Name: マウスのドリコ拡張症を誘発するための視覚的アプローチによる大血管媒介性脳血管機能障害のモデル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: 学ぶ マウス脳血管拡張モデルによるアルツハイマー病の血管変化研究。エラスターゼを小脳延髄池に単回投与し、3か月間持続する大血管拡張を誘導する方法を解説。血管性認知症との関連性解明に有用です。

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この研究は、手術の支援に協力したステファニー・タムの貴重な貢献によって可能になりました。これもひとえに心より感謝申し上げます。この研究を支援してくれた国立衛生研究所(AG066162)。

この研究では、生理学的レベルでヒトアミロイドプラークを発現するAppNL-Fマウス(3か月齢)を使用しましたが、このシステムは任意のげっ歯類モデルで使用できます。すべての動物処置は、CAMHの動物管理委員会(プロトコル#843)によって承認され、カナダ動物管理評議会のガイドラインの倫理基準に準拠していました。マウスは社内で飼育され、12時間の明暗サイクルで飼育され、チャウと水に 自由 にアクセスできます。
1. 大槽(CM)注射の手順
<ol><li>手術<ol><li>マウス(APPNL-F、雌雄、3ヶ月)を麻酔導入チャンバーに1分間置きます。 注:5%イソフルランと1%酸素を混合した状態でチャンバーを少なくとも1分間洗い流します。</li>
		<li>マウスに麻酔をかけた後、動物をチャンバーから取り出し、新しい外科用ドレープの上に置き、鼻のコーンを鼻の上に置いて麻酔(イソフルラン、2.5%-3%)を維持します。 注:つま先をつまんで麻酔の深さを確認し、反射神経がないことを確認します。</li>
		<li>乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。その後、切開部位に0.1mLのブピバカイン(局所麻酔薬;1-2mg/kg 0.125%、希釈比1:2)とメタカム(鎮痛薬;5mg/kg、希釈比1:10)を皮下注射します。手術中の潜在的な失血を補うために、手順を行う前に0.5mLの生理食塩水を皮下に注射して動物を水分補給してください。</li>
		<li>明確な切開部位を得るには、後頭骨の基部で首を剃り、滅菌PBSで表面を拭き取り、腹臥位で被験者を定位固定装置フレームに移します。 注意: 麻酔が定位固定装置の鼻円錐を通して維持されていることを確認してください。</li>
		<li>定位固定装置フレームのノーズバーをマウスの上に置き、安定性を確保し、上の歯が固定されるようにします。</li>
		<li>動物の頭部を体から120°の角度で配置して、うなじを持ち上げたり広げたりして、関心のある手術領域を露出させます。</li>
		<li>ベタジンスクラブ3x、70%エタノール3x、およびベタジン溶液1xで手術部位を滅菌2インチx2インチのガーゼで洗浄します。</li>
		<li>ピンセットを使って皮膚をやさしく折り、手術用ハサミで小さな切開(1cm)をします。 注:これにより、首のうなじの正中線が明らかになるはずです。</li>
		<li>メスを正中線に沿って慎重に動かし、筋肉を切り裂きます。次に、ピンセットを使用して、筋肉を左右に引き離すことで筋肉を優しく分離します。 注:これにより、頭蓋骨の基部の下にあるCisterna magna(逆三角形)が見えるはずです(図1)。</li>
	</ol></li>
	<li>エラスターゼの調製 注:注文されたエラスターゼ(粉末状)のパッケージには、250ユニット(U)が含まれていました。各動物に注入するエラスターゼの量は2.5μLです。2.5 μLに含まれると想定されるエラスターゼの量は、15 milliUnits mUである必要があります。<ol><li>まず、注入する溶液の濃度を計算します。 濃度=質量/体積 = 15 mU/2.5 μL = 6 mU/μL したがって、必要な濃度は6 mU /μLです。</li>
		<li>エラスターゼの量は 250 U で、スタディは milliUnits で動作するため、単位を milliUnits に変換すると 250000 mU が得られます。</li>
		<li>質量が250000 mU、濃度が6 mU/uLになった後、エラスターゼを希釈して6 mU/uLの濃度を維持する必要がある容量(PBS)を計算します。</li>
		<li>上記と同じ式を使用して、体積を解くように並べ替えます。 ボリューム=質量/コンク。 = 250000 mU / 6 mU /μL = 41666.67 μL</li>
		<li>41666.67μLはピペットで動かすのが難しいので、単純に1000で割ってミリリットルに換算すると41.66667mLになり、1x溶液が得られます。<ol><li>溶液をより濃縮するには、10倍または100倍に増やします。</li>
