Name: げっ歯類の心臓移植片の灌流時間を延長するための修正ランゲンドルフ灌流 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 学ぶ 修正ランゲンドルフ灌流法によるげっ歯類心臓移植片の長時間灌流技術。低灌流圧（30-35 mmHg）を用いて心機能を維持し、心血管研究における移植片保存の最適化手法を示します。

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この研究は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)からS.N.T.への寛大な資金提供によって支えられました(K99/R00 HL1431149;R01HL157803)およびアメリカ心臓協会(18CDA34110049)。また、米国国立衛生研究所(R01DK134590;R24OD034189)、全米科学財団(EEC 1941543)、ハーバード大学医学部エレノア・アンド・マイルズ・ショア・フェローシップ、ポルスキー・ファミリー財団、MGH研究執行委員会を代表してクラフリン特別奨学生賞、シュライナーズ・チルドレンズ・ボストン(Grant #BOS-85115)。

この研究は、マサチューセッツ総合病院の動物管理および使用委員会(IACUC)に従って実施されます。
1. システム設計
<ol><li>バブルトラップ、リザーバー、酸素供給器、蠕動ポンプ、水循環器の3つのダブルジャケットコンポーネントを使用してシステムを組み立てます。</li>
	<li>すべてのジャケット部品を1つのクランプスタンドに取り付けます。コンポーネントをシリコンチューブで2つの異なる順序で順番に接続します(図1A)。<ol><li>シーケンス 1 - ジャケットを通る水の流れパターン ( 図 1A の実線):<ol><li>36Gチューブを使用して、水循環器の流出をバブルトラップジャケットの下部入口に接続します。これにより、水がシステムの他のコンポーネントを通過するときに熱が失われるため、灌流液が心臓に到達する前に適切な温度(37°C)に保たれることが保証されます。</li>
			<li>バブルトラップジャケットの上部インレットをリザーバージャケットの下部インレットに同じサイズのチューブを使用して接続します。</li>
			<li>次に、リザーバージャケットの上部インレットを酸素供給器ジャケットの下部インレットに接続します。</li>
			<li>最後に、酸素供給器の上部入口を水循環器の流入に接続します。</li>
		</ol></li>
		<li>シーケンス 2 - システム内の灌流液のフロー パターン ( 図 1A の破線)<ol><li>ルアーコネクターを16Gチューブの両側に取り付けます。最初の端をリザーバーのベースに取り付け、蠕動ポンプヘッドに通します。もう一方の端を、酸素供給器内のシリコンコイルの入口の1つに接続します。</li>
			<li>酸素供給器のシリコンコイルの2番目の入口にある、両端にルアーロックコネクタが取り付けられた16Gチューブの2番目の部分を、長い突起のあるバブルトラップの入口に接続します。</li>
			<li>ルアーコネクターが取り付けられた短い16Gチューブを、バブルトラップの未使用の出口に接続して、3方向ルアーロックバルブに接続します。</li>
			<li>三方弁の反対側で、16 G チューブの一部をもう一方の端に 2 つ目のルアーバルブで接続します。この2番目のバルブは、リザーバーのすぐ上にあります。バルブの反対側を16Gチューブに接続し、続いて圧力センサーを接続します。</li>
