Name: ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 学ぶミトコンドリア単離法で少量サンプルから呼吸スーパーコンプレックスを解析する手法。OXPHOS系の可塑性モデル構築と疾患研究への応用を理解できます。

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この研究は、Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) からの助成金番号「PGC2018-095795-B-I00」、およびアラゴン州立行政局 (DGA) (https://www.aragon.es/) からの助成金「Grupo de Referencia: E35_17R」および助成金番号「LMP220_21」から PF-S および RM-L への支援を受けました。

超複合体分析のための小さな組織サンプル中のミトコンドリア分画

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

著者は、利益相反を宣言しません。

ここで説明するプロトコルで導入された方法論的適応は、ミトコンドリアの複雑な活性を維持しながら損失を回避し、収量を増加させることを目的としています(これは、十分な量のサンプルの利用可能性が損なわれた場合に重要です)そして、組織または細胞株の予想されるSCのパターンを再現することを目的としています( 図2Cを参照)).この目的により、SCを適切に検出するために高いミトコンドリア純度が必要ないため、可能な限りステップ数、回数、および体積が削減されました。
したがって、低速遠心分離による核および未破壊細胞の均質化および除去後、ミトコンドリアを含む上清を1.5mLポリプロピレンチューブに移し、その後の遠心分離を行って粗ミトコンドリア画分を得るためのマイクロフュージで、従来のプロトコルと比較して速度を上げ、時間と体積を減らします。これにより、比較的短時間で複数のサンプルを処理することができます:綿密な見積もりでは、10個のサンプルを~2-2.5時間で処理できます(均質化の開始(プロトコルステップ1.6.または組織の場合と同等)から、ゲルにロードする準備ができているSCsフラクションの取得(プロトコルステップ3.7)および活性を維持しながら損失を最小限に抑えます。元のSchäggerのグループプロトコールに関する別の変更は、SCsフラクションの取得のための膜可溶化後、単純なマイクロフュージ遠心分離(プロトコルステップ3.4)による超遠心分離ステップを置き換えることです。
この手順には、いくつかの重要な手順があります。まず、細胞破壊の効率、特に培養細胞の場合(プロトコールステップ1.8の後の注を参照)、特に小細胞の場合。組織および細胞株は、細胞破壊の難易度がさまざまである:例えば、心臓および筋肉では、このステップは通常、肝臓または脾臓よりも効率が悪いが、前者はミトコンドリア含量が高いため、収量で補われる。筋肉や心臓から単離した場合にミトコンドリアの収量を改善するための1つの代替手段は、均質化前にサンプルをトリプシンで処理することです。脳は、手作業による均質化が軽度で効率が悪いため、また、以前に報告されているように、この組織の細胞型の変動が大きいため、細胞破壊の効率が低い別の組織である 42。これは、私たちのプロトコルで提案されているように、2番目の均質化ステップ(ステップ2.7.4)によって部分的に補償できます。一方、細胞の破損が過度に多い場合、SCを含む最終サンプルは核DNA断片で汚染され、電気泳動の進行を妨げる可能性があります。この問題は、ジギトニンを添加してミトコンドリア膜を可溶化すると、試料の粘度が上昇することを示しており、DNAse Iによる処理で解決できます。
次に、界面活性剤とタンパク質の比率が低すぎると、膜の可溶化効率が低下し、凝集体が形成される可能性があります。これは、ゲルにおいて、高分子量SCにおける分解能の低さ( 図4参照)またはオリゴマー43に対応する複数のバンドを与えるCIVとして現れる可能性がある。比率が高すぎると、SC(主にCI-SC)の細分化につながる可能性があります。第三に、手順全体( 図4を参照)でサンプルを加熱しないようにし、凍結融解の繰り返しサイクルを避けることが重要です。
表2に、いくつかの細胞タイプと組織サンプルの予想収量の要約を示します。値は概算であり、セルの破損効率とソースの性質によって異なります。組織の場合、出発物質が凍結されている場合、新鮮なサンプルよりも高い収率が得られる傾向があります。ロード可能なレーン数の推定値(レーンあたり50〜60μgのミトコンドリアタンパク質の負荷を考慮)が示されています。
ここで紹介するプロトコールは、さまざまな組織や細胞タイプを小さなバリエーションでカバーしており、新鮮なサンプルや凍結サンプルで使用でき、高価な精製キットやグラジエントを使用せずに、シンプルな機器と比較的低コストで済みます。ただし、特定の細胞タイプやサンプルで使用するため、また、たとえば脳シナプスミトコンドリアや筋肉のサルコレンマルミトコンドリアなどの特定のミトコンドリア集団が分析の対象である場合には、いくつかの適応が必要になる場合があります。
正確な生理学的役割と病理学的状況へのSCの潜在的な関与はまだ定義されていないため、SCのダイナミクスとそれらの組み立て、安定性、および機能に影響を与える要因の分析が必要です。我々のプロトコールは、特に複数の実験条件を比較する必要がある場合に、小さなサンプルサイズで、さまざまな細胞タイプや組織から、SCパターンで再現性のある結果を得ることを可能にする貴重なツールとなり得る。