			<li>10xソリューションを作成するのは、作業が簡単だからです(下記参照)。 10倍溶液 ---------- 4.166667 mL (濃度)</li>
		</ol></li>
		<li>250Uを5 mLのアリコートチューブに入れ、4.167 mLの滅菌PBSをアリコートチューブに加えて、10倍ストック溶液を調製します。</li>
		<li>10 μLの原液をピペットで移し、100本のアリコートチューブに入れると、4.167 mLの原液1000 μLが得られます。チューブは-20°Cで保管してください。</li>
		<li>残りのストック溶液は、チューブあたり100 μLのアリコートチューブに保管し、-20°Cの冷凍庫で保存します。 注:溶液は-20°Cで最大6か月間安定しており、活性を大幅に損なうことはありません。さらに、エラスターゼの過度の凍結融解は安定性を低下させる可能性があることに注意することが重要です。したがって、それが起こらないようにするために、凍結する前にストック溶液を分割して、一度に1つのサンプルを解凍して注入する必要があるようにすることができます。</li>
		<li>10 μLの10倍溶液を含むアリコートチューブの1つを解凍した後、90 μLの滅菌PBSを加えて100 μL 1x溶液を得ます。</li>
		<li>100μLの10x溶液が入った分注チューブを解凍した場合は、900μLのPBSを加えるだけで1000μL(1x溶液)が得られます。いずれの溶液も4°Cで1週間保存してください。</li>
	</ol></li>
	<li>Cisterna magnaへの注入 注意: エラスターゼをロードする前に、蒸留水5倍、エタノール5倍、最後に蒸留水5倍をロードして吸引することにより、ハミルトンシリンジを清掃します。<ol><li>ハミルトンシリンジに2.5μLのエラスターゼ(濃度15 mU)をロードし、気泡がないことを確認します。.</li>
		<li>ベベルを上に向けてシリンジをシスターナマグナの中央にゆっくりと挿入します。 注:大槽を横切る血管に穴を開けないでください。</li>
		<li>穿刺後、ベベルを取り外します。これにより、少量の脳脊髄液(CSF)の放出が促進されます。滅菌綿棒を使用して、余分なCSFを吸収します。</li>
		<li>ベベルを穿刺部位に再挿入し、エラスターゼまたはビヒクルをシスターナマグナに1分以上ゆっくりと注入し、エラスターゼの漏れを防ぐために針を1分間そのままにします。</li>
		<li>斜角を取り外した後、非吸収性の外科用縫合糸(#4-0と3/8インチの針)で切開部位を閉じ、麻酔薬をオフにします。</li>
		<li>動物を定位固定装置フレームから取り外し、被験者が回復するまで37°Cに設定された温かいヒートパッドに置きます。 注:術後の回復中の痛みを助けるために、手術後にMetacamの別の投与が推奨されます。.</li>
	</ol></li>
</ol>2.シリコーンゴムコンパウンドの注入と組織の収穫
<ol><li>アベルチン(1 mL、125-250 mg / kg)の過剰摂取で動物に麻酔をかけます。. 注意: つま先をつまんで反射が止まるようにします。</li>
	<li>動物をおむつの上に置き、胸腔を上に向けてすべての手足をサージカルテープで固定します</li>
	<li>ピンセットとはさみを使用して胸腔を開き、心臓を露出させます。</li>
	<li>23 Gの鈍い針を心臓の左心室に挿入し、ヘパリン(100 U / mL)を注入したPBSで4分間灌流し、マイクロ灌流ポンプを使用して血管をきれいにします。.</li>
	<li>バッファーボトルを4%パラホルムアルデヒド(PFA)(PBSで構成)が入ったものと交換し、さらに4分間灌流します。</li>
	<li>シリコーンゴムコンパウンド(黄色)溶液を調製するには、50 mLチューブに5 mLのコンパウンドと5 mLの希釈剤を混ぜ合わせます。よく混ぜてからご使用ください。</li>
	<li>10 mLシリンジに10 mLのシリコーンゴムコンポと10 mLを入れます。.23Gの鈍い針に接続されたホースにシリンジを取り付け、手動で溶液を心臓に慎重に注入します。 注:シリコーンゴムコンパウンドの粘度が高いため、より大きなバレルシリンジを使用することが重要です。そうしないと、圧力が高すぎてプランジャーを押すことができません。</li>
	<li>注射後にマウスの頭部を取り外し、4°Cで一晩保存し、シリコーンゴムコンパウンドを血管内で硬化させます。</li>
	<li>翌日、マウスの頭蓋骨を静かに取り除き(できれば細いピンセットを使用)、脳を取り出し、室温(RT)で一晩4%PFAでインキュベートします。</li>
	<li>PFAで24時間インキュベートした後、脳をPBS 3xで洗浄し、30%スクロースに入れ、4°Cで保存します。</li>
</ol>3. 定量分析
<ol><li>脳全体でCircle of Willisの高品質な画像を撮影するには（図3）:<ol><li>スクロース溶液から脳を取り出します。ペーパータオルを使用して脳を完全に乾かし、表面の水分を逃がします。</li>
