Name: マウスの外科的腰椎交感神経切除術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: 学ぶマウスの外科的腰椎交感神経切除術による神経再生メカニズムと遠位組織への交感神経支配の役割。この手法は化学的切除のオフターゲット効果を回避し、神経可塑性研究に有用です。

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この研究は、NIH国立神経疾患・脳卒中研究所(NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke)のK01NS124912賞と、NIHが資金提供するEmory Specialized Center of Research Excellence in Sex Difference U54AG062334およびEmory University School of MedicineのMedical Scientist Training Programからの開発助成金によって一部支援されました。坐骨神経の切片化を行った学士課程修了者のDavid Kim氏と、ビデオの撮影を可能にした実体顕微鏡の電話マウントを3Dプリントしてくれた研究スペシャリストのHaoMin SiMa氏に感謝します。

すべての実験は、エモリー大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されました（IACUCプロトコル番号PROTO201700371の下で)。この研究では、14週齢、体重16〜21 gの4匹の成体雌野生型C57BL / 6Jマウスを使用しました。ここで使用する試薬や機器の詳細は 、材料表に記載されています。
1. 術前準備
<ol><li>手術器具をオートクレーブします:鋭利なハサミ1組、先端の細いピンセット2本、ニードルドライバー1本。</li>
	<li>加熱パッドを37°Cに温め、手術用テーブルトップの下に置きます。</li>
	<li>麻酔導入室を含む手術部位に消毒液をスプレーし、ペーパータオルで十分に拭き取ります。</li>
	<li>マウスを取り扱う前に、適切なガウンと手洗いを確認してください。</li>
	<li>マウスにメロキシカムを5 mg / kg体重で供給し、マウスが薬を完全に飲み込むのに十分な時間を置いて、誘導中の誤嚥を避けます。.</li>
	<li>1 L / minの酸素中に3%イソフルランを使用してマウスを麻酔下で誘導します(施設で承認されたプロトコルに従います)。</li>
	<li>マウスに麻酔をかけたら(つま先をつまんでも反応しない)、マウスを手術台、仰臥位に置き、鼻を取り付けた鼻円錐形に置きます。</li>
	<li>マウスがノーズコーンに適切に装着されたら、麻酔を維持するためにイソフルランを2%に調整します。</li>
	<li>マウスの目にアイジェルを貼り、乾性角結膜炎(ドライアイ)を予防します。</li>
	<li>マウスがサージカルテープでサージカルテーブルトップに適切に固定されていることを確認してください。</li>
	<li>呼吸が楽になり、適切な呼吸数が得られるように、継続的に監視します。</li>
	<li>マウスの腹部から性器の高さから肋骨の下まで毛皮を剃ります。</li>
	<li>毛皮を取り除いたら、まず70%エタノールで手術部位を中央から末梢に円を描くように拭きます。次に、同じ円を描くようにベタジンで手術部位を拭きます。エタノールとベタジンの両方のステップを合計3回繰り返します。</li>
	<li>マウスを滅菌外科用ドレープで覆い、中央から適切なサイズの穴を開けて手術野を視覚化します。菱形の形状は、ドレープを半分に折り、高さ~10mm、底面~15mmの二等辺三角形をカットすることで作ることができます。</li>
</ol>2. 切開
<ol><li>鋭利なハサミと先端の細いピンセットを使用して、恥骨結合のレベルから~1mm上から肋骨の下~2mmまで正中線を切開します。</li>
	<li>両側腹直筋の間の正中筋膜(linea alba)を特定します。ピンセットを使用して、腹筋を下にある臓器から持ち上げ、alba線に沿って切断して腹腔に入ります。 注:白筋線は、両側腹直筋を横方向に静かに引っ張って、正中線32に沿って縦方向にある細い筋膜線を明らかにすることによって識別できます。リネアアルバを通して切開を行うことで、筋肉をより簡単に閉じることができます。</li>
