Name: 疾患進行を模倣し薬物活性を予測する非小細胞肺癌の同所性異種移植モデルの構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 学ぶ多細胞スフェロイドを用いた非小細胞肺癌の同所性異種移植モデル構築法。蛍光A549-iRFP細胞による動的イメージングで疾患進行を模倣し、シスプラチン応答を評価する革新的な抗がん剤開発プラットフォームです。

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この研究は、パシフィック大学からのSAAGおよびSEED助成金によって支援されました。Odyssey Infrared Imaging 205 システムへのアクセスを許可してくださった William Chan 博士と、SpectraMax iD3 プレートリーダーへのアクセスを許可してくださった John Livesey 博士に感謝します。動物プロトコルに関する技術的なアドバイスをいただいたメラニー・フェルムリー博士に感謝します。

動物実験は、太平洋大学の動物管理・使用委員会(IACUC)の承認を得て実施されました(動物プロトコル19R10および22R10)。本研究では、体重 5 〜 6 週齢、体重 20 〜 25 g の 8 匹の雄の胸腺ヌード マウスを、参照されたげっ歯類の餌で飼育し、病原体を含まない (SPF) 条件下で飼育しました。ケージ、寝具、飲料水はオートクレーブ滅菌され、定期的に交換されました。マウスでの腫瘍接種の概略図を 図1に示します。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. A549-iRFP細胞の3次元MCSの確立
<ol><li>A549-iRFP細胞(ヒト肺腺がん)を5% CO2 、37°Cの加湿雰囲気でインキュベートし、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および1 μg/mLピューロマイシンを含む完全増殖培地DMEMで増殖させます。</li>
	<li>0.3% コラーゲンを添加した 100 μL の完全増殖培地を使用して、A549-iRFP 細胞を 96 ウェル超低接着の丸底スフェロイドマイクロプレートに播種し、播種密度 4,000 細胞/ウェルで行います。</li>
	<li>マイクロプレートを300 × g で4°Cで7分間遠心分離し、MCSの形成を促進します。顕微鏡でMCSの形態を調べ、遠心分離後の細胞凝集を確認します。</li>
	<li>48時間後、各ウェルに100 μLの完全増殖培地を添加して、ウェルあたり200 μLの増殖培地の総容量を達成します。</li>
	<li>各ウェルの100 μLの増殖培地を、1日おきに新鮮な完全増殖培地と交換してください。</li>
</ol>2. A549-iRFP MCS の特性評価
<ol><li>顕微鏡を使用してMCSの形態を観察および画像化し、位相差顕微鏡の画像に基づいてMATLABの参照ソフトウェアを使用したシミュレーションによりMCSの体積を推定します。<ol><li>ImageJソフトウェアで1つのMCSイメージを開きます。</li>
		<li>フリーハンド選択を使用して MCS のエッジを選択し、ROI マネージャーに追加します。</li>
		<li>[編集] |選考 |マスクを作成します。</li>
		<li>[編集] |反転。</li>
		<li>[ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ。</li>
		<li>ReViSPソフトウェアを開きます。</li>
		<li>保存した TIFF 画像を開く には、[参照] をクリックします。</li>
		<li>「開始」をクリックして、MCSシミュレーションを完了します。</li>
	</ol></li>
	<li>700 nm チャネルの赤外イメージングシステムを使用して iRFP 蛍光シグナルを測定し、ソフトウェア(Image Studio など)を使用して蛍光シグナルを定量します。<ol><li>Image Studioソフトウェアを開きます。</li>
		<li>「チャンネル」タブで、「700」を選択し、「強度」 = 5 を選択します。</li>
		<li>「Scan Controls」タブで、「84 μm」、「Medium」、「0.0 mm」、「Flip Image」を選択します。他のすべてはデフォルトのままにします。</li>
		<li>[開始] をクリックしてスキャンを開始します。</li>
	</ol></li>