		<li>脳を脳スライサーに配置します。ブレインスライサーをカメラ付きの光学顕微鏡の下に置きます。</li>
		<li>顕微鏡の焦点をWillisのサークルの鮮明で高解像度の解像度に焦点を合わせます。</li>
	</ol></li>
	<li>10cmの定規リファレンスを備えた画像解析ソフトウェアを使用して、約1cmを測定し、ピクセル数を記録します。この測定値に基づいて1cmの目盛りを設定し、脳底動脈の厚さを水平に測定して直径を求めます。</li>
	<li>標準のピクセルデンシトメトリーソフトウェアを使用して、画像を解析します。画像解析ソフトウェアを使用して脳底動脈の5つの別々の測定値を(センチメートル単位)測定し、平均を計算して脳底動脈の直径を正確に表します。</li>
	<li>二元配置分散分析(ANOVA)を使用して、エラスターゼと対照群の間の直径の平均変化を比較します。<ol><li>21未満の式を使用して、直径の変化率を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66792/66792eq01.jpg" style="margin: auto;"> C = 相対的変化 X1 = 初期値 (車両) X2 = 最終値 (エラスターゼ) P値が0.05未満を統計的に有意とみなします。統計分析ソフトウェアを使用して、すべての統計分析を実行します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. アルコール脱水によるシリコーンゴムコンパウンドの除去
注:免疫染色の品質を向上させる可能性のある血管からの余分なシリコーンゴム化合物を取り除くために、脳を脱水することが重要です。
<ol><li>脳をPBSで3回洗って、スクロースを取り除きます。</li>
	<li>脳を25%、50%、75%、95%、および無水エタノールに各濃度で24時間、合計5日間置きます。</li>
	<li>組織の脱水後、組織をサリチル酸メチル(濃度≤100%)に12〜24時間置きます。エタノールとサリチル酸メチルは、組織内の余分なシリコーンの除去を可能にします。</li>
	<li>PBS 3xで脳を洗浄して残留化学物質を取り除き、新鮮なPBSのロッカーで4°Cに一晩放置します。</li>
	<li>脳をスクロースに入れ、切片化および免疫染色の前に4°Cで保存します。</li>
</ol>5. 免疫組織化学染色
<ol><li>脳の切片化<ol><li>免疫切片の前に、スクロースで満たされたチューブの底に脳が落ち着くのを待ちます。</li>
		<li>ドライアイスに囲まれた最適な切断温度(OCT)化合物を使用して、ミクロトームプラットフォーム上で脳を凍結します。ミクロトームブレードを使用して脳を40μmの切片にスライスします。</li>
		<li>各切片を凍結防止剤を含む96ウェルプレートに移し、細い先端のペイントブラシを使用して凍結を防ぎます。</li>
		<li>96ウェルプレートをラップでしっかりと密封します。密封されたプレートは-20°Cの冷凍庫に保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫蛍光染色(NeuNを例に)<ol><li>切片を24ウェルプレートに入れます。PBSで3回の洗浄を行い、凍結保護剤を排除します。</li>
		<li>非特異的結合を防ぐため、2%ヤギ血清、0.1%Triton-X 100、および1%BSAを含むブロッキング溶液を用いて、RTで1時間インキュベートしてください。</li>
		<li>すべてのコンポーネントをPBSで準備します。 注:使用した一次抗体には、1:500希釈のモノクローナルマウス抗NeuNが含まれていました。使用した二次抗体には、1:200に希釈したポリクローナルヤギ抗マウス568が含まれていました。</li>
		<li>モノクローナルマウス抗NeuNを上記のブロッキング溶液で希釈します。</li>
		<li>希釈した抗体を各ウェルに加えます。ホイルで光から遮蔽し、4°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>一次インキュベーション後、切片をPBSで3回洗浄します。ポリクローナルヤギ抗マウス568を同じブロッキング溶液で希釈します。</li>
		<li>希釈した抗体を各ウェルに加えます。箔で光から遮蔽し、室温で2時間インキュベートします。</li>
		<li>二次インキュベーション後、切片をPBSで3回洗浄します。</li>
		<li>細い絵筆を使用して、セクションをスライドにゆっくりと移すことにより、取り付けの準備をします。すべてのセクションを乾かします。</li>
		<li>切片が乾燥したら、125-150μLの退色防止封入剤を塗布します。カバースリップをそっと置きます。</li>
		<li>スライドを暗闇のRTで24時間乾燥させ、マニキュアで端をシールします。イメージングソフトウェアを使用して蛍光画像をキャプチャします。</li>
	</ol></li>
</ol>