			<li>小径のチューブ( ̃3.7 mm)を三方弁の垂直ポートに接続し、カニューレ(14 G血管カテーテル)へのコネクタを使用します。灌流液は、リザーバーからバブルトラップを通って酸素供給器に流れ、大動脈カニューレ接続を介してリザーバーに再循環します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 灌流液の調製
<ol><li>ベース灌流液、0.96% Krebs-Henseleit Buffer、9.915 mM Dextran、25 mM 重炭酸ナトリウム、1.054 mM ウシ血清アルブミン、1% ペン溶連菌、0.13% インスリン、0.02% ヒドロコルチゾン、0.5% ヘパリン、および 2.75 mM 塩化カルシウムを調製し、蒸留水で容量に戻します。</li>
</ol>3. 灌流システムのセットアップ
<ol><li>2つの10 mLシリンジをバブルトラップの上部と側面のベントポートに接続します。</li>
	<li>ベース灌流液(75 mL)をリザーバーに加えます。蠕動ポンプをオンにし、水循環器を37°Cに設定します。</li>
	<li>酸素(95%O2 および5%CO2)ラインを酸素供給器の3番目の入口に接続し、灌流液を最小pO2 の400mmHgまで酸素化します。</li>
	<li>注入ポートをバブルトラップのすぐ過ぎたところにある三方弁の垂直ポートに固定します。1 mLシリンジで翼のある注入針を注入ポートに接続します(サンプリングに使用)。注入ポートを軽くたたくか、1 mLシリンジで灌流液を吸い込み、回路に導入された気泡を取り除きます。</li>
	<li>ベース灌流液が温度と酸素レベルに達したら、生化学的パラメーターの初期読み取りを行い、正しいイオン濃度(表1)と適切な酸素化を確認します。 注:イオンレベルとpHレベルは、溶液が温度(37°C)まで上昇し、適切なガス混合物(95%O2、5%CO2)で酸素化された後に読み取る必要があります。</li>
	<li>接続されたチューブのクランプを解除して圧力センサーをゼロにし、開いたセンサーとカニューレを通る灌流液の流れを平衡化させます。平衡化したら、センサーボックスのゼロボタンを押して、チューブを再度クランプします。心臓がシステムに接続する前に、1 mL/分から15 mL/分の範囲の流量の基本圧を記録します。</li>
	<li>低圧灌流<ol><li>アデノシン点滴:ベース灌流液中にアデノシンの初期20 mMストックを作成します。アデノシンを溶解するには、チューブを温水浴に入れ、反転して混合します。</li>
		<li>ストックアデノシンをさらに希釈して、ベースパフュージで0.06 mg / mLのコンサートにし、50 mLシリンジに加えます。.</li>
		<li>50mLシリンジに翼のある輸液針を取り付け、三方弁の注入口に接続します。シリンジをシリンジポンプに固定し、注入速度を166.6μL / minに設定します。 注意: 気泡は、ポートを軽くタップまたはフリックすることで注入ポートから放出されます。.</li>
	</ol></li>
	<li>高圧灌流:<ol><li>パック赤血球(pRBC)の単離:<ol><li>ドナーラットの心臓穿刺により、10〜12 mLの全ラット血液を採取します。</li>
			<li>血液を2000 x g で10分間遠心分離します。</li>
			<li>ピペッティングでプラズマとバフィーコート層を除去します。</li>
			<li>pRBCを塩化カルシウムを含まないパフューセートに1:1の比率で再懸濁します(例:pRBC5 mL:パフューセート5 mL)。</li>
			<li>手順3.8.1.2〜3.8.1.4を2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。</li>
			<li>最後の洗浄後、細胞を灌流液に1:1の比率で再懸濁し、すでに75 mLのベース灌流液が含まれている混合物を灌流システムに加えます。</li>