	<li>腹筋と皮膚を横方向に5-0縫合糸で引っ込めて、次のステップを適切に視覚化します。</li>
</ol>3. L2-L5腰部交感神経節の同定
<ol><li>腰部交感神経節は、腹部大動脈と下大静脈の後方にあります。大動脈を視覚化するには、腹腔から腸を部分的に切除します。 注:L2-L5レベルの交感神経節は、腸骨血管への大動脈分岐部のレベルから左腎動脈21,33のレベルまで横断します。<ol><li>滅菌生理食塩水で飽和した滅菌綿の正方形をドレープの上に置き、切開部の左側に上に置きます。慎重に、2つの滅菌綿先端アプリケーターを使用して、結腸と小腸を部分的に生理食塩水に浸した綿の正方形に押し出します。 注:盲腸と虫垂が腹腔から出ていること、および下行結腸を視覚化できることを確認してください。</li>
		<li>露出した腸を別の生理食塩水で飽和させた綿の正方形で覆います。</li>
		<li>手術中は定期的に蠕動運動をモニターし、腸のリズミカルな動きで確認することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>直腸と肛門に向かって移動し、目に見える糞便が含まれている可能性のある腸の部分である下行結腸を特定し、閉じたピンセットでこの構造を左にそらして、腹部大動脈と下大静脈を明らかにします。これらの2つの血管は結合組織によって結合されており、1つのユニットとして動くはずです。<ol><li>ピンセットで、腹部の血管を周囲の結合組織で持ち上げます。これを持ち上げながら、結合組織に5-0ナイロン縫合糸を慎重に配置します。 注意:針で腹部血管に穴を開けないでください:これはマウスの急速な代償不全を引き起こし、おそらく死に至ります。</li>
		<li>縫合糸が結合組織を通して挿入されたら、腹部血管を左に偏向させます。これにより、三角形の窓が得られ、両側の腰筋を直接視覚化できます。 注:神経節が腹部血管と密接な関係にあるため、交感神経節は、通常は正中線に位置しますが、血管とともにわずかに左(マウスの右)に偏向します。腹部血管が偏向したら、三角形を視覚化し、左側の2つの辺が偏向した腹部血管で構成され、右側がマウスの正中線(両側腰筋の間)によって定義されます。交感神経節は、この三角形の中央にあります(図1A)。それらは縦に並んで移動し、半透明に見えます。それらは、マウスの正中線に潜り込み、その右腰筋に平らに横たわる小さな血管と重なることがあります。ピンセットを使用して、上にある筋膜を鈍く解剖し、神経節を明らかにします(図1B)。</li>
	</ol></li>
	<li>左腎動脈と左精巣動脈または卵巣動脈を特定します。 注:これらは四角形を形成する大きな血管であり、その側面は左腎動脈が上、動物の正中線と腹部大動脈/下大静脈が横方向、左精巣または卵巣動脈が下で構成されています。L2レベルの神経節は大きく、この四角形内にあります(図1A)。ピンセットでこの四角形に入り、両側のL2神経節を特定するために、慎重に鈍い解剖を行います(図1B)。</li>
	<li>神経節の下部と上部が特定されたら、見える両側神経節の下面をピンセットでつかみ、上に引っ張ります。L4やL5など、より劣った位置にある神経節の視覚化は、視界を遮る器官を2組目のピンセットで下方に優しく押すことで向上させることができます。 注: ステップ 3.2.2 で説明した正中線穿孔血管を視覚化すると、より完全な腰椎交感神経切除術が保証されます。もう一方の手で2組目のピンセットを持ち、腹部の神経節を保持している筋膜とニューロンの接続を引き離すと同時に、最初のピンセットで神経節自体を引き上げます。片方のピンセットだけが神経節をつかみ、もう片方のピンセットは筋膜とニューロンの接続をクリアします。左精巣または卵巣動脈のレベルに達すると、L2神経節は下部鎖に引っ張られると動くため、下部鎖神経節がまだ無傷である場合、L2の識別に役立つ場合があります。L3-5神経節は、ピンセットで四角形からL2神経節を抽出する前に、精巣動脈または卵巣動脈で骨折することができます。四角形内に存在する唯一の神経節はL2神経節です。</li>
	<li>この手順では、失血を最小限に抑える必要があります。出血が発生した場合は、閉鎖前に十分な止血を確認してください。.</li>