Dolichoectasia:血管性認知症とアルツハイマー病

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利益相反はありません。

この記事では、脳血管拡張のための改善されたプロトコルを示し、マウスの槽マグナへのエラスターゼ注射のための正確で簡単なアプローチを提供します。この解剖学的ポイントは、脳脊髄液への直接の入り口として機能し、さまざまな神経疾患の調査に貴重な手段を提供します。この修正された技術の主な利点の1つは、マウスの大槽にエラスターゼを単回投与で注入すると、反復可能な注射やカニューレの埋め込みを必要とせずに、少なくとも3か月間大きな血管の拡張を引き起こし、維持できたことです。ADマウスモデルにエラスターゼを投与するアプローチは、特に脳内のアミロイドプラークの沈着を促進するための別の注目すべき利点です。通常、AppNL-Fマウス(この研究で利用)などのADモデルは、生後6か月で28歳でプラーク形成を示しました。このモデルを選択したのは、これらのマウスが通常の老化条件下で自然にヒト様のアミロイド沈着を示すためです。生後3ヶ月で大槽にエラスターゼを注入すると、脳血流16を減少させ、血液脳関門の破壊12,13を増加させることにより、ADの病状を悪化させる可能性がある。
大槽への物質の注入は、CSF圧力によって妨げられる可能性があることに注意することが重要です。私たちは、脳へのエラスターゼ送達に対する脳脊髄液(CSF)の潜在的な干渉を排除することはできないことを認識し、その影響を最小限に抑えることを目的とした方法を開発することで、この制限に対処しました。エラスチンを消化するエラスターゼの能力は、動脈硬化の減少をもたらし、それによって動脈を弱め、血管を伸長させて曲がりくねったものにします29,30、ドリコ拡張症を引き起こすための適切な介入になります。
通常、マウス1匹につき大槽への外科的注射が完了するまでに約20分かかります。このプロセスでは、全身麻酔としてマウスに1.5%〜2%のイソフルランを麻酔します。手術中のマウスヘッドの安定性と硬さを確保するために、歯のバーとイヤーバーを備えた定位固定装置フレームの使用を展開することが推奨されますが、これは繊細で重要なステップです。脳定位固定装置フレームの位置決めを間違えると、頭が傾いたり、分娩が不正確になったり、血管に当たる可能性が出てくる可能性があります。メスで皮膚を切るのは面倒なことですが、細かいピンセットで皮膚をつまんで手術用ハサミできれいに切り込み、首筋のうなじの正中線を露出させます。その後、メスは正中線に沿って走ってきれいにカットし、細かいピンセットを使用して筋肉を分離しました。全体として、これにより出血が最小限に抑えられ、マウスの回復がはるかに速くなります。
以前の研究20の結果に基づいて、15 mUのエラスターゼの投与量を選択しましたが、15 mUと25 mUの投与量の間に違いはないことが示されました。さらに、濃度が高いほど死亡率が上昇することにも注目しました。15 mUの投与量で28%の死亡率が報告されましたが20、この研究で使用された方法では、コホート間で死亡者は出ませんでした。すべてのマウスの手術プロセス全体で死亡率はゼロで、手術後3か月までの死亡率は5〜10%でした。ただし、この研究の主な焦点は、大きな血管の拡張であるドリコエクスタジアを理解することにあります。この強調により、拡張を測定するための主要な基準として脳底動脈に集中するようになりました。さらに、マウスのCisterna magnaにエラスターゼを注入すると、大小の血管を拡張する広範な効果が誘発されます。
