Name: 自家血栓を用いた肺塞栓症の低侵襲ラットモデルの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶ 自家血栓を用いた低侵襲ラットモデルで肺塞栓症を再現する方法。シリコン麠型による肺動脈樹の可視化と梗塞領域の定量化技術も含む。新規治療戦略開発に有用です。

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すべての動物実験は、中国医学院および北京連合医科大学の動物管理および使用委員会の承認を得て行われました(承認番号:IRM/2-1ACUC-2311-015)。この研究では、生後6週間、体重約250gの雄のSprague-Dawleyラットを使用しました。動物は、バランスの取れた食事と水を自由に利用できる特定の病原菌を含まない環境で飼育されました。室温22°C±2°Cで12時間の明暗サイクルで保管しました。 動物は、外科的処置を受ける前に1週間環境に適応することが許されました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。
1. 設備・資材
<ol>
	<li>麻酔器具:小動物やイソフルラン用のガス麻酔器を使用してください。</li>
	<li>手術材料:綿棒、ヨードフォア消毒剤、実体顕微鏡、シェーバー、医療用テープ、27G針付き1mLシリンジ、5mLシリンジ、10mLシリンジ、生理食塩水、ガーゼ、8-0を準備しますナイロン糸、縫合針付き6-0ナイロン糸、マイクロ止血クランプ、マイクロピンセット、細いハサミ。</li>
	<li>その他の材料:医療用注射器と互換性のある19Gおよび18Gの分注針、内径1.2mm、長さ10cmのシリコンチューブ、内径3.0mm、長さ20cmの輸液チューブ、1.5mLの遠心チューブ、ピペット、ピペットチップを入手してください。</li>
	<li>自作の血栓発生器と血栓注入器(図1):1mLシリンジに取り付けられた19Gの分注針にシリコンチューブを接続して、血栓発生器を作成します。輸液チューブの一方の端を18Gの分注針に接続し、もう一方の端を5mLシリンジに取り付けて血栓インジェクターを作成します。</li>
</ol>
2. 自家血栓製剤
<ol>
	<li>麻酔<ol>
		<li>動物を麻酔導入チャンバー内に置き、4%イソフルランと室内空気の混合物を2 L /分の流量で2〜3分間投与します(施設で承認されたプロトコルに従います)。</li>
		<li>動物を手術台に仰臥位で置きます。2.5%イソフルランを0.4 L / minの流量で投与することにより、麻酔を維持します。ペダル反射をテストして、適切な麻酔が達成されていることを確認します。</li>
		<li>両前肢を体から水平に伸ばし、後肢を伸ばして鼠径部を十分に露出させます。医療用テープを使用して動物をこの位置に固定します(図2A)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>頭蓋大静脈(CVC)による採血<ol>
		<li>マヌブリウムの周りの毛をシェーバーと脱毛クリームで取り除きます。ヨードフォアで皮膚を消毒します。</li>
		<li>図 2A に示すように、1 mL シリンジに取り付けられた 27 G 針を垂直に 8 mm の深さまで挿入し、左右の CVC に穴を開けます。 注:CVCの体表面の突起は、原稿に対して5mm横です。両側を使用でき、選択は次の手順に影響を与えません。</li>
		<li>シリンジを持ち、プランジャーをゆっくりと引き戻して、バレル内に負圧を作り出します。血液が流れ込むまで針を徐々に引き抜き、0.3 mLの血液が採取されるまでその位置を維持します(図2B)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血栓の準備<ol>
		<li>採取した血液を1.5mLの遠心チューブに押し込み、気泡が出ないように注意します。</li>
		<li>自作の血栓発生器のシリコンチューブに血液を吸い込み、血液柱の長さが10cmになるまで待ちます。 注:凝固が遠心分離管内で開始および伝播し、採取された血栓の品質が低下するため、これらの2つの手順を迅速に実行してください。</li>
		<li>血液が完全に血栓になるまで30分待ちます。この間、同じように他の動物の血液柱を準備します。</li>
		<li>血栓を含んだ血液カラムを生理食塩水が入ったシャーレに洗い流し、血栓カラムを生理食塩水で3回洗浄します(図2C)。</li>
		<li>細いハサミを使用して、血栓カラムを長さ4mmの均一な血栓に切断します(図2D)。10〜20個の血栓を、2mLの生理食塩水で事前に充填した自作インジェクターに引き込みます。 注:血栓の長さは1cmを超えないようにし、そうしないと右心室に閉じ込められます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 静脈アクセスの準備