		</ol></li>
		<li>細胞がシステム全体に均一に分布するようにし、血液学装置を使用して灌流液のヘマトクリットを測定します。ヘマトクリット値は5%〜7%の範囲です。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 心臓移植片の調達準備
<ol><li>調達を開始する前に灌流システムを完全にプライミングし、低温虚血時間を最小限に抑えます。</li>
	<li>手術器具を準備します。手術用具には、ブルーパッド、サージカルテープ、シルク5-0縫合糸、綿棒、生理食塩水注射器(50mLおよび10mL)、手術用ハサミ、鉗子、マイクロハサミ、マイクロ鉗子、ハルステッドクランプ、30Uのヘパリン、門脈フラッシュ用の16Gチューブ、心臓のカニューレーション用14Gチューブ、16G血管腫、カフ付き修正14G血管カテーテル、圧力センサー、 氷入りアイスバケツ、47mmシャーレ、ガーゼ。</li>
	<li>14Gカニューレにチューブの細いリング(内径[ID]0.167mm、外径[OD]2.42mm)を挿入して、カフ効果を生み出して、修正されたカニューレを作成します。<ol><li>カニューレの針を取り外し、リングの下に瞬間接着剤を一滴加えます。リングをカニューレの基部から1/4インチ上まで慎重にスライドさせます。接着剤を乾かしてから使用してください。</li>
		<li>カニューレをカフにできるだけ近づけて斜めにカットし、鋭いエッジを取り除きます。</li>
	</ol></li>
	<li>60 mLシリンジにヘパリン食塩水(0.03 U / mL)を充填して、門脈をフラッシュします。シリンジを圧力センサーに接続し、続いて16Gフラッシングチューブに接続します。</li>
	<li>ヘパリン化生理食塩水(0.03 U/mL)の10 mLシリンジを14 Gチューブに接続します。チューブのもう一方の端を大動脈カニューレに接続し、フラッシュして気泡を取り除きます。</li>
	<li>大動脈カニューレをガーゼ付きの47mmペトリ皿に入れ、生理食塩水で満たします。心臓が灌流システムに接続されるまで、ペトリ皿を氷の上に置いておきます。</li>
</ol>5. 心臓移植片の調達
<ol><li>3%イソフルランを含む麻酔室でラットに麻酔をかけます。</li>
	<li>反射神経が気づかれなくなったら、ラットをチャンバーから取り出し、手術スペースに配置し、フェイスマスクを介して連続的にイソフルラン(3%)を送達します。.</li>
	<li>つま先ピンチテストの後、30Uのヘパリンで陰茎静脈を通して動物をヘパリン化します。</li>
	<li>腹部全体と胸の上部でラットを剃ります。手術野から毛皮の削りくずを取り除きます。手術中に動かないように、各手足をテープで留めます。</li>
	<li>下腹部の皮膚に水平正中線を切開し、腹部の筋肉を露出させます。</li>
	<li>腹筋に2回目の水平正中線切開を行い、内臓を露出させます。</li>
	<li>胸骨を露出させ、止血器で固定し、頭蓋状に引っ込めて肝臓と門脈を露出させます。16ゲージの血管カテーテルを使用して門脈をカニューレします。</li>
	<li>ヘパリン化生理食塩水の60mLシリンジを血管カテーテルに取り付け、下大静脈と腹部大動脈に切開してベントを行います。門脈を通して全量の生理食塩水を洗い流します。 注:フラッシング圧力は約10mmHgにとどまる必要があります。</li>
	<li>横隔膜に水平に切り込みを入れ、続いて胸骨の両側の肋骨を近位に切り込み、胸腔を露出させます。</li>
	<li>心臓を空洞から取り出し、すぐに生理食塩水を氷に乗せたシャーレの上に置きます。</li>
	<li>大動脈弓を特定し、止血剤でクランプし、残っている結合組織を洗浄して下行大動脈を露出させます。</li>