動物の大槽に注射するときは、針で脳に損傷を与えないように、脳組織と大槽の空間との間の距離を考慮することが重要です。マウスの距離が比較的短いため、シリンジのベベルのみをシスターナマグナに挿入します。感染のリスクを最小限に抑えるために、手術は滅菌済みの手術器具を使用し、マウスに麻酔をかけた状態で行う必要があります。手術前にブピバカインとメタカムを投与することで、術後の不快感を軽減し、動物の回復を早めることができます。頭蓋骨の基部にある大槽は、滅菌綿棒で手術部位を完全に乾燥させることによって見えるようになります。現在の調査では、手術領域のサイズは約 1 cm であり、これは大槽の明確な視界を得るために使用できる最大領域です。さらに、小さな切開部位は、動物がより早く治癒するのを助けます。
Cisterna magna空間内での薬物保持を最大化することが重要です。これまでの研究では、エラスターゼ投与後に注射部位に綿棒を置くことで薬物の漏出を防ごうと試みられていた21。しかし、注入部位での綿の吸収性により、注入後にエラスターゼが再吸収されることでエラスターゼの有効性が損なわれる可能性があるため、この方法の有効性には懸念があります。同様に、別の研究20では、エラスターゼを大槽に注入した後、針はすぐに取り除かれ、最適な薬物が大槽の空間に入ることを確実にする上で別の潜在的な課題を提起し、脳脊髄液へのエラスターゼの漏出につながる可能性があります。したがって、ここで提案される方法は、大槽に穿刺して脳脊髄液(CSF)を放出することから始まり、続いて穿刺部位に滅菌綿棒を配置して過剰なCSFを吸収し、空間内の圧力を軽減します。続いて、綿棒を取り外し、綿棒を再適用せずに槽腔にエラスターゼを注入するために同じ場所に針を再挿入します。さらに、注射後1〜2分間針を所定の位置に保持することを選択し、エラスターゼが大槽全体に適切に拡散してから、静かに引き抜くことを可能にしました。ただし、この技術では、Cisterna magnaに穴を開け、エラスターゼをゆっくりと注入しながら、注射をしない手で針を安定して固定する必要があることに注意してください。さらに、注射時には大槽を横切る大きな血管を損傷しないようにすることが重要です。これは、エンドポイントであり、安楽死を必要とする手術後の旋回などの合併症を引き起こす可能性があるためです。全体として、この方法は、1回のエラスターゼ注入から大槽への1回の注入から最大3ヶ月間持続する拡張を示しており、これは以前の方法で観察された20,21を上回っています。結論として、このアプローチは拡張の持続時間を延長するだけでなく、エラスターゼなどの物質を一貫して脳に直接送達します。この方法は、血液脳関門を越えて物質を輸送するための低侵襲アプローチで好まれており、中枢神経系への薬物送達をさらに拡大できるため、追加の利点があります。