</ol>4.スキンクロージャー
<ol><li>適切な止血が達成されたら、腹部血管を所定の位置に保持している縫合糸を抜去します。</li>
	<li>2つの滅菌綿先端アプリケーターを使用して、迂回した腸を慎重に腹腔に入れます。</li>
	<li>5-0吸収性縫合糸を使用して、腹筋に近似するようにランニングステッチを行います。</li>
	<li>5-0ナイロン縫合糸では、単純な断続縫合を使用して皮膚を閉じます。</li>
	<li>切開部位にネオスポリンなどの抗生物質軟膏をたっぷりと塗ります。</li>
	<li>マウスを加熱パッドの上の清潔なケージに入れます。</li>
	<li>マウスが目を覚まし、歩行できるようになるまで、15分ごとにマウスを観察します。通常、これには 30 分もかかりません。</li>
</ol>5. ピロカルピン汗アッセイ
注: 腰椎交感神経切除術後の交感神経機能活動の枯渇を評価するために、腰椎交感神経切除術の 7 日後にピロカルピン汗アッセイを利用しました。
<ol><li>0.9% NaCl に 1% ピロカルピン塩酸塩溶液を調製し、ヒマシ油に 10% 馬鈴薯デンプンを混合します。</li>
	<li>絵筆を使用して、足の足底表面をベタジンで覆います。この層を完全に乾かします。</li>
	<li>ベタジン層が乾いたら、別の絵筆を使用して、ひまし油に10%でんぷんの層を塗ります。</li>
	<li>0.25 μL/g体重の1%ピロカルピンを注射器を使用して皮下投与し、首の上の緩い皮膚に投与します。ピロカルピン投与の直後にタイマーを開始します。.</li>
	<li>注入後8分で、足の足底表面の写真を撮ります。</li>
	<li>フィジーを使用して、6つのフットパッドすべてにあるダークスポットの数を数えます(図2A)。</li>
</ol>6. 免疫組織化学
注: 腰椎交感神経切除術後の末梢神経の交感神経軸索の変性を評価するために、両側坐骨神経を術後 21 日目に採取しました。
<ol><li>マウスに麻酔をかけ (プロトコルのステップ 1 に従った)、両側の坐骨神経を採取し、次に動物を速やかに安楽死させます (施設に承認されたプロトコルに従います)。</li>
	<li>坐骨神経を0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4%パラホルムアルデヒドに直接20分間入れ、次に0.1 M PBSの20%スクロースに移して、4°Cで一晩凍結保護します。</li>
	<li>20 μmのクライオスタットを使用して坐骨神経を縦方向に切片化し、荷電したスライド上に切片を配置します。</li>
	<li>室温で1時間、1%Tween 20(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水中の10%正常ヤギ血清(NGS)で神経切片をブロックします。</li>
	<li>ブロッキングバッファーを取り外し、ブロッキングバッファー(TBST中の10%NGS)でそれぞれ1:750および1:1000に希釈した一次抗体ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼおよび抗ニューロフィラメントヘビーニワトリと交換します。一次抗体を室温の湿度チャンバーで一晩インキュベートします。</li>
	<li>スライドをTBSTで3回、各洗浄10分で洗浄した後、ブロッキングバッファーで1:200に希釈した二次抗体ヤギ抗ウサギ647およびヤギ抗ニワトリ488を塗布する。二次抗体を湿度チャンバー内で室温で2時間インキュベートします。</li>
	<li>スライドをTBSTで4回、各洗浄で10分間洗浄し、取り付ける前に明るい場所でスライドを乾かします。</li>
	<li>10倍対物レンズの蛍光顕微鏡で、少なくとも40μm離れた神経切片を画像化します。</li>
	<li>フィジーでは、神経セクションをまっすぐにし、セクションの幅にランダムに配置された3本の垂直線を引きます。各垂直線を横切る軸索の数を数え、それを垂直線のセクションの幅で割ります。セクションごとに 3 本の垂直線のそれぞれについて繰り返します。セクションごとに得られた3つの値を平均し、さらに神経ごとに3つのセクションの値を平均します。</li>
</ol>