	<li>ベンダーのプロトコルに従って、3D細胞生存率アッセイを使用して細胞生存率を評価および定量化します。</li>
	<li>ベンダーのプロトコルに従って、BCA Assayを使用して細胞タンパク質を評価および定量します。</li>
</ol>3. 腫瘍接種のためのMCS選択
注:MCSをスフェロイドマイクロプレートに播種し、定期的な増殖培地交換で2〜3週間増殖させた後、腫瘍接種に適した以下の特性を持つMCSを選択します。
<ol><li>顕微鏡でMCSの形態を観察し、全体的に滑らかなエッジを持つ丸い形状のMCSを選択しますが、5〜10個の粗い出芽( 図2Fの矢印)があり、直径が700〜800μmの範囲です。</li>
	<li>iRFP蛍光を測定し(ステップ2.2を参照)、蛍光シグナルが平均から1標準偏差以内にあるMCSを選択します。</li>
</ol>4. 肺内MCS接種
注:動物を取り扱う前に、70%イソプロピルアルコールスプレーを使用して、手術ステーションとツールを清掃してください。
<ol><li>80 mg/kg ケタミンと 12 mg/kg キシラジンの IP 注射で各マウスに麻酔をかけます。マウスの足を鉗子でつまんで、完全な麻酔を確保します。</li>
	<li>痛みを軽減するために、塩酸ブプレノルフィン(0.3 mg / mL)10μLを皮下に注入します。.</li>
	<li>乾燥を防ぐために目に眼科用軟膏を塗ります。</li>
	<li>マウスを背側の姿勢に置き、手足を伸ばした位置にテープで固定します。</li>
	<li>ヨウ素とアルコールの綿棒で背中の皮膚を滅菌します。</li>
	<li>左背中の手術用ハサミを使用して0.5〜1cmの切開部をカットします(図1B)。鉗子を慎重に使用して、胸壁と肺の動きが見えるまで筋肉と脂肪組織を分離します。</li>
	<li>選択したMCSをマイクロプレートからピペットを使用して、氷冷PBSが入ったガラスシャーレに移します。</li>
	<li>20 Gの針を100 μLのガラス製シリンジに取り付け、氷上で予冷し、PBSとマトリゲルの予冷混合物(1:1 v / v)を20 μL吸引します。</li>
	<li>シリンジを使用して、ペトリ皿から1つのMCSを最小量のPBS-マトリゲル混合物ですばやく吸引し、MCSを針の金属部分に保ちます。 注意: MCSが針から滑り落ちないように、シリンジとプランジャーをしっかりと握ってください。</li>
	<li>針を 2 つの肋骨の間に垂直に ~3 mm の深さまで静かに挿入し、MCS を含む 20 μL の PBS とマトリゲルの混合物をすべてゆっくりと注入します。 注意: 肺、血管系、または心臓の損傷を防ぐために、挿入中に過度の力を入れないでください。</li>
	<li>針を慎重に取り外し、傷口に三重の抗生物質軟膏を塗布します。</li>
	<li>切開部をサージカルクリップで密封し、2週間後に取り外す必要があります。 注:縫合線が蛍光イメージングを妨げる可能性があるため、切開部を縫合しないでください。ヌードマウスは手術後に自然に治癒することができます。</li>
	<li>動物を赤外線ヒートパッドの上に置き、体温を維持するために実験室用ワイプで覆います。動物が目を覚まし、適切に動くまで、少なくとも30〜60分間動物を監視します。</li>
	<li>痛みを軽減するために、最初の48時間、1日3回、10μLの塩酸ブプレノルフィン(0.3 mg / mL)を皮下注射します。.</li>
</ol>5. 術後モニタリング
<ol><li>3〜4日ごとに体重を測定します。</li>
	<li>腫瘍異種移植片からのiRFP蛍光シグナルを、700nmチャネルの小動物イメージングシステムで3〜4日ごとに測定します:左、右、背側、腹側の4つの姿勢で、マウスをイソフルラン吸入(流量:1.5〜2 L / min、1.5%イソフルランを含む酸素)により2〜3分間麻酔下に保ちます。</li>
	<li>異種移植片がんのin vivo での正味蛍光強度を、ソフトウェア(Image Studioなど)を使用して定量化します。<ol><li>固定四角形 (A1、200 x 125 ピクセル) をマウスの胸部領域のサンプリング ウィンドウとして使用します。</li>
		<li>フリーハンド機能を使用して、長方形 (A1) 内のマウスの形状を追跡し、領域 A1 の蛍光強度 (F1) を測定します。</li>
		<li>別の小さな長方形(A2、25 x 40ピクセル)を使用して、大腿部のマウスの背景蛍光(F2)を測定します。</li>
		<li>式(1)を使用して、各マウスの異種移植がんの正味蛍光強度を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
</ol>