脳毛細血管の内側を覆う微小血管内皮細胞は、血液脳関門(BBB)1を形成する主要な構成要素であり、末梢の脳循環に出入りするものを調節する重要な役割を果たしています。神経組織に必要な必須栄養素はBBBに入ることが許可されていますが、グルタミン酸などの一部の必須アミノ酸は脳から排出されます。これは、高濃度が脳組織に永続的な神経興奮性損傷を引き起こす可能性があるためです2。通常の生理学的条件下では、BBBはアルブミン3,4やプロトロンビンなどの血漿タンパク質が脳に入るのを制限します5,6,7。最後に、BBBは、食品や環境からの生体異物など、末梢を循環している神経毒から脳を保護します1。全体として、脳組織への損傷は不可逆的であり、低レベルの神経新生と相関する老化8は、神経変性プロセスを加速するあらゆる要因を保護し、防止するBBBの重要性を強調しています。
ドリコエクタ症(または大血管拡張症)では、血管の弾力性の低下が観察され、その結果、血管が形態学的に変化し、その結果、血管が機能不全 に陥り9、脳内の血流が減少する。この血流の減少は、その後、酸素とグルコースの供給を減少させ、最終的には反応性アストロサイトの活性化を通じてBBBに損傷を与える10。ドリコエクスターゼ11により血管の内部エラスチン層が損傷を受けた場合、血管新生には血管内皮増殖因子(VEGF)の刺激を繰り返す必要がある。これは、漏れやすい血管の形成につながり、最終的には、欠陥のある血管の発達を特徴とする病理学的血管新生をもたらす可能性がある12。病的な血管新生では、血管が欠損すると、タイトジャンクションタンパク質をアップレギュレーションすることにより血管の完全性を回復する代償メカニズムが現れます。しかし、このプロセスは、血管の構造的完全性が失われたときに、不注意でBBBを混乱させる可能性がある13。これは、BBBをさらに破壊し、アミロイドプラーク14の産生を促進することによって起こり得る。さらに、末梢からの漏出は神経炎症15を引き起こし、その結果、ニューロンの変性とそれに続く記憶喪失を引き起こす可能性がある。
構造的には、BBBが提供する保護は、生体異物が血液が脳に入るのを防ぐタイトジャンクションを介して行われます。特定の物質が脳に入るのを許すとき、BBBは主に受動的拡散、または特定のチャネル(イオンチャネルやトランスポーターなど)1の2つの主要なプロセスを通じてそれを行います。ADでは、機能不全の血管系が状態の進行に重要な役割を果たしていることが研究で実証されています12,13。アミロイドβ(Aβ)プラークの形成と神経変性は、BBBの破壊12,13と脳血流の乱れ16から生じる可能性がある。脳血流の減少は、血管性認知症と診断された高齢者とAD17,18で見られます。機能不全の脳血流(CBF)とともに血液脳関門(BBB)の損傷は、末梢循環からの異物の浸潤を伴う脳内のAβ濃度の産生の増加に寄与する可能性があります19。
ADや血管性認知症(VaD)などの神経疾患の病因を調査するために、疾患を再現するモデルが開発されています。in vitroモデルは広く使用されていますが、混合細胞集団のような広範な疾患モデリングのための生物学的環境が不足しているため、in vivoモデルの重要性が必要です。マウスは、疾患においてヒトのような特性(例えば、病理学)を生成する際の遺伝子操作の容易さのために一般的に使用されます。これまでの進歩に伴い、大血管拡張などの疾患表現型やADにおけるその役割を模倣するための改良モデルが引き続き必要とされています。この目的のために、私たちは機会を見出し、マウスのCisterna magnaにエラスターゼを注入することを含む技術を変更しました20,21。エラスターゼは、結合組織22および周囲のタイトジャンクション23でエラスチンを分解することが示されている酵素である。大槽は、脳内で最大の血管であるウィリスの円の真上に位置しているため、注射点として選択されました。大槽にエラスターゼを注入することにより、タイトジャンクションを破壊し、血管の拡張を誘発することにより、BBBと血管を損なうことができます(ウィリスの円)24,25。この手法を病理学のADマウスモデルの使用と組み合わせることで、ADの血管成分の病因の理解を深めることで、これら2つの異なる病状間の複雑な相互作用と影響に関する貴重な洞察を得ることができます。
以前の研究では、患者がADとVaDの両方の病理学的特徴を示す例が実証されており、この状態は一般に混合型認知症と呼ばれます26,27。したがって、両方の状態間の相互に関連するメカニズムを理解することは、これらの神経変性疾患の進行と発現についてより包括的な視点を提供し、根本的なメカニズムと潜在的な治療戦略の理解を深めることができます。この目的のために、AD病理マウスモデル(AppNL-F)でのエラスターゼの適用を示し、血管の変化を特定します。