マウス交感神経ニューロンの標的化:腰椎交感神経切除術アプローチ

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著者には、開示すべき利益相反はありません。

腰椎交感神経節は、多くの重要な腹部臓器や大きな血管の後ろにある非常に小さな構造です。したがって、この手順にはかなりの精度と精度が必要です。困難の多くは、術中に交感神経節を特定することにあります。学習者は、生きたマウスでこの手順を試みる前に、まずマウスの死体で神経節を特定できることをお勧めします。トラブルシューティングは、腸の迂回後に交感神経節を特定するときにしばしば行う必要があります。適切な視覚化を確保するには、降順のコロンが表示されている必要があります。腹腔外の腸の迂回には、盲腸が含まれている必要があります。さらに、膀胱がいっぱいになって肥大している可能性があり、下行結腸、続いて下行する腹部大動脈と下大静脈の視界を妨げる可能性があります。理想的には、マウスが麻酔下に置かれたら、最初の皮膚切開を行う前に、膀胱を手動で搾出します。ただし、膀胱が発現せず、術中の視界が塞がれている場合は、2つの滅菌綿先端アプリケーターで穏やかな表現が可能です。膀胱の後面に付着している尿管を傷つけないように注意してください。腹部大動脈と下大静脈が下行結腸の後方で特定されると、血管の適切な偏向と安定化が交感神経節の視覚化に重要です。筋膜は比較的頑丈であり、縫合糸が血管壁を通さず、筋膜とニューロン接続の層のみを介して配置される場合、血管は正中線から少なくとも1mm引っ張られる必要があります。交感神経節を覆う筋膜は、ピンセットで優しく解剖することができます。処置中に小さな血管が壊れた場合は、滅菌綿の先端のアプリケーターで少なくとも10秒間圧力をかけ、閉鎖前に十分な止血を確保します。.手術中に大きな腹部血管に穴が開いた場合、マウスはすぐに安楽死させる必要があります。
この方法では、交感神経節を直接可視化および除去できるため、化学的交感神経と比較してこれらの節後交感神経ニューロンをより特異的に標的化できるが23、いくつかの制限がある。この手術により、L2-L5 腰椎交感神経節が切除されます。ただし、重要な泌尿生殖器によって引き起こされる視覚閉塞のため、L4-L5レベルの神経節などの最も低い神経節は、この手順中に視覚化して除去するのがより困難です。下肢を神経支配するニューロンの大部分は、大きなL2神経節に位置しています。L5神経節は非常に小さく、以前の蛍光逆行性追跡実験で見られたように、ニューロンの数が少ない38。しかし、これらのニューロンを取り除かないと、足などの最も遠位の構造からの結果の分析が歪む可能性があります。足の遠位ターゲットを研究する際により良い結果を得るために、抽出された組織をチェックして、除去された神経節の数を数えることをお勧めします。これは、節後交感神経ニューロンを容易に視覚化できる蛍光レポーターマウスを介して、または手術前に遠位標的に注入された蛍光逆行性トレーサーを介して行うことができます。この目的のための蛍光レポーターマウスには、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロン39の標識が極めて少ないThCre:mTmG(資料表参照)、節後交感神経ニューロン40,41の標識が中程度のPhox2bCre:tdTomato(資料表参照)、ThCre:tdTomato(資料表参照)などがあります)は、節後交感神経ニューロン42の広範な標識を有する。これは、使用可能な行の完全なリストではありません。
さらに、この外科的処置には大きな切開が必要なため、マウスはさらなる実験を行う前に、より長い回復期間を必要とする場合があります。マウスは、適切な排便、排尿、および摂食のために少なくとも3日間監視する必要があります。さらに、不適切な止血は対処されていない腹腔内出血を引き起こす可能性があり、予期しない時点でマウスが死亡する可能性があります。したがって、外科的閉鎖前に止血が達成されるようにすることは、将来の実験の成功にとって重要です。交感神経ニューロンは、前述の24のように化学的に標的とすることもできる。
外科的交感神経切除術の使用により、神経筋接合部12での交感神経支配の役割など、遠位標的における節後交感神経支配の役割を調査することを目的とした多数の研究が可能になります。さらに、蛍光逆行性トレース技術は、このプロトコルがパラホルムアルデヒド固定マウス38から神経節を一括して抽出するために適合させることができるので、遠位組織の交感神経再神経支配を定量化するために用いることができる。末梢神経損傷の文脈では、この外科的「ノックアウト」モデルにより、以前に神経支配された組織で予想される交感神経機能回復のより良い特性評価が可能になります。