<ol>
	<li>表在性上腹部血管の露出<ol>
		<li>ステップ2.1で説明されているように、動物に麻酔をかけ、固定します。</li>
		<li>左の鼠径部の周りの毛を剃ります。これらの部分に脱毛クリームを塗り、1分ほど待ってからガーゼでクリームを拭き取ります。ヨードフォアで皮膚を消毒します。</li>
		<li>鼠径部の表在性上腹部血管の起点より5mmの皮膚切開を行います。通常、表在性上腹部血管の起源は、鼠径部の小さな脈動を観察することで追跡できます。</li>
		<li>10倍倍率の実体顕微鏡を使用して、皮下脂肪の薄い層を分離して、表在性上腹部血管を露出させます(図3A)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表在性上腹部静脈の分離<ol>
		<li>動脈、神経、脂肪組織から表在性上腹部静脈を慎重に分離します。これを、大腿静脈に流れ込むまで近位で、および遠位で最初の静脈分岐部まで実行します。</li>
		<li>遠位側を8-0で結紮します糸を通し、マイクロクランプで糸をクランプします。8-0で近位側をコントロールします別のマイクロクランプに取り付けられたスレッドループ(図3B)。</li>
		<li>孤立した静脈の遠位側に小さな横切開を行います。出血を避けるために近位側を制御します。静脈内腔に残っている血液を通常の生理食塩水で洗い流します。静脈がきれいになったら、マイクロピンセットを使用して静脈切開を拡大します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4.塞栓術
<ol>
	<li>静脈カニューレ挿入<ol>
		<li>自作インジェクターの針を静脈切開部から静脈にそっと挿入します。針が静脈から滑り落ちないように、3番目のclで針を固定します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>塞栓術の手順<ol>
		<li>プランジャーをゆっくりと押して、少量の通常の生理食塩水を投与します。抵抗のない静脈の満ち足りた状態は、静脈へのアクセスが妨げられていないことを示しています(図3D)。</li>
		<li>プランジャーを押し続けて、表在性上腹部静脈へのアクセスを通じて大腿静脈に血栓を投与します。塞栓速度を毎分5塞栓に制御します。動物の呼吸を監視します。新たに発症し悪化する呼吸困難は、塞栓術が成功したことを示しています。</li>
		<li>事前定義された量の血栓を注入した後、針を抜いて表在性上腹部静脈の近位側を結紮します。</li>
		<li>切開部を縫合し、動物を温かい箱に入れます。動物が目覚めたら、動物をケージに移します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 梗塞領域の定量化
<ol>
	<li>安楽死と心臓灌流<ol>
		<li>25,000 Uのヘパリンナトリウムを250 mLの生理食塩水に加えて、よく混合します。.ボトルを輸液装置に接続し、ボトルを逆さまに80cmの高さで吊るします。輸液装置のバルブを閉じます。</li>
		<li>イソフルランの過剰摂取で動物を安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従います)。</li>
		<li>大きなハサミで肋骨を切って胸を開き、肺や大きな血管への損傷を防ぎます。</li>
		<li>輸液装置の針を左心室に挿入します。輸液装置のバルブを開いて、ヘパリン化生理食塩水の注入を可能にします。はさみを使用して下大静脈を切断し、左付属器を切断して排水できるようにします。灌流速度を50mL/minに制御します。 注:この手順では、正常な肺組織が白くなりますが、塞栓されたゾーンは錆びたままになります。</li>
		<li>ヘパリン化生理食塩水による灌流を完了した後、4%パラホルムアルデヒド溶液で満たされた10mLシリンジを使用して、右心室から肺動脈幹を穿刺します。肺を通じて4%パラホルムアルデヒド灌流を行い、総量30mLで肺組織を固定します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>梗塞率という指標を導入<ol>
		<li>固定後、脊椎と横隔膜11から肺、心臓、気管、食道、胸腺、および大きな血管全体を切除します。</li>
		<li>最初の腫瘤から食道、胸腺、脂肪組織を慎重に取り除き、心臓、肺、大きな血管だけを残します。</li>
		<li>残りの部分を適切な量の4%パラホルムアルデヒド溶液に少なくとも48時間浸します。</li>