スーパーコンプレックス(SC)は、個々の呼吸鎖複合体1,2間の超分子的会合である。Schägger 2,3のグループによるSCの最初の同定とその組成の説明以来、SCは異なる化学量論で呼吸複合体I、III、およびIV(CI、CIII、およびCIV)を含むことが確立されました。SCの2つの主要な集団、CIを含むもの(およびCIII単独またはCIIIとCIV)で、非常に高分子量(MW、小さいSCで~1.5MDaから開始:CI + CIII2)と、CIIIとCIVを含み、CIVを含まないもの、はるかに小さいサイズ(~680kDaのCIII2 + CIVなど)の2つの主要な集団を定義することができます。これらのSCは、ミトコンドリア内膜に遊離複合体と共存し、これも異なる割合で存在します。したがって、CIは主にその関連型(つまり、SCで:ウシの心臓で~80%、多くのヒト細胞タイプで90%以上)3で見られますが、CIVは遊離型で非常に豊富(ウシの心臓で80%以上)であり、CIIIはよりバランスの取れた分布を示しています(より豊富な遊離型で~40%、 二量体として、ウシの心臓で)。
彼らの存在は現在一般的に受け入れられていますが、その正確な役割はまだ議論の余地があります4,5,6,7,8,9,10。可塑性モデルによれば、細胞タイプまたは代謝状態1,7,11に応じて、SCおよび個々の複合体の異なる比率が存在することができる。このアセンブリの動的な性質により、細胞は利用可能な燃料の使用と、環境変化に応答した酸化的リン酸化(OXPHOS)システムの効率を調節することができる4,5,7。SCはまた、活性酸素種の生成速度を制御し、個々の複合体4,12,13,14の安定化および代謝回転に関与することにも貢献できる。SCアセンブリ状態の変形は、異なる生理学的および病理学的状況15,16および老化プロセス17に関連して記載されている。
したがって、SCパターンの変化は、増殖に用いる炭素源に依存する酵母2およびグルコースがガラクトース4に置換されたときの培養哺乳動物細胞において記載されている。修飾は、絶食後のマウスの肝臓8およびミトコンドリア脂肪酸酸化がブロックされたときのアストロサイトでも報告されています18。さらに、SCおよびOXPHOSの減少または変化は、バルト症候群19、心不全20、いくつかの代謝21および神経学的22,23,24障害、および異なる腫瘍25,26,27,28で発見されています.SCアセンブリとレベルのこれらの変化が主要な原因であるか、またはこれらの病理学的状況における二次的な影響を表しているかどうかは、まだ調査中です15,16。さまざまな方法論により、SCの組み立てと機能に関する情報を得ることができます。これらには、活動測定8,29、超微細構造解析30,31、およびプロテオミクス32,33が含まれます。ますます採用されつつあり、前述のいくつかの方法論の出発点となっている有用な代替手段は、Schäggerのグループ34,35によってこの目的のために開発されたBlueネイティブ(BN)電気泳動によるSCアセンブリの状態の直接決定です。
このアプローチでは、ミトコンドリア膜を取得して可溶化するための再現性のある効率的な手順が必要であり、ゲル内活性分析(IGA)、2次元電気泳動、ウェスタンブロット(WB)などの他の手法で補完できます。BN電気泳動によるSCダイナミクスの研究における制限は、開始細胞または組織サンプルの量である可能性があります。Schäggerのグループ法から適応されたSCアセンブリと機能の分析のための一連のプロトコルを提示し、わずか20 mgの組織から始まる新鮮または凍結の細胞または組織サンプルに適用できます。