	<li>下行大動脈の半分に水平に切り込みを入れ、14G血管動物でカニューレを切開します。 注:カニューレで大動脈弁を破らないでください。.</li>
	<li>カフの上の縫合糸でカニューレを固定し、止血剤を放出します。</li>
	<li>灌流システムに入れるまで、心臓を氷の上に残します。</li>
</ol>6. 灌流開始
<ol><li>蠕動ポンプの流量を 1.0 mL/min に設定します。 注:大動脈カニューレは、冠状動脈への気泡の導入を避けるために、常に心臓に対して90°の角度で取り扱われます(図1B)。</li>
	<li>心臓をシステムに取り付ける前に、カニューレで心臓の重さを量ります。 注:大動脈カニューレには気泡がまったくない必要があります。</li>
	<li>カニューレをシステム内のコネクタに取り付け、タイマーを開始します。</li>
	<li>心臓が完全に収縮したら、圧力を注意深く観察しながら、流量を0.2 mL / min刻みで増やします。</li>
	<li>所望の圧力に達したとき、または最低3.5mL/minに達するまで、流量の増加を停止します。<ol><li>低圧灌流<ol><li>30〜35 mmHgの圧力の場合、4.5 mL / minの流量を使用します。</li>
			<li>アデノシンシリンジポンプを始動します。</li>
		</ol></li>
		<li>高圧灌流<ol><li>70〜80 mmHgの圧力の場合、最小流量は5.0 mL/minです。</li>
			<li>アデノシンシリンジポンプを始動します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7.脳室内バルーン:
<ol><li>先端がテーパー状(直径1.4mm)のバルーンカテーテル(直径2mm、長さ15cm)に小型(50μL)のラテックスバルーンを取り付けます。</li>
	<li>カテーテルをルアーロックコネクタを介して圧力センサーに接続し、セットアップ全体をクランプスタンドに固定します。</li>
	<li>バルーン/カテーテル/圧力センサーに約200μLの生理食塩水を圧力センサーの上端に取り付けられたシリンジで満たし、センサー、カテーテル、バルーンの内部から気泡を取り除きます。</li>
	<li>血圧計を使用して圧力センサーを校正します。</li>
	<li>左心房の上に小さな水平切開を行います。圧力センサーの上部にあるシリンジを引き出し、左心室に挿入してバルーンを収縮させます。</li>
	<li>データ取得を開始し、拡張期血圧が0mmHgになるまでバルーンを膨らませます。</li>
</ol>8. サンプリング
<ol><li>灌流の最初の20分後とその後1時間ごとに、心拍数、大動脈血流、冠動脈圧を収集します。</li>
</ol>9. 終了/クリーンアップ
<ol><li>灌流の最後に、心臓をシステムから取り出し、浮腫の推定のために体重を量ります。</li>
	<li>円周方向の切開により心臓の頂点を切断し、液体窒素で瞬間凍結して灌流後の分析を行います。</li>
	<li>組織学的イメージングと染色のために、心臓の円周片を切断します。残りの心臓とカニューレを処分します。</li>
	<li>大量の脱イオン水(DI)をリザーバーに加え、蠕動ポンプを作動させることにより、システムのすべてのコンポーネントをすすぎます。外部バケツに水を集めます。</li>
	<li>手順9.4を2〜3回繰り返します。</li>
	<li>すべてのサンプルポートと圧力センサーチューブを十分にすすいでください。</li>
	<li>システム全体で 600 mL の DI 水と 3 mL のラボ用洗剤ポンプをリザーバーに充填します。</li>
	<li>給湯器、酸素ボンベ、蠕動ポンプの電源を切ります。</li>
</ol>