モデル同所性NSCLCへの多細胞スフェロイドの肺内接種

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<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
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</ol>

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

A549-iRFP MCSの構築は、簡単で再現性の高いラボ手順であり、複数の細胞株のMCS形成に変換することができます。遠心分離とコラーゲンの助けを借りて生成されたMCSは、3〜4日以内により一体的で固形腫瘍のような構造を示します。この方法により、堅牢なスフェロイドが形成され、その一体構造を長期間、通常は2〜3週間、または小さな出芽が出現し始めるまでさらに長く維持できます。遠心分離とコラーゲンを用いることで、MCSの形成を標準化し、実験モデルにおけるMCSの一貫性と信頼性を確保しました。このアプローチにより、結果の再現性が向上し、腫瘍増殖速度の変動性が最小限に抑えられるため、腫瘍の生物学と治療介入を研究するためのより堅牢なプラットフォームが提供されます。
従来の2D単層細胞培養とは対照的に、3D MCSは、この研究では少なくとも6週間という、はるかに長い期間にわたって増殖することができます。がんの成長と進行を監視するには、動的で長期的な定量的測定が非常に有益です。既存の3D MCSアッセイの多くは、測定中に破壊的であるため、長期的な評価への有用性が制限されています。iRFP蛍光シグナルの非破壊的な測定により、3D MCSでのがん細胞の増殖を継続的かつ長期的にモニタリングすることができます。この特徴は、抗がん剤への慢性的な曝露の影響を評価し、がん細胞の経時的な動的進化を捉えるために特に価値があります。A549-iRFP 3D MCS から放出される iRFP 蛍光シグナルは、スフェロイド体積、細胞生存率、細胞タンパク質レベルなど、従来のスフェロイド増殖の定量的測定と強い相関関係を示しました。このことは、MCSにおけるがん細胞の増殖を評価するための代理としての蛍光シグナルの信頼性を浮き彫りにしています。iRFP蛍光シグナルの波長が長いため、抗がん剤の前臨床開発に重要な小動物のがんの増殖と進行を定量化できます。
この同所性 NSCLC モデルの一貫性を確保するために、MCS は肺内接種用に慎重に選択する必要があります。変動を最小限に抑えるには、MCSのサイズと蛍光強度を同程度にする必要があります。より大きなMCSの接種は、腫瘍の進行に大きな変動を引き起こす傾向があります。さらに、MCS表面の粗さを制御することは、ばらつきを減らす上で重要な役割を果たします。一部のMCSは大きくなるにつれて滑らかなエッジを維持しましたが、他のMCは成長するにつれてエッジが粗くなりました。私たちの手では、エッジに5〜10個の出芽がある細胞培養で2〜3週間後に増殖した一体型の固形腫瘍様MCSは、マウスでより均一な腫瘍増殖をもたらしましたが、エッジが粗いものや構造が緩んで出芽が多すぎるものは、接種後の腫瘍増殖のパターンがより多様でした。 
MCS移術の過程では、20Gの針を細心の注意を払って取り扱うことが不可欠です。MCSは、潜在的な損傷を制限するために、針のベベルまたは金属部分内に保持する必要があります。針のサイズの選択は、接種中のMCSの生存率を確保することと、マウスの肺への潜在的な損傷を最小限に抑えることとのバランスをとるために意図的に行われました。針のサイズが大きいと、マウス組織に損傷を与える可能性があります。MCSが針内に詰まったり、接種後数日間で複数の蛍光ドットが観察された場合は、接種中に接種したMCSが損傷したことを示している可能性があります。これらの特徴を示すマウスは、さらなる研究から除外され、接種に失敗したと分類されました。
多細胞スフェロイド(MCS)は、解剖学的考慮に基づいて、右肺ではなく左肺に接種されました。左肺には2つの葉が積み重なっており、3つの葉が並んで配置されている右肺と比較して、より一貫性がありアクセスしやすい標的領域を提供します。したがって、左肺は特定の領域、すなわち左上葉への信頼性の高い接種を可能にし、腫瘍の発生と進行のばらつきを減らすのに役立ちます。 