末梢神経損傷 (PNI) は、遠位組織ターゲットの運動障害、感覚障害、および交感神経障害を引き起こす可能性があり、完全に機能を回復することはめったにありません1。PNIの研究は、多くの場合、運動および感覚の再生に焦点を当ててきました。しかし、ラットの坐骨神経のほぼ4分の1は、無髄交感神経軸索で構成されています2。それにもかかわらず、末梢組織における交感神経支配の役割は完全には理解されていません3。交感神経系は、免疫調節、体温調節、血管緊張、ミトコンドリア生合成などに関与し、身体の恒常性を維持する上で主要な役割を果たしています4,5,6,7,8,9,10,11 .神経筋接合部での交感神経支配が失われると、運動ニューロン神経支配が維持されているにもかかわらず、持続的な筋力低下とシナプス不安定性が観察される12。神経筋接合部におけるシナプス伝達のこの交感神経制御は、加齢とともに減少することが示されており13,14、これは、筋肉量、力、およびパワーの加齢依存的な減少として定義されるサルコペニアに寄与する15。末梢組織の交感神経支配の役割をよりよく理解することは、PNIやその他の形態の交感神経機能障害患者の機能転帰を最適化する治療法の開発に必要です。
交感神経切除術は、遠位標的組織における交感神経支配の役割の調査を可能にする強力な実験ツールです。具体的には、L2-L5レベルの交感神経節を切除すると、下肢への交感神経支配の大部分が除去され、坐骨神経に関心のある研究者にとって特に有用です。
このプロトコルは、生存手術としてマウスからのL2-L5レベルの節後交感神経ニューロンの除去を詳述しています。この手順には、げっ歯類の顕微手術のスキルとマウスの解剖学への精通が必要であり、効果的に実施された場合、目に見える表現型の違いは引き起こされません。外科的腰椎交感神経切除術はげっ歯類の研究で使用されており、マウスよりもラットで使用されています16,17,18,19,20,21;しかし、そのプロトコルを記述した詳細なプロトコルは、現在存在しません。腰椎交感神経切除術を利用した以前の研究では、主に交感神経支配の役割に焦点を当てていました 痛みの反応、これは一般に、さまざまな神経損傷モデルで交感神経切除術によって弱められます。マウスでこの技術を使用した研究は少ないが、これはおそらく解剖学的ランドマークのサイズが小さいためであり、外科的交感神経切除術の使用は小動物では「事実上実行不可能」であると考えられていた23,24。微小交感神経切除術の形での限局性交感神経切除術は、げっ歯類モデルでも利用されており、これも主に疼痛行動の文脈で行われています25,26,27。微小交感神経切除術は、腰部交感神経全摘出術とは対照的に、特定の脊髄神経への灰色の枝の一部を切断して除去する背側アプローチを利用し、より広範な副作用を回避する非常に的を絞った交感神経切除術を可能にします。
マウスモデルは遺伝子操作を必要とする多くの研究にとって重要であるため、この手順は末梢神経損傷の範囲を超えて多用途に応用できます。経腹部アプローチを使用すると、腰椎交感神経節を確実に視覚化し、明らかな悪影響なしにマウスから切除できます。6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)23,24の使用など、節後交感神経ニューロンの化学的破壊のためのプロトコルが利用可能ですが、この外科的処置は、節後腰椎交感神経節の解剖学的特異的な標的化を可能にします。外科的交感神経切除術の使用は、薬理学的方法に関連する非特異的で用量依存的な懸念も回避します28,29。
6-OHDAの投与による化学的交感神経の使用は、小動物の外科的交感神経が好まれなかったため、アドレナリン作動性神経終末の選択的破壊を達成する簡単な方法として1967年に説明されました23,24。6-OHDAは、パーキンソン病患者に内因的に形成されるカテコールアミン作動性神経毒であり、その毒性は、フリーラジカルを形成し、ミトコンドリアの電子伝達鎖を阻害する能力に由来する30,31。ノルエピネフリンの取り込み-1輸送メカニズムを通じて、6-OHDAは節後交感神経細胞28などのノルアドレナリン作動性ニューロン内に蓄積することができる。最終的に、ニューロンは6-OHDAによって破壊されます。しかし、末梢神経系の終末は再生し、アミンレベルがまだ低下している場合でも機能的活動が回復します。6-OHDAに応答するさまざまな臓器に対して異なる投与量の閾値も存在し、高用量の6-OHDAはより非特異的な効果を示すことが示されており、その神経毒性の影響を非カテコールアミン含有ニューロン、さらには非ニューロン細胞にまで拡大します。ノルアドレナリン作動性ニューロンは別として、ドーパミン作動性ニューロンも6-OHDAの影響を受けます29、化学的交感神経切除術は最終的に外科的交感神経切除術よりも節後交感神経ニューロンへの特異的性が低くなります。
したがって、外科的腰椎交感神経切除術は、交感神経支配を下肢に的を絞ったアブレーションを可能にし、マウスのさまざまな実験技術や遺伝子操作と組み合わせて、交感神経系がさまざまな損傷や病状にどのように寄与しているかを研究することができます。