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>アミノカプロン酸</td><td>フルカ アナリティカル</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>ビス トリス</td><td>アクロンス オーガニックス 327721000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォードアッセイ</td><td>バイオラド</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>クーマシー ブルー G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>クーマシーブルー R-250</td><td>メルク</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>シトクローム c</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>ジアミノ&nbsp; ベンジジン (DAB)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D5637</td> ジグマ-アルドリッチ D5637 <td></td></tr><tr><td>ジグマ-</td><td>アルドリッチ</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>脂肪酸フリー BSA</td><td>ロシュ</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー テフロン乳棒</td><td>デルタラボ</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1モノクローナル抗体</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Running Buffer (20x)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 モノクローナル抗体</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>ニトロブルーテトラゾリウム塩 (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>PDVF 膜</td><td>アマシャム</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>フェナジンメタスルフェート (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA モノクローナル抗体</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>コハク酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン/ペニシリン</td><td>PAN バイオテクノロジー</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 モノクローナル抗体</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp;SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (small tissue and cell culture samples) 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

過去数十年にわたって、呼吸超複合体(SC)の存在に関する証拠が蓄積され、ミトコンドリアの電子伝達鎖組織に対する私たちの理解が変わり、「可塑性モデル」の提案が生まれました。このモデルは、組織または細胞の代謝状態に応じて、SCと複合体の異なる比率の共存を仮定しています。SCにおけるアセンブリの動的な性質により、細胞は利用可能な燃料の使用と電子移動の効率を最適化し、活性酸素種の生成を最小限に抑え、環境変化に適応する細胞の能力を促進することができます。 
最近では、神経変性疾患(アルツハイマー病およびパーキンソン病)、バース症候群、リー症候群、癌などのさまざまな疾患でSCアセンブリの異常が報告されています。疾患の進行におけるSCアセンブリの変化の役割は、まだ確認する必要があります。それにもかかわらず、SCアセンブリの状態を判断するのに十分な量のサンプルが入手可能であることは、しばしば課題となります。これは、生検や組織サンプルが小さい、または複数の分析のために分割する必要がある、成長が遅い細胞培養やマイクロ流体デバイスに由来する細胞培養、一部の一次培養物や希少細胞、または特定の高価な治療の影響を分析する必要がある場合(ナノ粒子、非常に高価な化合物など)に発生します。このような場合には、効率的で適用しやすい方法が求められます。この論文では、少量の細胞または組織から濃縮されたミトコンドリア画分を取得し、天然電気泳動とそれに続くゲル内活性アッセイまたはウェスタンブロットによるミトコンドリアSCの構造と機能を分析するための適応法を示します。