胸部iRFP蛍光に加えて、担がんマウスの体重は、腫瘍量の重要な裏付け指標として機能します。MCS接種後に異種移植がんが進行すると、マウスはまず、覚醒時の飲食や活動などの正常な行動を示しましたが、40日目頃までは、強力な胸部iRFP蛍光で示される大きな腫瘍負荷により、体重が著しく減少し、正常な行動が失われました。人道的なガイドラインに従って、動物は体重が15〜20%減少したときに安楽死させられました。体重減少のタイミングはバッチによって異なりますが、通常の動物の行動の喪失と一致するため、動物の健康状態の信頼できる指標としても使用できます。
NSCLCの同所性モデルにおけるがんの進行は、主に左側および腹側の蛍光イメージングを通じて監視され、MCS接種後の一貫した安定した腫瘍増殖が示されました。腹側からの蛍光は左側よりも緩やかな増加を示したが、これはおそらく(1)注射の深さ、および(2)進行がんの病期に同所性腫瘍と皮下腫瘍の両方が存在するためであろう。具体的には、MCSは肋骨を介して胸部に接種され、胸部は左肺の背側表面に沈着したため、MCSが左肺の腹面まで成長して画像化されるまでに遅延時間が必要でした。腫瘍が成長するにつれて、腫瘍は時折胸壁の内面に広がり、蛍光スキャナーに近づいて左側の画像に対してより高い信号を与えるようになりました。したがって、腹側の蛍光イメージングは、肺の腫瘍をより正確に示しましたが、通常、腫瘍の検出にはより長い時間がかかりました。 in vivo 蛍光イメージングの最後に、動物を屠殺し、開胸部解剖と ex vivo イメージングを行ったところ、MCS接種による同所性腫瘍の確立が確認されただけでなく、ヒトにおけるNSCLCの4つの臨床病期を再現する複数の解剖学的特徴が示されました。 
パイロット有効性試験では、肺の ex vivo イメージングと担がんマウスの in vivo イメージングとの間に強い相関関係があることが、動的 in vivo 蛍光イメージング法の信頼性を裏付けています。NSCLCの同所性モデルは、治療効果の重要な指標としての腫瘍増殖の遅さと、薬物毒性の主要な指標としての体重減少の両方により、抗がん治療に対して信頼性に反応した。このような回答は、このモデルが抗がん剤候補の前臨床評価と開発のための貴重なツールであることを示しました。肺がんの特徴である転移は、モデル内で忠実に再現され、さらに重要なことに、抗がん剤シスプラチンによって確実に妨げられました。このパイロット研究では、シスプラチンを2回注射しただけで腫瘍の成長が遅くなることが観察され、シスプラチンのより有意な抗がん効果は、週4回の投与というより臨床的に関連性のあるレジメンから生じることが示唆されています。 
この報告のNSCLCの同所性モデルは、肺がんの多くの一般的な動物モデルに比べていくつかの重要な利点を持っています。肺がんの皮下異種移植モデルと比較して、このモデルは腫瘍の周りのより関連性の高い組織微小環境を提供します。遺伝子改変マウスモデルと比較して、このモデルはより便利な実験手順を提供し、腫瘍の進行と動物の生存率をより再現性よく提供します。このモデルと肺がんの他のモデルとの包括的な比較は、以前の出版物18で入手可能です。他の異種移植動物モデルと同様に、このモデルの1つの制限は、ヒトの癌の重要な構成要素である完全な免疫系の欠如です。さらに、このモデルで接種されたMCSは、胸壁の内面に原発性異種移植腫瘍を発症することがあります。したがって、このような発生を容易に検出し、最小限に抑えるための実験的手法を、このモデルを改善するための将来の研究に含める必要があります。さらに、NSCLCの腫瘍生物学と治療反応についてより包括的に理解するために、男女を対象とした研究が実施されます。結論として、このレポートのマウス同所性肺がん異種移植モデルは、肺がんの進行を再現し、抗がん治療を評価するための先駆的で堅牢なツールとして立っています。このモデルは、NSCLCの病理学の理解を深め、対応する治療的介入を開発するための大きな可能性を秘めています。