		<li>分析天びんを使用して、肺全体の重量を量ります。細いハサミを使って肺の梗塞部分を分離し、梗塞組織の重さを同じ天秤で量ります。梗塞比は、次の式を使用して計算します。 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66776/66776eq01.jpg" style="margin: auto;"> 
		iは梗塞組織の重量、 wは肺全体の重量、 i は梗塞率を表します。</li>
		<li>梗塞領域を定量した後、パラホルムアルデヒド固定肺組織をパラフィン包埋11のためにトリミングします。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 肺動脈樹の可視化
<ol>
	<li>肺動脈キャスティング<ol>
		<li>動物を安楽死させ、ステップ5.1に記載されているように心臓灌流を行います。</li>
		<li>シリコーンキャスティングコンパウンドに等量(重量)の希釈剤を添加し、混合物をブレンドしてから、硬化剤の5%(重量または容量)を添加します。混合物を再度ブレンドします。</li>
		<li>混合物1mLを1mLシリンジに引き込み、空気を排出し、針を右心室から肺動脈幹に挿入します。針を肺動脈に固定して、滑りや逆流を防ぎます。</li>
		<li>プランジャーを静かに押して、シリコンキャスティング混合物が肺動脈樹に充填されるようにします。正常な肺領域はキャスティング混合物によって染色されますが、梗塞領域は錆びた赤のままです。 注:肺動脈ギプスは、無傷の肺組織にのみ適用する必要があります。典型的には、0.6〜0.8mLのキャスティング混合物は、肺動脈樹を満たすのに十分である。キャスティング混合物の過剰注入は、肺静脈キャスティングにつながる可能性があり、肺動脈樹の視覚化に影響を与えます。キャスティング混合物は、硬化剤を添加してから20分以内に使用する必要があります。</li>
		<li>灌流をキャストした後、シリンジを引き出し、肺動脈幹を結紮し、ステップ5.2で説明したように肺、心臓、および大きな血管を採取します。全体の塊をペトリ皿に入れ、4°Cの冷蔵庫で一晩保管して、キャスティング混合物を結晶化させます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>クリアリングと視覚化<ol>
		<li>ハサミで肺から心臓と大きな血管を取り除き、肺表面から硬化混合物の破片を取り除きます。</li>
		<li>肺を25%、50%、75%、95%、および100%エチルアルコール溶液にそれぞれ24時間順に浸します。この手順は肺を完全に脱水します。</li>
		<li>脱水した肺をサリチル酸メチルに24時間浸します。このクリアリングプロセスの後、肺動脈樹が見え、サリチル酸メチルはヘモグロビンをクリアしないため、塞栓も見ることができます(図4B、D)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>分析天びん</td> メ<td>トラー・トレド</td><td>MA55/A</td><td>なし</td></tr><tr><td>分注針</td><td>Jinrong electronics</td><td>なし</td><td>19 G および 18 G</td></tr> 細<tr><td>かいはさみ</td> より<td>強い</td><td>XGJ1300</td><td>なし</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>Solarbio</td><td>01-08-9041</td><td>140U/mg</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td>なし</td></tr><tr><td>サリチル酸メチル</td><td>マックリン</td><td></td><td>M813577 AR、99%</td></tr> <tr><td>マイクロ クランプ</td><td>JZ&nbsp;</td><td>W40160</td><td>なし</td></tr><tr><td>マイクロピンセット</td><td>より強い</td><td>XGN1310</td><td></td></tr>なし <tr><td>シリコーン鋳造コンパウンド</td><td>Flow Tech</td><td>MV-130</td><td>なし</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley ラット</td><td>バイタルリバー</td><td>SD-IGS</td><td>なし</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Murzider</td><td>MSD204</td><td>なし</td></tr></tbody></table>