改良型ランゲンドルフ灌流によるCVD研究の強化

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</ol>

SNTは、この研究に関連する特許を申請しており、臓器保存技術の開発に焦点を当てた会社であるSylvatica Biotech Inc.の科学諮問委員会のメンバーを務めています。すべての競合する利益は、MGHおよびパートナーズヘルスケアによって、利益相反ポリシーに従って管理されています。

ランゲンドルフ灌流は、非常に柔軟性の高い技術で、幅広い実験的なニーズを満たすための印象的なテーラリングと調整が可能です。この調整は、灌流圧力を含むほとんどの灌流パラメータの大幅な調整機能によって可能になります。ランゲンドルフの逆行性により、灌流圧は冠状動脈灌流圧と同等であり、心機能に不可欠な役割を果たします。冠動脈灌流圧 (CPP) は、さまざまな心臓指数 (すなわち、左心室圧、収縮性 (dP/dtmax)、壁張力、心室硬化) が CPP 16,17,18 に正比例するため、心臓の働きを直接制御することが知られています。歴史的に、この分野では、生理学的条件を模倣する試みとして、60 mmHgから80 mmHgの間の灌流圧力、つまりCPPを利用してきました5,8,15,19,20,21。しかし、逆行性ex vivo機械灌流の非生理学的性質は、高い仕事需要と相まって、心機能の経時的な喪失につながります(図3)。あるいは、より低い灌流圧(30-35 mmHg)は、in vivoでラットの心臓の生理学的条件を正確に再現していないにもかかわらず、本質的に心臓の仕事需要を減少させ、時間の経過とともに機能を失うことなく(図3)、移植片浮腫を減少させることなく、長時間の灌流時間(4時間)を達成します(図2C)。より低い灌流圧の使用は、生理学的CPPからの逸脱を意味しますが、ランゲンドルフ灌流中の既存の技術依存の機能喪失を排除することで、この技術がより正確で予測可能なモデルシステムに改善されるため、生理学的灌流圧の使用よりも重要な利点を提供するようです心血管研究を進歩させる大きな可能性を秘めています。特に、CVDとの闘いにおいて、科学的な関連性を得るために利益を得る、または灌流時間を延長する必要がある研究分野(薬物治療、免疫応答解析、遺伝子編集、常温移植片保存など)は、ますます重要になってきています。
ランゲンドルフ灌流は、心臓血管研究の分野に不可欠なツールであることは議論の余地がありません。したがって、この科学的手法が研究コミュニティにもたらす大きな利点に加えて、重要なレベルの科学的複雑さが伴います。実際には、このプロトコルには、主に灌流開始前、開始中、および開始直後に心臓移植片の損傷を回避するために、慎重な標準化を必要とするいくつかの重要なステップがあります。移植片の損傷の最初の可能性は、門脈のフラッシュ中に目立たなくなります。このヘパリン化生理食塩水によるフラッシュは、二重の目的で心臓移植片からできるだけ多くの全血を除去することを目的としています。まず、それは放血による安楽死の方法として機能します。第二に、ラットの全血は衣服の時間が非常に短いことが知られているため、回収、カニューレ挿入、および輸送中の心臓移植片内での凝固の可能性を最小限に抑えます22,23。しかし、何百回もの心臓灌流が成功した後、フラッシング中にラット生物に加えられる圧力が非常に重要であり、理想的なフラッシュ圧力は約10mmHgであることが明らかになりました。門脈のフラッシュ圧力が高くなると、心臓移植片の血管系が損傷し、血管抵抗が増加するようです(<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66815/66815eq01.jpg" style="margin: auto;">)。血管抵抗が高いほど、低い流量で目標の灌流圧に到達します。この圧力と冠状動脈の流れとの間の不均衡は、生成された左心室脈圧(LVPP)に伝達され、大きな変動をもたらします。
心臓移植片の損傷の可能性の次の例は、冠状動脈への気泡の導入による移植片のシステムへの接続中です。気泡は、カニューレ化された心臓(図1B)の取り扱いを誤るか、またはバブルトラップ24の上流の灌流システムからの不適切な気泡除去によって容易に導入され得る。この設定は逆行性であるため、空気を導入すると心臓空気塞栓症を引き起こし、虚血性傷害、細動、そして非常に一般的には移植片死につながります。最後に、プロトコールの成功を確実にするための最後の重要なステップは、灌流の開始中に行われます。ランゲンドルフを技術として利用していると報告している大多数の原稿とは異なり、このプロトコルでの灌流の開始は比較的低い流量(1 mL/分)で行われ、漸進的な増加(+0.2 mL/分)で行われ、灌流圧力5,8,15,19,20,21を完全に制御する必要があります。.この流量の漸進的な増加、したがって圧力は、圧力の急激な変化が血管抵抗を不可逆的に増加させ、微妙な流量/圧力バランスを変化させるため、非常に重要です。
圧力制御されたランゲンドルフ灌流における高い血管抵抗は、低流量で目標灌流圧力に達し、移植片が灌流不足になるため、非常に重要です。この流れと圧力の完璧なバランスに大きく依存していることが、このプロトコルの最大の制限である可能性が高く、意図的な(すなわち、長期の保冷、温虚血の傷跡、心筋梗塞など)または意図的でない移植片の損傷は、血管抵抗の増加につながります。実際、このプロトコルは、灌流の開始後に実験が開始される研究(すなわち、薬物治療、免疫学的応答分析、遺伝子編集、正常体温移植片の保存など)に特に有用ですが、それ以前には開始されません。この制限は、1つのランゲンドルフがすべての目的に適合しないという完璧な例であり、実験のニーズを満たすために灌流パラメータを調整するために特別な注意を払う必要があります。