すべての腫瘍性疾患の中で、肺がんは最も多くの生命損失をもたらすだけでなく、米国で毎年2番目に多い新規患者数を主張しています1。この壊滅的な悪性腫瘍は、現代医療における大きな障害となっており、その複雑な生物学とより効果的な治療法のより深い理解が求められています2。非小細胞肺がん(NSCLC)は肺がんの85%を占め、固形腫瘍に発展する傾向があります3。肺がんにおける最も重要な課題の1つは、動的で不均一な腫瘍微小環境であり、これはがんの進行と治療介入に対する反応に深く影響します4,5,6。NSCLCのさまざまな段階におけるがん細胞とその微小環境との相互作用をより深く理解するには、NSCLC進行の組織学的特徴を再現する洗練された病理学的モデルが必要です。
この点で、同所性動物モデルは、NSCLC研究の有望な手段として浮上しています。一般的に採用されている皮下異種移植モデル7とは異なり、同所性モデルは、起源の臓器に直接接種されるがん細胞を特徴としています。肺がんの場合、これはがん細胞を直接肺組織に移植することを意味する8,9。その結果、肺がんの同所性モデルは、隣接する組織、血管、免疫成分を含む天然の腫瘍微小環境をよりよく模倣し、それらの生理学的および臨床的関連性を向上させます。
三次元多細胞スフェロイド(MCS)は、腫瘍環境の特徴を再現するための別の有望なアプローチを表しています。ほとんどのがんは、さまざまな細胞間相互作用、細胞外マトリックス、酸素と栄養素の勾配など、複雑な腫瘍微小環境によって特徴付けられます10,11。従来の2D細胞培養には、これらの腫瘍特異的な特徴を再現するための空間的および構造的な複雑さが欠けています12。対照的に、適切なサイズのMCSは、低酸素および壊死性のコアを持つ不均一な構造を特徴としており、これは腫瘍内の微小環境だけでなく、抗がん療法における薬剤耐性の主要なメカニズムである薬物浸透に対する生理学的障壁も再現しています13,14,15。
同所性動物モデルとMCS培養技術の両方を利用して、MCSは免疫不全マウスに接種され、乳癌および前立腺癌の同所性モデルの構築に成功しました16,17。ここでは、肺がんのマウス同所異種移植モデルを構築および特徴付けるための詳細な方法論を報告します。この方法は、蛍光ヒト肺がん細胞(A549-iRFP)18に由来する3D MCSの肺内接種を採用しています。このモデルは、NSCLCの4つの臨床病期と密接に並行する病期を通じて肺がんのin vivo進行を観察する絶好の機会を提供します。さらに、このモデルの異種移植癌は、臨床的に確立された抗肺癌薬であるシスプラチンに応答しました。

<table><tbody><tr><td>100 & マイクロ;L ガラスシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>Part/REF #80601</td><td></td></tr><tr><td>20 G ニードル</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14 826D</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル超低付着スフェロイドマイクロプレート&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>15-100-173</td><td></td></tr><tr><td>A549-iRFP</td><td>イマニス ライフサイエンス&nbsp;</td><td>CL082-STAN</td><td></td></tr><tr><td>AIN-93M 成熟げっ歯類の食事&nbsp;</td><td>Research Diets株式会社</td><td></td><td></td>D10012M</tr><tr><td>アテミックヌードマウス</td><td>チャールズリバーラボラトリーズ株式会社</td><td>株コード:490;ホモ接合体</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>ピアス</td><td>23227</td><td></td></tr>ブ<tr><td>プレノルフィン塩酸塩</td><td>パターソン獣医</td><td>NDC番号:42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D細胞生存率アッセイ</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr>コラーゲン<tr><td>Gibco</td><td>A1064401&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>オープンソースツール (https://imagej.net/ij/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>バージョン5.2</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>パターソン獣医</td><td>NDC番号:17033-0091-25</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>パターソン獣医</td><td>NDC番号:50989-0161-06</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡&nbsp;</td><td>キーエンス</td><td>型番:BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>オデッセイ 赤外線イメージング 205 システム&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>型番:9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy 小動物イメージングシステム&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>モデル番号:9430</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAJ67236XF MATLAB の ReViSP ソフトウェア&nbsp;</td><td>Sourceforgeのオープンソースツール(https://sourceforge.net/projects/revisp/)</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>サージカルクリップ - AutoClipシステム</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>パターソン獣医</td><td>NDC番号:61133-6017-01</td><td></td></tr></tbody></table>