<table><tbody><tr><td>23 Gカテーテル</td><td>University Medstore</td><td>2546-CABD305145</td><td>灌流に必要&nbsp;(https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>大学Medstore</td><td>https://www.uoftmedstore.com/index.sz</td><td>マイクロフィルベ</td></tr><tr><td>タジンスクラブ</td><td>#</td><td>https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>ベタジン溶液</td><td>アマゾン</td><td>https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>ブピバカインを除去するため</td><td>動物施設提供</td><td>N/A</td><td>鎮痛剤</td></tr><tr><td>クリッパー</td><td>BrainTree Scientific Inc</td><td>CLP-41590</td><td>毛皮を剃</td></tr>る <tr><td>コットン Q-tip</td><td>大学 Medstore</td><td>1962</td><td>手術用 (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td></tr><tr><td>エラスターゼ</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&nbsp;E7885</td><td>血管の拡張に使用</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>大学 Medstore</td><td>39752-P016-EAAN</td><td>滅菌 (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td></tr> <tr><td>ヤギ抗マウス 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td>成熟ニューロンの染色用</td></tr><tr><td>Graphpad prism 10 Graphpad</td><td>prism 10</td><td>https://www.graphpad.com/</td> <td>統計解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td>Sigma-aldrich</td><td>28614-U</td><td>インジェクション エラスターゼ</td></tr><tr><td>ヒートパッド</td><td>アマゾン</td><td>https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ</td><td>体温維持</td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>フィジー Imagej ソフトウェア</td><td>imagej.net (USA)</td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>誘導室</td><td>動物施設提供</td><td>N/A</td><td>麻酔誘導</td></tr><tr><td>メタカム</td><td>動物施設提供</td><td>N/A</td><td>鎮痛剤</td></tr>サ<tr><td>リチル酸メチル</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6752</td><td>マイクロフィルを除去するため</td></tr><tr><td>Microfil</td><td>Flow Tech, Carver, Massachusetts</td><td>https://www.flowtech-inc.com/order/</td><td>&nbsp;色素(黄)</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗NeuN</td><td>ミリポアシグマ</td><td>MAB377</td>成熟<td>ニューロンの染色用</td></tr><tr><td>オリンパスVS200スライドスキャナーとVSIソフトウェア。</td><td>オリンパスライフサイエンス</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[ダウンロード][id]=847254104</td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>大学メッドストア</td><td>PAR070.1</td><td>タンパク質固定用&nbsp;(https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>VWR International</td><td>https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps</td><td>灌流に必要</td></tr><tr><td>メス</td><td>大学 Medstore</td><td>2580-M90-10</td><td>手術用 (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td></tr><tr><td>定位固定装置</td><td>動物施設提供</td><td>N/A</td><td>手術のために動物を固定する</td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>University Medstore</td><td>22751-A9-240</td><td>手術用 (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td></tr><tr><td>手術テープ</td><td>University Medstore</td><td>https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2</td><td>動物をおむつに固定</td></tr>する <tr><td>縫合糸</td><td>University Medstore</td><td>2297-VS881</td><td>手術用 (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td></tr><tr><td>X2ピンセット</td><td>University Medstore</td><td>7731-A10-612</td><td>手術用 (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td></tr></tbody></table>

マウスのドリコ拡張症を誘発するための視覚的アプローチによる大血管媒介性脳血管機能障害のモデル化

A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction

血液脳(BBB)は、例えば、末梢部で選択的な脳循環を調節する重要なシステムであり、必要な栄養素が脳に過剰なアミノ酸や毒素を流入し、脳から排出することを可能にします。 血管性認知症(VaD)やアルツハイマー病(AD)などの疾患でBBBがどのように損なわれるかをモデル化するために、研究者たちは血管拡張をモデル化する新しい方法を開発しました。これらの疾患状態でBBBが損なわれると、有害であり、BBBの調節不全を引き起こし、脳機能に影響を与える不都合で病理学的な結果につながる可能性があります。私たちは、大槽(CM)に直接注入してエラスターゼを使用して血管の拡張を誘導し、BBBのタイトジャンクション(TJ)を破壊することを可能にする既存の技術を変更することができました。この方法により、一貫した血管拡張、死亡率の低下または回復の改善、シリコーンゴムコンパウンドである充填/混濁剤の改善、拡張分析のための血管標識送達の改善など、以前の技術に対する成功のさまざまな指標を確認することができました。この改良された低侵襲法は有望な結果をもたらしており、注射後2週間から3か月にかけてマウスの大血管の持続的な拡張が19%〜32%増加しました。この改善は、2週間の時点でのみ拡張の増加を示した以前の研究とは対照的です。追加のデータは、9.5か月後も持続的に拡大することを示唆しています。この増加は、エラスターゼとビヒクル注入群の血管の直径を比較することによって確認されました。全体として、この手法は、動物モデルを使用して中枢神経系(CNS)に影響を与える病理学的障害を研究するために価値があります。

