Name: 三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 31 s
Description: 学ぶ 三次元フィブリンハイドロゲルを用いたヒト胸腺オルガノイドの作製法。胸腺上皮細胞の成熟とT細胞産生を支援し、自己免疫疾患や移植医療への細胞治療応用に貢献する研究手法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>iPS細胞由来オルガノイドによる胸腺微小環境の再現

<ol><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).</li>
<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+thymus+and+its+impact+on+modern+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The function of the thymus and its impact on modern medicine.</a> Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).</li>
<li>Haddad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus-colonizing+cells+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus-colonizing cells during human development.</a> Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).</li>
<li>Cumano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+insights+into+immune+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New molecular insights into immune cell development.</a> Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).</li>
<li>Bautista, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+human+thymic+stroma+uncovers+novel+cellular+heterogeneity+in+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla.</a> Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).</li>
<li>Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cell+heterogeneity%3A+TEC+by+TEC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC.</a> Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).</li>
<li>Alves, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+progression+of+cortical+and+medullary+thymic+epithelial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments.</a> Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Tavian, M., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+human+hematopoietic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the human hematopoietic system.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).</li>
<li>Abramson, J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells.</a> Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Sharma, H., Moroni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+regenerative+approaches+for+thymus+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation.</a> Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix%2C+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins.</a> Sci STKE. 2002 (119), 6(2002).</li>
<li>Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).</li>
<li>Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+thymic+extracellular+matrix+improves+in+vivo+thymic+organoid+T+cell+output%2C+and+drives+in+vitro+thymic+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation.</a> Biomaterials. 118, 1-15 (2017).</li>
<li>Asnaghi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+extracellular+matrix-derived+scaffolds+support+graft-resident+thymopoiesis+and+long-term+in+vitro+culture+of+adult+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells.</a> Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).</li>
<li>Villegas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+thymic-derived+cells+display+medullary+thymic+epithelial+cell+phenotype+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality.</a> Front Immunol. 9, 1663(2018).</li>
<li>Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+TGF-%CE%B2+signaling+in+the+establishment+and+function+of+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla.</a> Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Campinoti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+thymus+by+postnatal+stromal+progenitor+cells+and+natural+whole-organ+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds.</a> Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+thymus+organoids+to+restore+thymic+function+and+induce+donor-specific+immune+tolerance+to+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts.</a> Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).</li>
<li>Provin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+generates+thymic+epithelium+that+supports+thymic+crosstalk+and+directs+dendritic-+and+CD4%2FCD8+T-cell+full+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development.</a> bioRxiv. 2023, 572664(2023).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+that+supports+host+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+thymic+epithelial+progenitor-like+cells+reconstitutes+the+thymic+microenvironment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).</li>
<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+to+thymic+epithelial+cells+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype.</a> Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).</li>
<li>Gras-Pena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+thymic+epithelial+cells+enhance+human+T+cell+development+in+a+xenogeneic+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).</li>
<li>Lai, L., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+thymic+epithelial+cell+progenitors+by+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+thymic+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).</li>
<li>Provin, N., Giraud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+thymic+epithelial+cells+and+generation+of+thymic+organoids%3A+Applications+for+therapeutic+strategies+against+APECED%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED.</a> Front Immunol. 13, 930963(2022).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+murine+thymopoiesis+from+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells.</a> Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).</li>
<li>Park, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+T+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), 3224(2020).</li>
<li>Flippe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reproducible+differentiation+of+hematopoietic+and+T+cell+progenitors+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).</li>
<li>Padonou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire-dependent+transcripts+escape+Raver2-induced+splice-event+inclusion+in+the+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium.</a> EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).</li>
<li>Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-oxygen+submersion+fetal+thymus+organ+cultures+enable+FOXN1-dependent+and+-independent+support+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis.</a> Front Immunol. 12, 652665(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アプロチニン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-165</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (CD197)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: 3D12;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>クローン:M5E2;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>クローン:HIB19;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>CD205</td><td>BioLegend</td><td>FITC</td><td>クローン:MG38;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>クローン:HIT3a;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>クローン:8G12;希釈率:1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>クローン:RPA-T4;希釈率:1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BV711</td><td>クローン:L200;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>PerCP</td><td>クローン:HI30;希釈:1:200</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>クローン:B159;希釈:1:200</td></tr><tr><td>CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>BV605</td>クローン<td>:DREG-56;希釈:1:200</td></tr><tr><td>CD69</td><td>BD Biosciences</td><td>BV510</td><td>クローン:FN50;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD Biosciences</td><td>APC</td><td>クローン:M-T701;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PeCy7</td>クローン<td>:RPA-T8;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>クローン:HIT8a;希釈率: 1: 200</td></tr><tr><td>Dynabeads Pan Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HEA-125;希釈率:1:200</td></tr><tr><td>EPCAM(CD326)</td><td>Miltenyi</td><td>BV711</td><td>クローン:EBA-1;希釈:1:200</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Miltenyi</td><td>130-127-858</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Biotechne R&D</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>フィブリノーゲン</td><td>Σ アルドリッチ</td><td>341578</td><td></td></tr><tr><td>FLT3 L</td><td>ペプロテック</td><td>AF-300-19</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>ギブコ</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>ミルテニー</td><td>130-093-886</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>ペプロテック</td><td>AF-200-07</td><td></td></tr><tr><td>RANK L</td><td>バイオテクネ R&D</td><td>6449-TEC</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解液</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-07</td><td></td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605190</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>2605010</td><td></td></tr><tr><td>XVIVO10</td><td>Lonza</td><td>LONBE04-380Q</td><td></td></tr></tbody></table>