疾患進行を模倣し薬物活性を予測する非小細胞肺癌の同所性異種移植モデルの構築

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

非小細胞肺がん(NSCLC)は、複雑で不均一な腫瘍微小環境を伴う致死性の高い疾患です。現在、がん細胞懸濁液の皮下接種に基づく一般的な動物モデルは、NSCLCの腫瘍微小環境を再現していません。ここでは、三次元多細胞スフェロイド(MCS)の肺内接種を採用したマウスの同所性肺がん異種移植モデルについて説明します。具体的には、蛍光ヒトNSCLC細胞(A549-iRFP)を低付着96ウェルマイクロプレートでコラーゲンと共に3週間培養してMCSを形成し、これを胸腺ヌードマウスの左肺に肋間接種して同所性肺がんモデルを確立しました。
A549-iRFP細胞株のMCSは、元のA549細胞株と比較して、抗がん剤に対して同様の反応を示しました。A549-iRFP細胞の長波長蛍光シグナルは、スフェロイド体積、細胞生存率、細胞タンパク質レベルなど、がん細胞増殖の一般的なマーカーと強く相関していたため、蛍光イメージングによる in vivo でのがん増殖の動的モニタリングが可能になりました。マウスへの接種後、A549-iRFP MCS異種移植片は、原発腫瘍の拡大、隣接する二次腫瘍の出現、対側右肺および遠隔臓器へのがん細胞の転移など、NSCLCの臨床病期によく似た段階を経て確実に進行しました。さらに、このモデルは、ベンチマークとなる抗肺がん治療薬であるシスプラチンに反応し、予想される毒性とがんの進行が遅いことが示されました。したがって、このNSCLCのマウス同所性異種移植モデルは、疾患の進行を再現し、潜在的な抗がん剤の開発を促進するためのプラットフォームとして機能します。

