPRガイド、Cas9タンパク質、トランスポゾンベクタープラスミドなど)が、これらの材料が遺伝子改変を作成できる方法でプロジェクトの胚に送達されたかどうか、基本的には、CRISPR Indelの作成、クライアントのトランスポゾンベースのベクターの挿入、または注入品質管理ベクターの挿入(トランスポゾンはプロモータープラスマーカーで終わる)の証拠があったかどうかの尺度です。言い換えれば、注射された成分が適切に機能していた場合、注射は遺伝子組み換えを引き起こすのに十分だったのでしょうか。遺伝子組み換えプロジェクトの成功には多くの要因がありますが、鋭い針を使用した高品質のマイクロインジェクションが成功の鍵となります。上記のプロトコルに記載されている手順を使用して針を面取りすることにより、UM-ITFは一貫して高品質のシャープなマイクロインジェクション針を製造できるため、UM-ITFは一貫して成功した注射を行うことができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig01.jpg"> 図1:エアシステムコンポーネントとマイクロキャピラリーへの接続の概略図。 空気は、空気供給(家庭用空気またはエアシリンダー)からウレタンチューブのシステムを介して毛細管に供給されます。ウレタンチューブは、ホースコネクタとホースクランプからなるホース接続部(HC)によりレギュレーター(R)と圧力計に接続されています。ホース接続は、レギュレーター(R)と圧力計のベースにある10-32スレッドメス接続にねじ込まれます。レギュレーター(R)にはTコネクタ(T)が接続されており、圧力計とニードルホルダー(NH)の間に空気をこぼします。ウレタンチューブは、ニードルホルダー(NH)に付属のルアーコネクター(LC)によってニードルホルダーに接続されています。エアサプライへの接続は、使用するエアサプライによって異なります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig02.jpg"> 図2:マニピュレーターの部品とエアのセットアップ。 マニピュレーター部品:a.粗調整ノブ、b.微調整ノブ、c.キャリパー、d.WPIニードルホルダー、e.角度ゲージ、f.リテーニングクランプと自転車フェンダークリップ、g.ルアーアダプターとルアーホースコネクター、h.ウレタンチューブ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig03.jpg"> 図3:研磨板の回転に対する針の配置 (A)面取り時の適切な針の配置。面取りする針は、回転に垂直で回転と一直線に向き合った回転研磨板上に配置する必要があります。回転は針の先端から離れます。(B)不適切な針の配置。この方向での研磨板の回転では、研磨板の表面が針先の下や針先を過ぎるのではなく、針先に押し付けられます。この向きでは、面取りがスムーズに行われない場合があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig04.jpg"> 図4:非鋭針と鋭針による針挿入の比較(A-C)非鋭針と(D-F)鋭針。(A)および(D)は、針が胚と接触する前に捕捉されました。(B)と(E)は針が胚膜を貫通する直前の点、(C)と(F)は針が刺さった直後の点です。(B)の白い矢印は、鋭利でない針を突き刺すためにより大きな圧力を加える必要があるため、胚膜がへこんでいることを示しています。(E)の黒い矢印は、針が鋭いため、針のピアスが簡単に行われるため、くぼみがないことを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:2023年1月から2023年12月までのUM-ITF Aedesのプロジェクト UM-ITF ネッタイシマカマイクロインジェクションプロジェクトのリストと、各プロジェクトに注入された胚の数、これらの注入された胚から孵化した幼虫の数、および注入された胚ごとに孵化した幼虫の割合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:UM-ITF Aedesプロジェクトの結果。 UM-ITFは、昆虫の遺伝子改変のためのマイクロインジェクションサービスを提供するサービス施設です。この表は、2023年1月から2023年12月までにITFが注入したAedesプロジェクトの数を示しています。プロジェクトのフォローアップ要求に応答し、その応答がインジェクションプロジェクトの成功または失敗を示したクライアントの数。成功したプロジェクトの数、成功したプロジェクトは、注射材料が発生中の胚にマイクロインジェクションされ、注射が遺伝子改変を生成できるようにしたものであり、遺伝子組み換えがないために成功しなかったと見なされたプロジェクトの数。2023年1月から2023年12月までの期間におけるネッタイシマカのマイクロインジェクションプロジェクトの平均孵化率。プロジェクトの成功率とクライアントの応答率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/table%202_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Microinjection needles are a critical tool in the delivery of genome modification reagents, CRISPR components (guide RNAs, Cas9 protein, and donor ...

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: ポーランド、R. et al.動機付け行動の分子基質を研究するためのげっ歯類脳マイクロインジェクション。J. Vis.

覚醒したげっ歯類の脳への治療薬のマイクロインジェクションベースの送達

出典: Vanegas, M. I., et al.薬物注入と電気生理学を組み合わせたマイクロインジェクトロードシステムJ. Vis.

マイクロ流体ベースのマイクロインジェストロードシステム(薬物注入と電気生理学の複合)

出典: Paolone, G., et al.げっ歯類脳におけるマイクロインジェクションのための個別化針J. Vis.

石英マイクロニードルを使用したげっ歯類脳マイクロインジェクション

げっ歯類は、行動の分子基質や複雑な精神障害を調査するための適切なモデルです。覚醒しているげっ歯類の脳マイクロインジェクションは、疾患基質の解明に使用できます。効率的でカスタマイズ可能な脳マイクロインジェクション法と、モチベーションを定量化するオペラントパラダイムの実行が提示されます。...

動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

ここで水晶針を使用して齧歯動物の脳でのマイクロインジェクションのプロトコルについて述べる。これらの針は検出可能な組織の損傷を生成しないし、深部にも信頼性の高い配信を確保します。さらに、彼らはお好みのデザインで研究のニーズに合わせることができるし、再利用することができます。...

パーソナライズされた齧歯動物の脳でのマイクロインジェクション針

どのように FRAP など photoactivation のマイクロ ・ photomanipulation...

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

ゼブラフィッシュは、光学的透明度、急速な外部の開発を含む多くの貴重な機能を持ち、聴力と平衡感覚のフィールドに、特定の重要な感覚の有毛細胞に位置する外部モデル システムです。この資料について説明どのようにトランスジェニックゼブラフィッシュ...

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

電気生理学用に設計されたマイクロインジェクストローデシステムと、オプションの薬物注入による実験プローブ(ナノセンサ、マイクロ電極)の送達を支援します。広く利用可能なマイクロ流体成分は、プローブを含むカニューレに結合される。マイクロインジェクストロード構築のためのステップバイステッププロトコルが含まれており、マカク皮質におけるムスシモール注入中の結果が含まれています。...

複合薬物注入と電気生理学のためのマイクロインジェクストローデシステム

CRISPR/Cas9は、非モデル生物の遺伝子機能を特徴付けるためにますます使用されています。このプロトコルは、注射ミックスの調製から蚊の胚の取得と注入に、および必要な突然変異のために注入された蚊とその子孫を飼育、横断、およびスクリーニングする方法に 、Culex...

CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

ここでは、の細胞質マイクロインジェクションを示しています...

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

学ぼう、一定の空気圧を利用した湿式面取り法でマイクロインジェクション針を鋭利に仕上げる技術を。ホウケイ酸ガラス製針の開口部サイズを精密に制御し、遺伝子組み換え昆虫研究の効率を向上させる。

針の開口部のフィードバックのための一定の空気圧を利用したマイクロインジェクション針の湿式面取り

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