自家血栓を用いた肺塞栓症の低侵襲ラットモデルの確立

Establishment of a Minimally Invasive Rat Model of Pulmonary Embolism Using Autologous Blood Clots

PEモデルの症状と病理 塞栓術中、ラットは息切れを経験し、胸部は変動が拡大しました。肺塞栓症のエピソードでは、投与された血栓が10cm未満であったため、ほぼすべての動物が生存した(モデル化された動物15匹中14匹)。ケージに戻された後、動物たちは隅で丸くなり、食べ物や水への興味が薄れました。しかし、これらの症状はすぐに治まり、数時間以内に動物は正常に行動するようになりました。ベースラインと塞栓術後24時間の間に体重に有意差はなかった(341.8 ± 10.4 対343.3 ± 8.5、 p = 0.25)。
肉眼的病理学により、塞栓された(梗塞された)領域はくさび形であり、主に肺の下部に位置し、明確な境界があることが明らかになりました。塞栓は梗塞領域の頂点に発見され、肺動脈の第1および第2の枝を塞いでいました。ヘマトキシリン-エオシン染色を使用した顕微鏡病理学により、肺動脈枝の塞栓が確認されました(図4F)。
血栓量と梗塞患部 血栓負荷が肺梗塞に及ぼす影響に関する予備調査では、血栓負荷の低さ(血栓柱6cm、血栓15個)と血栓負荷の高値(血栓柱10cm、血栓25個)の両方を検討しました。予想通り、塞栓の負荷が高いほど、肺梗塞の領域が拡大しました(図5A-C)。
24時間以内の内因性線維素溶解 塞栓術直後に採取した肺サンプルと比較して、塞栓術後24時間で採取した肺サンプルは、梗塞領域が著しく減少し、ラットの内因性線維素溶解能が強いことを示しました(図5D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig01.jpg"> 
図1:血栓発生器と血栓注入器の構造 (A)血栓発生器は、シリコンチューブを18Gの分注針(外径12mm)と0.5mLの生理食塩水であらかじめ充填された1mLシリンジに接続して組み立てられました。(B)血栓注入器は、19Gの分注針(内径0.84mm、外径1.08mm)を輸液チューブ(血栓容器)と2mLの生理食塩水で予め充填した5mLシリンジに接続して構築した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig02.jpg"> 
図2:採血と血栓の準備(A)ラットに麻酔をかけ、仰臥位に固定した。点線の白い円はマヌブリウムを示し、体表のマーカーとして機能します。白い円の隣の赤い点は、両側頭蓋大静脈(CVC)にアクセスするための穿刺部位を示しています。図の下部は、原液、CVC、および穿刺部位の相対的な位置の剖検図を示しています。(B)右CVCによる採血の成功。(C)自作の血栓発生器から洗い流される血栓形成された血液柱。(D)血栓が付着した血液柱に由来する血栓。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig03.jpg"> 
図3:静脈へのアクセスと塞栓術 (A) 5 mm の皮膚切開による表在性上腹部血管の露出、青色の矢印は表在性上腹部静脈、赤色の矢印は表在性上腹部動脈を示す。(B)表在性上腹部静脈を周囲の組織から分離し、ナイロン糸で静脈を制御します。(C)血栓を含む自作の注射器。(D)自作インジェクターの分注針による静脈のカニューレ挿入と、静脈アクセスを介した血栓の投与。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig04.jpg"> 
図4:肺塞栓症の病理(A)心臓生理食塩水灌流および4%パラホルムアルデヒド固定後の正常な肺。(B)シリコーンキャスティング混合物とサリチル酸メチルの清澄化によって視覚化された正常な肺は、特許肺動脈樹と微小血管系を示しています。(C)塞栓術直後の肺で自家血栓があり、塞栓術による肺梗塞を示すマークのある領域があります。(D)シリコーン混合物の鋳造とサリチル酸メチルのクリアリングによって視覚化された病気の肺、黒い矢印は塞栓が閉塞している肺動脈の枝を示し、白い破線の円は梗塞している患部を示しています。(E) 肺動脈枝に塞栓(赤い矢印)を示す左肺葉の解剖。(F)ヘマトキシリンとエオシン染色を用いた肺動脈枝の血栓塞栓術の顕微鏡画像。スケールバー:200μmこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig04large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig05.jpg"> 
図5:肺梗塞率の定量化(A)塞栓術後にラットから直ちに採取した肺と10cmの血栓(全長)。(B)塞栓術後のラットからすぐに採取した肺と6cmの血栓。(C)塞栓術後にラットから直ちに採取した肺で、8cmの血栓を有するもの。(D)塞栓術の24時間後にラットから採取した肺と8cmの血栓。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Pulmonary embolism (PE) is one of the leading causes of cardiovascular death, resulting in a significant socioeconomic burden. Although current treatments ...