A549-iRFP MCS の特性評価 A549-iRFP MCSは、コラーゲンと遠心分離の助けを借りて、スフェロイドマイクロプレートでの培養に成功しました。MCSが1週間後に直径約500μmに達したとき、A549とA549-iRFP MCSの両方をさまざまな抗がん剤および製剤に3日間曝露した後、さらに4日間薬物フリー増殖培地で維持しました。A549-iRFP MCSは、親A549細胞の応答パターンと密接に類似した応答パターンを示しました。A549およびA549-iRFP MCSは、肺がんに対する第一選択の抗がん剤の1つであるシスプラチンと同様の用量反応曲線とIC50値を示しました(図2A)。A549およびA549-iRFP MCSの生存率は、他の抗がん剤または製剤によって同程度に阻害されました(図2B)。
A549-iRFP MCS は、iRFP 蛍光、細胞生存率、および細胞タンパク質レベルによって最大 6 週間にわたってモニターされました。MCSの体積は、位相差顕微鏡画像に基づくソフトウェアシミュレーションにより推定され、模擬形態は顕微鏡および蛍光シグナルで画像化されたものと同様の形状を示した(図2C)。A549-iRFP MCSの細胞生存率は、3D細胞生存率アッセイによって定量化され、アッセイは直径350〜950μmのさまざまなサイズのMCSで検証されました。MCSを含む増殖培地とアッセイ試薬との間のさまざまな容量比、および5分から10分の異なる振とう時間の間で有意差は観察されませんでした。(補足図S1)。4つのバイオマーカーはすべて時間とともに増加し、後の時点ではより大きな変動が見られました(図2D)。iRFP蛍光は、MCSの他の3つの従来の定量的測定値、すなわち体積(Pearson r = 0.9307、p &lt; 0.0001)、細胞生存率(Pearson r = 0.7666、p &lt; 0.0001)、および細胞タンパク質(Pearson r = 0.7317, p &lt; 0.0001)と強い相関を示しました(図2E)。
マウスの腫瘍進行 2〜3週間成長した後、形態、MCS直径、適切な粗いエッジ、蛍光シグナル(詳細なパラメータについては、プロトコルセクション3を参照)などの適切な特性を持つA549-iRFP MCSを腫瘍接種用に選択しました。腫瘍接種手術後、担がんマウスの体重を3日ごとに測定し、手術直前の0日目の体重と比較した変化率として示した。マウスの体重は手術後にわずかに減少し、1週間以内に急速に回復しました。治療を行わなかった場合、体重は~40日目まで徐々に増加しましたが、翌週には大幅に減少(~15%)し、IACUCガイドライン(図3A)に従ってマウスの安楽死(3倍麻酔薬の過剰摂取:80 mg / kgケタミンとIP注射による12 mg / kgキシラジン)につながりました。担がんマウスを3日ごとに左、背側、右側、腹側の4つの姿勢で画像化しました。これらの中で、左(腫瘍が接種される場所)と腹側(肺の両側が観察できる場所)は、式(1)に従って正味蛍光強度を定量化するための主要な姿勢として選択されました(図3B、C)。両方の姿勢からの正味の蛍光強度は、腫瘍進行の同様の傾向を示し、腹側からの蛍光は左側よりもわずかに遅く成長しました。
この同所性モデルのMCS異種移植片は、NSCLCの4つの臨床段階を反映して異なる段階を経て進行した(図3D)18,19,20。MCS接種後8日目頃には、左肺に集中した蛍光が出現し、臨床現場ではステージ1の非小細胞肺がんと一致する限局性腫瘍が認められました。約 11 日目までに、蛍光は左肺の複数の部位に著しく強まり、および/または分散し、ステージ 2 の NSCLC に似た腫瘍の存在を示しました。その後、18日目頃に腹側から蛍光シグナルの増加が観察され、異種移植片のステージ3のような進行が示唆されました。さらに、解剖学的検査とex vivoイメージングにより、ステージ3のNSCLCの重要な特徴である心臓の表面に腫瘍の成長が明らかになりました。MCS接種後約27日目までに、肺の両側に灌流蛍光が現れ、開胸解剖学的構造により、心臓、気管、および主要な血管に灌流腫瘍の成長が明らかになりました。これは、ステージ4のNSCLCに類似したがん転移を示しています。
シスプラチンに対する担がんマウスの反応 この同所性肺がんマウスモデルでパイロット有効性研究が実施されました。腫瘍接種10日後、5 mg / kgシスプラチンまたは生理食塩水を担腫瘍マウスの尾静脈を介して、週に1回、合計2回の注射を行いました。担がんマウスの腹側画像を図4Aに示します。体重と腫瘍の蛍光は3〜4日ごとにモニターした。通常の生理食塩水群と比較して、シスプラチン群のマウスは、各シスプラチン注射後に有意な体重減少しましたが、シスプラチン治療後の数週間で回復しました(図4B)。シスプラチン群の正味蛍光強度は、生理食塩水群よりもゆっくりとした増加傾向を示しました(図4C)。in vivo蛍光モニタリングの最後に、動物を犠牲にし、その肺を解剖し、蛍光によって画像化しました。全組織タンパク質による正常化後、シスプラチン群のマウスから解剖した肺の蛍光強度は、生理食塩水群よりも低いことが確認されました。(図4E)。