マウスを脳定位フレームに慎重に配置し、筋肉を解剖した後、頭蓋骨の後頭部の下に大槽を見つけることに成功しました。この解剖学的構造は、逆三角形に似ており、黄色で強調表示されており、頭蓋骨の基部の下に位置しています(図1)。精度を確保し、脳組織への損傷を防ぐために、ハミルトンシリンジベベルの1〜2mmをシスターナマグナに優しく挿入しました。
エラスターゼ注射後、動物にPBSおよび4%PFAを3つの異なる時間間隔(2週間、1か月、および3か月)で灌流した。その後、 図2に示すように、血管の可視化を改善するために、それらの血管をシリコーンゴムコンパウンドで固定しました。定性的には、エラスターゼによって誘発される拡張は、ビヒクル注射を受けた対照群と比較して、Circle of Willisの周囲の小さな血管と肥大した曲がりくねった脳底動脈の視認性が向上したことを明らかにします(図3)。
定量分析の結果、エラスターゼ群と対照群との間に有意差が認められ、注射後2週間(32%増、p値=0.019)、1ヵ月後(19%増、p値=0.020)、3ヵ月後(20%増;p値=0.020)にエラスターゼ群の血管拡大がみられました(図4)。その後、エタノール濃度を徐々に増加させ、続いてサリチル酸メチルに浸すことによる脳の脱水により、過剰なシリコーンゴム化合物の除去が容易になり、組織学的染色の品質が向上しました(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig01.jpg"> 図1:Cisterna magnaの位置。 視覚化の強化により、隣接する首の筋肉から分離された大槽が明らかになり、脳と頭蓋構造、特に後頭骨との関係でその位置が示されます。黄色の三角形で強調された大槽は、逆三角形に似ており、解剖学的描写に明瞭さを提供します。スケールバー:5 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig02.jpg"> 図2:黄色の染料の注入。 経心灌流は、組織学的染色のための組織の準備に利用されました。(A)マウスの灌流セットアップでは、PBSを体内に4分間送り込んで血液を採取し、続いてPFAをさらに4分間注入してタンパク質を固定しました。(B)灌流後にマウスの左心室に色素を注入すると、脳内の血管の視認性が向上し、肉眼での観察が容易になります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig03.jpg"> 図3:エラスターゼとPBSを注入した脳のピクトグラフ。 この視覚化は、対照群(PBS)と比較して、エラスターゼ注入後のCW周囲のBAの拡大とねじれの増加を示しています。CW、ウィリスの輪。BA、脳底動脈。スケールバー:3 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig04.jpg"> 図4:3か月にわたるエラスターゼによる血管の持続的拡張。 PBSで治療した対照群と比較して、生後3か月齢のマウスのCisterna magnaに1回のエラスターゼ注射を行った後、3ヶ月間持続した血管の拡張が認められました。脳底動脈は、エラスターゼ注射の2週間後、1か月後、および3か月後に測定されました。データは平均±SDです。2-way Anova、Sidak(事後テスト);*p &lt; 0.019 (2 週間)、*p &lt; 0.020 (1 か月)、および *p &lt; 0.020 (3 か月)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig05.jpg"> 図5:過剰な黄色色素を除去した後の脱水脳のNeuN染色。 脳をエタノールとサリチル酸メチルの濃度をそれぞれ24時間増加させた後、ミクロトームを使用して脳を切片化し、ニューロンマーカーNeuNについて染色しました。この図では、白い矢印で示されているように、(A)脱水されていない脳は、(B)脱水された脳と比較して、より大きな目に見える血管を示すことが明らかです。これにより、血管に関連するバックグラウンド干渉が減少するため、これらの切片のより正確な分析が容易になります。スケールバー:3μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig05large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

脳血管機能障害のモデルとして、マウスに大血管拡張を化学的に誘導することを実証し、血管性認知症やアルツハイマー病のモデリングに用いることができます。また、シリコーンゴムコンパウンドを注入して血管系を可視化し、血管サイズの変化を測定するための明確な視覚的ガイダンスを提供する方法も示しています。

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Research

JoVE Journal

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