上記のプロトコルに従って得られるミトコンドリアの収量は、細胞株または組織の種類、サンプルの性質(すなわち、新鮮組織または凍結組織を使用する場合)、または均質化プロセスの効率などのいくつかの要因によって異なります。さまざまな細胞株および組織からのミトコンドリアの予想収量を 表2に示します。ミトコンドリア画分が得られたら、次のステップは呼吸器SCパターンの分析であり、これは粗ミトコンドリアサンプルの可溶化とBN-PAGEによる電気泳動分離、続いてIGA分析またはWB免疫検出の後に行われます。 図1 は、培養細胞株とマウス肝臓ミトコンドリアサンプルの標準的なクーマシー染色後のラン直後の未染色ゲルレーンの様相とバンドのパターンを示しています。
図2A、Bでは、IGAアッセイを使用した後のヒト細胞とマウス細胞のSCアセンブリパターンの間に明確な違いが観察できます。したがって、遊離複合体Iはマウス細胞では観察されますが、ヒトミトコンドリアでは検出されません。複雑なIV-IGAパターンは、両方のヒト細胞株(図2B)で非常に類似していますが、図2Aで分析した2つのマウス細胞株間に違いがあります。これらの違いは、BL6細胞がSCAF18の変異型を発現するという事実によるものです。
SCパターンは、ここで説明するミトコンドリア単離のプロトコルで得られた、小さなサンプルで機能するため、より大きなサンプルに使用される「従来の」プロトコルに関して維持されます。これは、レーン1および6(3gの肝臓および1.1gのBATからの従来のプロトコルを用いてミトコンドリア単離後に得られた)を、それぞれ、レーン2および5(本明細書で提示されたプロトコルを用いて約0.1gの両組織から得られた)と比較することにより、 図2Cで見ることができる。可塑性モデルで提案されているように、呼吸複合体とSCの相対的な割合は、細胞の種類と代謝状態によって異なります。 図2C、Dに示すように、異なる組織は異なるSCアセンブリパターンを示しています。したがって、脳のミトコンドリアは、他の組織と比較した場合、遊離複合体Iのレベルが非常に低く、SCの割合が高く、BATはCVのレベルが低く(図2A)、SC III+IVの量が多い(図2D)という特徴があります。心臓のミトコンドリアは高レベルのSCとCVを示します.CVアセンブリパターンは、培養細胞株とマウス肝臓のミトコンドリアサンプルと非常によく似ています(図2E)。
SCアセンブリは、 図3 に示すように、脾臓制御細胞と腫瘍細胞から得られた2つのサンプルについて、WBによっても分析できます。この場合、通常、30〜50μgのミトコンドリアタンパク質は、特定の抗体を持つさまざまな複合体やSCを検出するのに十分です。 図 4 は、これらのプロトコルの適用中に発生する可能性のある主な落とし穴の一部を示しています。ゲルのグラジエントを間違えると、 図4Aのレーン1のように、ゲル中のアクリルアミド濃度が通常よりも高いため、SCがレーン上部のウェルの近くに留まる、異常で望ましくない移動パターンが生じる可能性があります。比較的短時間であっても、サンプルを高温(ここでは37°Cおよび40°Cで10分間)でインキュベートすると、SCおよびCIが劣化します(図4A レーン2-4)。同様に、界面活性剤とタンパク質の比率は、良好な結果と適切なゲル分離のために重要です。ジギトニン1g当たりタンパク質1gの比率が2g未満では、バンド分解能は徐々に低下し、低濃度(0.5g/g)では、SCに対応する領域の塗抹標本のみが見える(図4B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> 図1:培養細胞株(L929Balbc)とマウス肝臓からのジギトニン透過性ミトコンドリアのBNGE分離後のミトコンドリア複合体とスーパー複合体のパターン。 左側のレーン(1および2)は、CVのみが検出可能なラン直後の未染色ゲルの側面を表し、右側のレーン(3および4)は、クマシー染色後のバンドのパターンを示しています。略語:BNGE = Blue Native gel electrophoresis;CV =複素数V;SCs = スーパーコンプレックス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> 図2:異なる細胞株およびマウス組織から単離されたミトコンドリアのIGA解析 (A,B)(A)マウスまたは(B)ヒト細胞株から単離されたミトコンドリアにおける示された複合体のゲル内活性。L929Balbcは、前述の40,41のように、Balb/cJマウス血小板からL929neo細胞にミトコンドリアを移すことにより、当研究室で作製した伝染性細胞株である。BL6線維芽細胞は、BL6マウスの耳生検から当研究室で作製した不死化細胞株です。(C)マウスミトコンドリアからのCI−IGAパターンは、3gの肝臓(レーン1)および1.1gのBAT(レーン6)から始まる従来の方法、またはここで提示され、すべての場合において約0.1gの組織(レーン2、肝臓、レーン3、心臓、レーン4、脳、およびレーン5BAT)のいずれかを使用して単離された。(D)マウスの肝臓、心臓、脳、およびBATミトコンドリアにおけるCIV-IGAパターン(パネル2C、レーン2-5に示すCI-IGAの後に実行)。(E)マウス培養細胞および肝臓におけるCV-IGA活性の解析。レーンあたり約60〜75μgのミトコンドリアタンパク質をロードしました。略語:IGA =ゲル内活性;SCs = スーパーコンプレックス;CI = 複素数 I;BAT =褐色脂肪組織。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> 図3:脾臓サンプル中のさまざまなミトコンドリア複合体とスーパー複合体のWB免疫検出。脾臓コントロール(Spleen M9)および腫瘍(Tumor M9)サンプルから得られたミトコンドリア複合体とSCのBlue Native PAGE分離後、それらをPVDFメンブレンに移し、示されたCI、CIII、CIV、およびCIIサブユニット(それぞれパネルA-D)を認識する抗体と順次ハイブリダイズしました。レーンあたり約50 μgのミトコンドリアタンパク質をロードしました。アスタリスクは、前のウェスタンブロットから残っているシグナルを示します。略語:SC =スーパーコンプレックス;CI = 複素数 I;CIII = 複素数 III;CIV = 複素数 IV;CII = 複素数 II.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> 図4:Blue-Native PAGEによるSC分析の落とし穴。 CI IGAは、異なる可溶化条件下での(A)新鮮マウス肝臓および(B)凍結ラット肝臓から単離されたミトコンドリアの解析。(A)レーン1、間違ったゲルグラジエント濃度(通常の3〜13%ではなく8〜13%)。レーン2-4、サンプルを氷上で10分間インキュベートするか、ロード前にそれぞれ37°Cと40°Cでインキュベートします。(B)凍結ラット肝臓から得られたミトコンドリアのCIのIGA後パターンで、異なるジギトニン/タンパク質比を可溶化して得られたもの。略語:SC =スーパーコンプレックス;PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動;CI = 複素数 I;IGA = ゲル内活性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>中程度</td>
			<td colspan="3">組成</td>
		</tr><tr><td>低張バッファー</td>
			<td colspan="3">10 mM MOPS、83 mM スクロース、pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>高張バッファー</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS、250 mM スクロース、pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>均質化バッファーA</td>