心血管研究の分野は、心血管疾患(CVD)の診断と治療において重要な進歩を遂げています。しかし、発生率と死亡率が全般的に減少しているにもかかわらず、CVDは依然として世界の主要な死因です1,2。この憂慮すべき事実は、研究の増加と科学の進歩の必要性を浮き彫りにしており、それは間違いなく利用可能な研究ツールの精度と予測可能性に依存しています。その結果、研究ツールセットの革新、改善、および/または再利用が常に必要とされています。例えば、逆行性心臓灌流法やランゲンドルフ心臓灌流法は、100年以上にわたってこの分野で利用されてきた技術ですが、より広範な科学的ニーズに対応し、より広範なアプリケーションを達成するために簡単に変更することができます。
ランゲンドルフ灌流中の心臓移植片を他の生物から単離することで、温度、循環溶液、冠状動脈灌流圧などの幅広い実験パラメータに対して重要な制御が可能になります3,4,5,6,7。これらのパラメータの操作は、さらなる科学的進歩に活用することができる多数の心臓シナリオのシミュレーションを容易にする5,8,9,10。これらのパラメータの中で、灌流圧力はおそらく最も見落とされている実験設定11です。
ランゲンドルフ中、灌流圧は心拍数、ピーク収縮期/拡張期血圧、および酸素消費量と直接的な相関関係を示します11。この相関関係により、心臓移植片によって生成される作業量を直接かつ正確に制御でき、個々の実験ニーズに合わせて調整できます。この貴重な制御能力にもかかわらず、この分野は歴史的により高い灌流圧(60-80mmHg)の使用に引き寄せられており、実験ニーズ8,12,13,14,15に関係なく、すべての心臓移植片を高い作業需要にさらしています。この不必要に高い労働需要の結果は、過労は時期尚早の失敗をもたらす傾向があるという包括的な原則から生じています。これは、ランゲンドルフを介して灌流された心臓移植片に特に当てはまるようで、この方法の非生理学的性質と生体内に存在する回復サポートの欠如が移植片の失敗を悪化させるようです。このグラフト機能の早期喪失は、灌流と実験時間を大幅に制限します。実際には、より長い灌流時間が実験ニーズにより関連する状況(すなわち、薬物治療、免疫応答解析、遺伝子編集、移植片の保存など)では、移植片の耐久性の向上と引き換えに、心臓の仕事を少なくすることができます。
このプロトコルは、ランゲンドルフ中に低灌流圧力(30-35mmHg)を利用する可能性と、これらが高灌流圧(60-80mmHg)と比較して時間の経過とともに心移植機能にもたらす重要な効果を示しています。さらに、この論文の知見は、実験ニーズをより適切に満たすために、さまざまな灌流パラメータのカスタマイズを優先することの重要性を強調しています。