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このビデオでは、くも膜下出血ラットモデルを確立する手順を示しています。麻酔をかけたラットにプローブを埋め込み、頭蓋内圧と脳血流を測定します。標的部位が特定され、針が視交叉前位置に挿入されます。その後、くも膜下腔に自家血液を注入し、頭蓋内圧を上昇させ、脳血流を減少させ、モデルを確立します。...

自家血液注射によるくも膜下出血ラットモデルの確立

肺は全身気管支動脈と肺動脈の両方によって灌流される。ほとんどの肺の病変では、堅牢な血管新生を示す小さい全身の血管系である。肺血流の停止は好調気管支血管新生を促進する。我々は気管支血管新生を促進し、左肺動脈の虚血を誘導手術の詳細を提供します。...

虚血ラットの肺の血管新生

この論文では、成体ラットにおいて相同血栓(フィブリンリッチ)を伴う塞栓性中大脳動脈閉塞を引き起こす標準的な方法を示します。このモデルは、ヒトの虚血性脳卒中を密接に模倣しており、虚血性脳卒中の血栓溶解療法の前臨床研究に適しています。...

ラットにおける同種血血栓による虚血性脳卒中のための塞栓中大脳動脈閉塞（MCAO）

ここでは、糸塞栓法により優れた矢状静脈ス(SSS)血栓症の新しいスプレイグ・ドーリー(SD)ラットモデルを確立し、その安定性と信頼性を検証した。<br...

スレッド塞栓法による上矢状・中症のラットモデルの確立

ここでは、転帰の改善に役立つラット肺移植モデルの最適化を提示します。体重に基づくカフのサイズガイド、4番目の...

温虚血/再灌流損傷のラット肺移植モデル:転帰を改善するための最適化

このプロトコルは、マウスモデルにおける肺虚血再灌流障害の研究に使用できる、実現可能で信頼性が高く、再現性のある左肺門結灌法の概要を示しています。...

マウス左肺ヒラークランプモデル 肺虚血再灌流損傷

この研究は、ラットの開腹術による腹腔上大動脈クロスクランプ中の内臓虚血再灌流後の急性肺損傷のモデルについて説明しています。これにより、大動脈クランプの臨床的および生物学的影響、および虚血再灌流が基礎となる臓器や遠隔肺損傷に及ぼす影響の両方を調査することができます。...

ラットにおけるセリアック大動脈クロスクランプによる内臓虚血再灌流後の急性肺損傷のモデル

この研究は、急性中リスクPEを再現する大きな自家塞栓を使用した肺塞栓症(PE)のブタモデルを示しています。このモデルは、病態生理学と治療反応の両方の評価に適しています。...

急性自家肺塞栓症のブタモデル

ここでは、ブレオマイシンを気道に注入することにより、肺線維症に関連する肺動脈性肺高血圧症(PF-PH)ラットモデルを誘発する方法を紹介します。また、この動物モデルを検証するための段階的なアプローチも提供しています。...

肺線維症に伴う肺動脈性肺高血圧症のラットモデルの確立と検証

このプロトコルは、ラットの同所性左肺移植のための改善された技術を説明し、操作の難しさを軽減し、生存率を改善することに焦点を当てています。...

ラットにおける同所性左肺移植

学ぶ 自家血栓を用いた低侵襲ラットモデルで肺塞栓症を再現する方法。シリコン麠型による肺動脈樹の可視化と梗塞領域の定量化技術も含む。新規治療戦略開発に有用です。

自家血栓を用いた肺塞栓症の低侵襲ラットモデルの確立

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