			<td colspan="3">10 mM トリス、1 mM EDTA、0.32 M スクロース、pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>均質化バッファーAT</td>
			<td colspan="3">225 mM マンニトール、1 mM EGTA、75 mM スクロース、0.01% BSA pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>均質化バッファー AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM マンニトール、1 mM EGTA、75 mM スクロース、0.02% BSA pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>BNサンプルバッファー</td>
			<td colspan="3">50 mM NaCl、50 mM イミダゾール、2 mM アミノカプロン酸、1 mM EDTA pH 7.0</td>
		</tr><tr><td>ジギトニンソリューション</td>
			<td colspan="3">50 mM NaCl、50 mM イミダゾール、5 mM アミノカプロン酸、4 mM PMSF 中の 10% ジギトニン</td>
		</tr><tr><td>BNローディングバッファ</td>
			<td colspan="3">5% Coomassie Blue G(0.75 Mアミノカプロン酸含有)</td>
		</tr><tr><td>BNカソードバッファーA</td>
			<td colspan="3">50 mM トリシン、15 mM Bis-Tris pH =7.0 (4 °C)、0.02% G-250 (クマシーブリリアントブルー G-250)</td>
		</tr><tr><td>BNカソードバッファーB</td>
			<td colspan="3">50 mM トリシン、15 mM Bis-Tris pH=7.0 (4 °C)、0.002% G-250</td>
		</tr><tr><td>BNアノードバッファ</td>
			<td colspan="3">50 mM Bis-Tris、pH=7.0</td>
		</tr><tr><td>コンプレックスI IGA基板</td>
			<td colspan="3">5 mM Tris-HCl pH 7.4、0.1 mg/mL NADH、2.5 mg/mL ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)</td>
		</tr><tr><td>コンプレックスII IGA基板</td>
			<td colspan="3">50 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.4、20 mM コハク酸ナトリウム、0.2 mM フェナジンメトスルフェート(PMS)、2.5 mg/mL NBT</td>
		</tr><tr><td>コンプレックスIIIのIGA基板</td>
			<td colspan="3">50 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.2、0.05% ジアミノベンジジン (DAB)</td>
		</tr><tr><td>コンプレックスIV IGA基板</td>
			<td colspan="3">CIIIと同じ溶液に50 μMシトクロムcを加えたもの</td>
		</tr><tr><td>コンプレックスV IGA基板</td>
			<td colspan="3">35 mM トリス、270 mM グリシン pH 8.3、14 mM MgSO4、0.2% Pb(NO3)2、8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>染色液</td>
			<td colspan="3">40%メタノールおよび10%酢酸中の0.25%のクマシー染料R-250</td>
		</tr><tr><td>脱染・固定ソリューション</td>
			<td colspan="3">メタノール 40%、酢酸 10%</td>
		</tr><tr><td>転送バッファ</td>
			<td colspan="3">48 mM トリス、39 mM グリシン、20% メタノール</td>
		</tr></tbody></table>表 1: バッファーとメディアの構成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>細胞タイプ/組織</td>
			<td>開始金額</td>
			<td>期待収量(μgミトコンドリアタンパク質)</td>
			<td>レーン数(50-60μg/レーン)</td>
		</tr><tr><td>培養細胞</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MDA-MB-468</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>300-400μg</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>143B派生</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>200-350μg</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>マウス線維芽細胞</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>150-200μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>心</td>
			<td>100ミリグラム</td>
			<td>400-500μg</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>骨格筋</td>
			<td>100ミリグラム</td>
			<td>300-400μg</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>肝臓</td>
			<td>100ミリグラム</td>
			<td>400-500μg</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>脾臓</td>
			<td>50ミリグラム</td>
			<td>150-250μグラム</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>蝙蝠</td>
			<td>100ミリグラム</td>
			<td>200-300μg</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>脳</td>
			<td>100ミリグラム</td>
			<td>250-300μg</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>表2:異なる細胞タイプおよびマウス組織からのミトコンドリアの予想収量。 心臓や骨格筋から得られるミトコンドリア画分は、他の組織から得られるものよりも純度が高くなります。したがって、ゲルに少量を充填することができます(*)。