<table><tbody><tr><td>5-0 縫合</td>糸 <td>ファイン サイエンティフィック ツール</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>14 G 血管ベ</td><td>クトン ディキンソン</td><td>381867</td><td></td></tr><tr><td>16 G 血管</td>ベ<td>クトン ディキンソン</td><td>381957</td><td></td></tr><tr><td>24 mm 心臓室アダプター</td><td>ラドノティ</td><td>140132</td><td></td></tr><tr><td>バルーン カテーテル&nbsp;</td><td>ラドノティ</td><td>170423</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp;スリップチップ滅菌シリンジ-10 mL</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp;スリップチップ滅菌シリンジ-1 mL</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp;スリップチップ滅菌シリンジ-50mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-820-11</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>バブルトラップコンプライアンスチャンバー</td><td>ラドノティ</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td>C7902</td><td></td></tr>クランプ<tr><td>ホルダーユナイテッド</td><td>サイエンティック</td><td>RTCLMP1</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン</td><td>シグマ</td><td>31389</td><td></td></tr><tr><td>DIN8延長ケーブル</td><td>Iworx</td><td>SKU&nbsp;C-DIN-EXT</td><td></td></tr><tr><td>Falcon High Clarity 50 mL コニカルチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>GSC Go Science Crazy&nbsp;鋳鉄製サポートリングスタンド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S13748</td><td></td></tr><tr><td>ハート&nbsp;チャンバー</td><td>Radnoti</td><td>140160</td><td></td></tr><tr><td>温水循環バス</td><td>コール パーマー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム注射</td><td>Medplus</td><td>G-0409-2720-0409-2721</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Solu-Cortef</td><td>MGH 薬局</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>フムリン R</td><td>MGH 薬局</td><td></td></tr><tr><td>侵襲性液体充填血圧センサー</td><td>Iworx</td><td>SKU&nbsp;BP-10x</td><td></td></tr><tr><td>Iworx データ収集システム</td><td>Iworx</td><td>IX-RA-834</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit バッファー</td><td>Σ</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>左室圧バルーン</td><td>Radnoti</td><td>170404</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密チューブ用イージーロード II ポンプヘッド、PPS ハウジング、SS ローター</td><td>VWR</td><td>MFLX77200-60</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 標準デジタルポンプシステム</td><td>VWR</td><td>MFLX07551-30</td><td></td></tr><tr><td>膜酸素化チャンバー</td><td>Radnoti</td><td>130144</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td><td></td>ック 15140122 <td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-170-12H</td><td></td></tr><tr><td>精密ポンプ チューブ-16</td><td>VWR</td><td>MFLX96410-16</td><td></td></tr><tr><td>ビカロボネートナトリウム</td><td>シグマ</td><td>5761</td><td></td></tr><tr><td>標準的なPHDの超CPのシリンジ ポンプ</td><td>ハーバードAparatus</td><td>88-3015</td><td></td></tr><tr><td>タイゴンの移動管</td><td>VWR</td><td>MFLX95702-03</td><td></td></tr></tbody></table>

げっ歯類の心臓移植片の灌流時間を延長するための修正ランゲンドルフ灌流

Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts

心血管疾患(CVD)の診断と治療における重要な進歩にもかかわらず、この分野は研究と科学の進歩が急務となっています。その結果、利用可能な研究ツールセットの革新、改善、および/または再利用により、研究の進歩のための改善されたテストベッドを提供できます。ランゲンドルフ灌流は、CVD研究の分野にとって非常に価値のある研究技術であり、幅広い実験ニーズに合わせて変更することができます。この調整は、灌流圧力、流量、灌流液、温度など、多数の灌流パラメータをパーソナライズすることで実現できます。このプロトコルは、ランゲンドルフ灌流の汎用性と、より低い灌流圧力(30-35mmHg)を利用することにより、グラフト機能の損失なしにより長い灌流時間(4時間)を達成する可能性を示しています。この技術自体によるグラフト損傷や機能喪失なしに灌流時間を延長することで、実験結果から交絡因子を排除できる可能性があります。実際、より長い灌流時間が実験ニーズに関連する科学的な状況(すなわち、薬物治療、免疫学的応答解析、遺伝子編集、移植片の保存など)では、より低い灌流圧力が科学的な成功の鍵となる可能性があります。