三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

このプロトコルのワークフローを 図 4 にまとめます。この3Dオルガノイド培養モデルでは、物理的および機械的な手がかりを提供したおかげで、私たちのチームが以前にマウスの一次mTECを数日間維持するために使用していたトロンビンとフィブリノーゲンのハイドロゲルを採用しました34。重合後、ゲルは緩いスポンジのようなメッシュ構造を示すはずです(図5)。
最初の播種および付着段階の後、オルガノイドはゲルの表面および最上層の両方で徐々に成長し、発達しました。ゲルの特性、播種条件、およびゲルに播種されるオルガノイドの数に応じて、オルガノイドは球状から長方形の構造(図6)を形成し、時には融合してより大きな構造を形成します。培養の最初の週の後、オルガノイド内で組織の2つの特定のサブレベルが観察されました:まず、オルガノイドから照射され、ハイドロゲルを全方向にコロニー形成する大きな細胞によって形成される長い細胞表面投影様構造を観察しました(図6 および 図7)。次に、その細胞突起の周りに小さな細胞が集中して形成されるクラスター状の構造を観察しました。研究仮説を確認するために両方の細胞タイプを分離することはできませんでしたが、この現象は、胸腺皮質内に見られる3D配列を彷彿とさせます。これは、個々のcTECと胸腺看護師細胞複合体として知られる多数のはるかに小さな発達中のT細胞との相互作用によって形成されます11 (図8)。
オルガノイド培養段階のいくつかの時点で、フローサイトメトリーにより胸腺オルガノイドの細胞組成を評価し、TEC(EPCAM+ CD45-として特徴付けられる)、胸腺細胞(EPCAM- CD45+ CD3+)(図9)、および胸腺造血非胸腺細胞サブセットを含むEPCAM-CD45+ CD3-コンパートメントなど、いくつかの主要なコンパートメントを特定しました。詳細については、Provin et al.23を参照してください。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig01.jpg"> 図1:iPSCからTEPへの分化特性 評価 (A)D13でのiPS細胞からTEPへの分化の例、逆位相差顕微鏡、400倍。スケールバー:500μm.(B)ドットプロットの例、分化14日目のDAPI-細胞中のEPCAM+細胞の割合、FlowJo 10.0.7からの画像。(C)iPSCからTEPへの分化の16日目のDAPI(青)、PAX9(赤)、およびKRT8(緑)に対する免疫染色、免疫蛍光、および共焦点イメージング。白い矢印は抗PAX9染色の例を示しています。スケールバー:50 μm (D) iPSからTEPへの分化中のFOXN1(RQからGAPDH)の発現レベル。TEC:ポジティブコントロールリファレンス、小児胸腺サンプルから単離された一次ヒトTECs。Prism(GraphPadバージョン8.0.1)のグラフ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig02.jpg"> 図2:ハイドロゲル形成、オルガノイド播種、および培地分配の実験セットアップ(A)ハイドロゲルを吊り下げインサートにキャストした培養プレートを上段と下段に配置した。(B)オルガノイド播種:オルガノイド1個が入ったカットピペットコーンをヒドロゲルに触れずに上に配置し、オルガノイドをゲルの表面に穏やかに播種します。(C)培地は、ピペットの先端を吊り下げインサートのアームの間に配置することにより、培養ウェルに堆積します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig03.jpg"> 図3:播種前の胸腺オルガノイド培養のD0(全プロトコルの13〜15日目)。 (A)Lon71.019 iPS系統由来のTECで作製したオルガノイド。(B)MIPS203.003 iPS系統由来のTECで作製したオルガノイド。倒立位相差顕微鏡、1000倍。スケールバー:500μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig04.jpg"> 図4:プロトコルのすべてのステップをまとめたものです。 小児胸腺サンプルを採取して解離し、一次Lin-CD34+ CD7+ ETPをフローサイトメトリーで選別しました。iPS細胞の分化は、TEP同一性を目指して行われました。ETPとiPS由来TEPをプールして低結合の96ウェルプレートに播種し、一晩で胸腺オルガノイドに凝集しました。フィブリンハイドロゲルは、アプロチニン、フィブリノーゲン、トロンビンから調製し、ハンギングインサートにキャストしました。重合後、オルガノイドをハイドロゲルの上に播種し、フェーズ1の培地をウェルに加えました。オルガノイドは、最大6週間培養されました。BioRenderで作成され、出版ライセンスAG26EFCZOM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig05.jpg"> 図5:ハイドロゲルの組織と構造。 倒立位相差顕微鏡、1000倍。スケールバー:500μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig06.jpg"> 図6:成熟したオルガノイドと三次元構造 (A)3D培養24日目の胸腺オルガノイド、MIPS203.003 iPS株。(B)3D培養32日目の胸腺オルガノイド、Lon71.019 iPS系統の合成画像。倒立位相差顕微鏡。スケールバー:500μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig06large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig07.jpg"> 図7:胸腺オルガノイドの構造詳細(A)3D培養32日目の胸腺オルガノイド、L71.019 iPS系統。(B)3D培養27日目の胸腺オルガノイド、L80.002 iPS株。倒立位相差顕微鏡、400倍。スケールバー:500μmこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig07large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig08.jpg"> 図8:3D培養32日目の胸腺オルガノイドの構造の詳細。 白い矢印は、TEC細胞のすぐ近くで増殖する小さな胸腺細胞のクラスターを示しています。倒立位相差顕微鏡、400倍。スケールバー:500μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig09.jpg"> 図9:胸腺オルガノイド内のT細胞コンパートメントの割合。 (A)ドットプロットの例、3D培養の35日目の胸腺オルガノイドの生(DAPI-)細胞内のCD45+ CD3+細胞の割合、FlowJo 10.0.7からの画像。CD45+ CD3-画分は、造血非胸腺細胞を含む。(B)3D培養の17日目、24/25日目、32日目、および39/40日目の胸腺オルガノイドの生細胞内のCD45+ CD3+細胞の割合、技術的に重複または三重のn=2、Prism(GraphPadバージョン8.0.1)のグラフ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>単位</td>
			<td>フェーズ 1 中 14 日目から 18 日目まで</td>
			<td>フェーズ2、中、19日目以降</td>
		</tr><tr><td>基</td>
			<td></td>
			<td>XVIVO10</td>
			<td>XVIVO10</td>
		</tr><tr><td>BMP4の</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF8</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF10</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>IGF1の</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGFの</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Lランク</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>IL7</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FLT3 L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>SCFの</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>グルタマックス</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr></tbody></table>表1:サプリメントとそれぞれの濃度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>アプロチニン(μL)</td>
			<td>トロンビン (μL)</td>
			<td>フィブリノーゲン (μL)</td>
			<td>フェーズ1ミディアム</td>
			<td>オルガノイド(ユニット)</td>
		</tr><tr><td>24ウェルプレート</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>3 から 5</td>
		</tr><tr><td>12ウェルプレート</td>
			<td>9.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>6ウェルプレート</td>
			<td>16</td>
			<td>240.8</td>
			<td>240.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>8 から 9</td>
		</tr></tbody></table>表2:6ウェル、12ウェル、24ウェルプレートにハイドロゲルを調製し、オルガノイドを播種するために必要な成分の比率。