このプロトコルは、少量のサンプルしか利用できない場合の呼吸スーパーコンプレックスの分析技術について説明しています。

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples) 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

私たちの研究は、ミトコンドリアの生合成、特にOXPHOSシステムの組織と制御をよりよく理解すること、およびミトコンドリアが癌から神経変性疾患までの疾患で果たす役割を定義することに焦点を当てています。ミトコンドリアは、細胞内で複数の重要な役割を果たし、細胞全体の代謝と生存を調節します。私たちは、ミトコンドリアの複雑さと、それが健康と病気における細胞適応メカニズムに与える影響についての知識を徐々に増やしています。私たちは、OXPHOSシステムの新しい組織モデル、つまり従来の提案を統合し、スーパー複合体と遊離複合体が異なる比率で共存することを前提とした可塑性モデルの確立に貢献し、その機能を最適化し、細胞の適応を可能にしました。私たちのプロトコルでは、小さな組織や細胞培養サンプルから始めて、ブルーネイティブ電気泳動やその他の技術によってスーパーコンプレックスの集合体と状態と機能を分析するのに十分な量のミトコンドリアタンパク質を得ることができます。これを、シンプルな設備で、比較的低コストで短時間で再現性よく行うことができます。

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、密度勾配遠心分離と組み合わせた差動速度遠心分離を使用して、ヒト卵巣癌組織からミトコンドリアを分離する手順を説明しています。単離されたミトコンドリアは、ヒト卵巣がんミトコンドリアプロテオームのプロテオミクス解析に使用できます。...

ミトコンドリアの分離:ヒト卵巣癌組織サンプルからミトコンドリアを分離する技術

哺乳動物の組織生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法が記載されている。ラット肝臓または骨格筋​​調製物は、商業的な組織解離をホモジナイズし、ミトコンドリアをナイロンメッシュフィルターを通して差動濾過により単離した。代替的な方法を用いて100分間 - ミトコンドリアの分離時間は60と比較して&lt;30分である。...

組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。...

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ミトコンドリアは、細菌や細胞質相手から乖離したリボソームを特化しました。HEK 細胞の彼らのネイティブのコンパートメントからの mitoribosomes の取得方法を紹介します。懸濁細胞からミトコンドリアの分離と mitoribosomes...

HEK 細胞から Mitoribosome の急速な隔離

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ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

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タンパク質の発見と定量を改善するためのミトコンドリアの2段階タグフリー分離

ミトコンドリアの生体エネルギーおよびメタボローム研究により、多くの疾患におけるミトコンドリアの多面的な役割が明らかになっていますが、これらのオルガネラの単離方法はさまざまです。ここで詳述する方法は、複数の組織源から高品質のミトコンドリアを精製することができます。品質は、高解像度呼吸測定で評価される呼吸制御比やその他の指標によって決定されます。...

げっ歯類の心臓組織からの堅牢なミトコンドリア単離 

学ぶミトコンドリア単離法で少量サンプルから呼吸スーパーコンプレックスを解析する手法。OXPHOS系の可塑性モデル構築と疾患研究への応用を理解できます。

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples)

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