成体の雄Lewisラット(体重250〜300g)の心臓を採取し、高(70〜80mmHg)または低(30〜35mmHg)の灌流圧(n = 3グループあたり3)で灌流しました。灌流圧が全体的な心機能と健康に及ぼす影響は、心拍数、浮腫、および左心室機能の収集によって決定されました。
心拍数と灌流圧との間に明確な相関関係が認められました(図2)。心拍数は、最初の時点(60分、 図2A、B)を除くすべての時点で、低圧の心臓と比較した場合、高圧の心臓で統計的に高かった。興味深いことに、低圧の心臓は灌流の開始時に調整期間を経るようで、心拍数が安定し、残りの灌流を通じて維持されたレベルに達するまでに約30分かかりました(図2A)。また、両群間では左心室脈圧(LVPP)に大きな差が認められ、高圧心臓のLVPPは各時点で低圧心臓よりも統計的に高かった(図3B)。この持続的な高い仕事の需要は、高圧心臓の機能を進行的に失い、灌流の2時間後にLVPPの統計的な減少が見られました(図3A、B)。あるいは、低圧で灌流された心臓では機能の喪失は見られず、LVPPは灌流時間を通じて変化しなかった(図3A、B)。LVPPと同様に、高圧心臓は、低圧心臓と比較して、灌流時間を通じて高い心筋収縮(dP / dtmax)と弛緩(dP / dtmin)を示しました(図3C、D)。これに応じて、高圧心臓は収縮性と弛緩能力が徐々に失われ、両方のパラメーターは、灌流時間の最後の1時間と比較すると統計的に高かった。また、心筋の収縮性と弛緩能力は低圧群で比較的低く、4時間の灌流時間にわたって変化しなかった(図3C、D)。機能的影響に加えて、長期間にわたる高い灌流圧も、心臓移植片内の間質液貯留を悪化させ、浮腫を引き起こします。この浮腫は体重変化率で半定量化され、低圧で灌流された心臓と比較して、高圧心臓の体重増加が統計的に高くなりました(図2C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66815/66815fig01.jpg"> 図1:灌流システムのセットアップ(A)全体的な灌流セットアップ。破線は、灌流液の循環を最適化するためにシステムのコンポーネントが接続された順序を表しています。実線の色付きの線は、灌流液の温度を最適化するためにコンポーネントが接続された順序を表しています。(B)カテーテルが空になり、冠状動脈に空気が入るのを防ぐためのカニューレ挿入後の心臓の適切な取り扱い方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66815/66815fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66815/66815fig02.jpg"> 図2:心拍数と浮腫に対する圧力の影響 (A)脳室内バルーン測定から得られた心拍数。実線は実験グループの中央値です。影付きの領域は四分位範囲です。(B)灌流の各時間における心拍数データの曲線下面積(AUC)。(C)低圧および高圧での4時間の灌流後に増加した重量の割合。すべてのデータは、中央値±四分位範囲(IQR)で表されます。*p &lt; 0.01、**p &lt; 0.05、***p &lt; 0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66815/66815fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66815/66815fig03.jpg"> 図3:左心室機能に対する圧力の影響 (A)最大収縮期血圧を経時的にプロットし、左心室脈圧(LVPP)として示します。実線は実験グループの中央値です。影付きの領域は四分位範囲です。(B)灌流の各時間のLVPP曲線下面積(AUC)。(C)圧力パルスの最大導関数から定量化された心筋の収縮性。(D)圧力パルスの最小導関数から定量化された心筋の弛緩。すべてのデータは、中央値±四分位範囲で表されます。*p &lt; 0.01、**p &lt; 0.05、***p &lt; 0.001、****p &lt; 0.0001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66815/66815fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>イオン</td>
			<td>濃度(mmol / L)</td>
		</tr><tr><td>Na+ </td>
			<td>135–145</td>
		</tr><tr><td>K + </td>
			<td>&lt;6.00</td>
		</tr><tr><td>CA +2 </td>
			<td>1.0–1.3</td>
		</tr><tr><td>Cl - </td>
			<td>96–106</td>
		</tr></tbody></table>表1:灌流液中のイオン濃度の許容範囲。

この記事では、ランゲンドルフ中に生理学的(60-80 mmHg)よりも低い(30-35 mmHg)灌流圧を採用することにより、機能損失なしにマウス心臓移植片のより長い灌流時間(4時間)を達成する可能性を示しています。

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Research

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