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

formation-human-thymus-organoids-three-dimensional-fibrin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは胸腺の文化を再集合させる2 -...

胸腺文化を再集合させる

現在の2D培養システムはin vivoのシナリオを模倣していないため、in...

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

このビデオは、FACS単離のための密度勾配で胸腺上皮細胞（TEC）を濃縮するプロトコールを示しています。また、EAK16-II/EAKIIH6ペプチドを使用してTEC凝集体の形成を促進する様子も示しています。EAK16-II/EAKIIH6ハイドロゲルの微小環境は、TECの生存と機能を維持するために必要な3D構成を提供します。...

EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。...

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

ここでは、腱の基礎研究に有望なツールと、腱組織工学のための潜在的な足場のない方法を提供する3ステップオルガノイドモデル(2次元[2D]拡張、2D刺激、3次元[3D]成熟)を実証します。...

ヒト真皮線維芽細胞を用いた自己組織化細胞シート培養の実証と3次元腱・靭帯様オルガノイドの手動生成

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

本プロトコルは、制御された三次元培養システムにおいて乳腺形態形成の重要な特徴を再再現するヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルを用いた方法を記述しています。...

乳腺形態形成を再現する三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルベースの方法

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いたヒトの腸オルガノイドのリアルタイム次の薬理学的治療における上皮バリア透過性の測定について説明し、細胞顕微鏡検査をライブします。...

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

学ぶ 三次元フィブリンハイドロゲルを用いたヒト胸腺オルガノイドの作製法。胸腺上皮細胞の成熟とT細胞産生を支援し、自己免疫疾患や移植医療への細胞治療応用に貢献する研究手法です。

三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成

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