腹側蛍光イメージング(図4A)では、赤い長方形の画像は、腫瘍蛍光が左肺と右肺の両方で初めて視覚化された時間を示しており、これはステージIVのNSCLCでの腫瘍転移の重要な指標です。第一選択の肺がん治療薬の1つであるシスプラチンは、左肺から右肺への腫瘍転移を遅らせました(図4D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig01.jpg"> 図1:研究のフローチャート (A)A549-iRFP細胞をスフェロイドマイクロプレートに播種し、コラーゲンと遠心分離の助けを借りてMCSを形成します。(B)適切な特性を持つA549-iRFP MCSをマウスの左肺に肺内投与し、臨床現場での肺がんの4つの病期を模倣した同所性肺がん異種移植モデルを構築します。MCSが1本入っている白い注射器は腫瘍接種、赤い注射器2本は尾静脈から投与される薬物治療を示しています。略語:MCS =多細胞スフェロイド。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig02.jpg"> 図2:A549-iRFP MCSの特性評価 (A)3日間の曝露および4日間の無薬物増殖後のA549-iRPF MCSおよびA549 MCSのシスプラチンに対する用量反応曲線（平均±SD、N = 3-4)。(B)抗がん治療(シスプラチン、パクリタキセル、または自社開発の2つの製剤)に3日間曝露した後、および4日間の無薬物増殖(平均±SD、N=3-4)後のA549-iRFP MCSの細胞生存率。(C)造影剤相顕微鏡(C1、スケールバー= 500μm)、蛍光共焦点顕微鏡(C2)、およびソフトウェアシミュレーション(C3)による培養1〜6週間後の代表的なA549-iRFP MCSの形態学的研究。(D)A549-iRFP MCSのiRFP蛍光、体積、細胞生存率、および細胞タンパク質の1〜6週間にわたる動的変化(n=10のiRFP蛍光および容量;N = 5 (細胞生存率および細胞タンパク質)。(E)A549-iRFP MCSのiRFP蛍光と他の3つの従来の増殖測定値(体積、細胞生存率、および細胞タンパク質)との1〜6週間にわたる相関(N = 60)。(F)腫瘍接種に適した特性のA549-iRFP MCSの一例(スケールバー=500μm)。略語:MCS =多細胞スフェロイド。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig03.jpg"> 図3:NSCLCの同所性マウスモデルにおける腫瘍の進行。 (A)腫瘍接種後のマウスの体重の変化(平均±SEM、N=5)。(B)左側イメージングに基づく担がんマウスの正味蛍光強度の動的変化(N = 5)。(C)腹側イメージング(N = 5)に基づく担がんマウスの正味蛍光強度の動的変化。(D)NSCLCの4つの臨床病期を模倣したがんの進行。代表担がんマウスの左側イメージング、腹側イメージング、解剖学的観察(黄色矢印は肺と心臓表面の腫瘍を示す)、代表的な担がんマウスの ex-vivo イメージングを4段階で行っています。この図はHuang et al.18から引用したものである。略称:NSCLC = 非小細胞肺がん。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig04.jpg"> 図4:シスプラチンに対する担がんマウスの反応 (A)生理食塩水またはシスプラチンによる治療後の担がんマウスの腹側イメージング(赤い長方形の画像は、腫瘍の蛍光が左肺と右肺の両方で最初に視覚化できる時期を示しています)。(B)生理食塩水またはシスプラチン治療後の担がんマウスの体重の変化(平均±SEM、N = 3-4)。(C)腹側イメージングに基づく生理食塩水またはシスプラチン治療後の担がんマウスの正味蛍光強度の動的変化(平均±SEM、N = 3-4)。(D)左肺と右肺の両方に腫瘍蛍光を示すマウスの割合。(E) in vivo 蛍光イメージングの終了時に犠牲にしたマウスから解剖した肺の正規化された蛍光強度(平均±SEM、N = 3-4)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:さまざまな直径のA549-iRFP MCSでの3D細胞生存率アッセイ。 (A) ~350 μm;(B)~550μm;(C)~750μm;(D) ~950 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787_Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

この研究は、蛍光A549-iRFP細胞の多細胞スフェロイドの肺内接種に基づく同所性非小細胞肺がん(NSCLC)モデルを示しています。このモデルは、長波長蛍光の動的 in vivo モニタリングに従って、臨床NSCLC病期を再現し、シスプラチンに応答します。

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models ...

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