<table><tbody><tr><td>5-0 吸収性縫合</td>糸 <td>CP Medical</td><td>421A</td><td></td></tr><tr><td>5-0 ナイロン縫合</td>糸 <td>Med-Vet International</td><td>MV-661</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-4L</td><td></td></tr><tr><td>麻酔誘導室</td><td>Kent Scientific VetFlo</td><td>VetFlo-0530XS</td><td></td></tr><tr><td>麻酔気化器</td><td>Kent Scientific VetFlo</td><td>13-005-202</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>HealthyPets</td><td>BET16OZ</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-neurofilament-heavy</td><td>Abcam</td><td>ab72996</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>Prism</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine-tiped Tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ アンチチキン 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32931</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ アンチウサギ 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>フィジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>ニコン</td><td>NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Med-Vet International</td><td>RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Med-Vet International</td><td>RXMELOXIDYL32</td><td></td></tr><tr><td>Needle driver</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-7894</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic Ointment</td><td>Refresh</td><td>Refresh P.M.</td><td></td></tr><tr><td>Phox2bCre:tdTomato突然変異マウス</td><td>ジャクソン研究所&nbsp;</td><td>#016223、#007914</td><td></td></tr><tr><td>ピロカルピン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ</td><td></td><td>Abcam ab112</td><td></td></tr><tr><td>小型ストレートハサミ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿棒 2x2</td><td>ダイナレックス</td><td>3252</td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿チップアプリケーター</td><td>ダイナレックス</td><td>4301</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ドレープ</td><td>Med-Vet International</td><td>DR4042</td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>Med-Vet International</td><td>1070988-BX</td><td></td></tr><tr><td>ThCre:mTmG 変異マウス</td><td>Mutant Mouse Resource and Research Centers</td><td>strain #017262-UCD</td><td>Jackson Laboratory, strain #007576</td></tr><tr><td>ThCre:tdTomato mutant mice</td><td>European Mouse Mutant Archive</td><td>strain #00254</td><td>Jackson Laboratory, strain #007914</td></tr></tbody></table>

マウスの外科的腰椎交感神経切除術

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

末梢神経損傷は一般的であり、損傷後の完全な機能回復は患者のわずか10%で達成されます。交感神経系は、身体の恒常性を維持する上で多くの重要な役割を果たしていますが、末梢神経損傷の文脈で研究されることはほとんどありませんでした。末梢の遠位標的における節後交感神経神経機能の程度は、現在のところ不明です。末梢標的の交感神経支配の役割をよりよく探求するために、外科的「ノックアウト」モデルは代替アプローチを提供します。これは化学的に達成できますが、節後交感神経ニューロンの化学的破壊は非特異的で用量依存的である可能性があります。マウスでの外科的腰椎交感神経切除術の使用は、かつては小動物では「事実上実行不可能」と考えられていましたが、後肢を神経支配する節後交感神経ニューロンの特異的な標的化を可能にします。この原稿では、生存手術としてマウスからL2-L5腰椎交感神経節を外科的に切除する方法について説明しており、これにより後足の汗反応と坐骨神経の交感神経軸索の数が確実に減少します。

このプロトコルは、マウスからの節後腰椎交感神経ニューロンの外科的除去を説明しています。2匹のマウスが腰椎交感神経切除術を受け、2匹のマウスが対照群として機能しました。外科的腰椎交感神経切除術を成功させるには、 図 1 に示すように、少なくとも L2 および L3 両側腰椎交感神経節の適切な視覚化を達成する必要があります。L4神経節とL5神経節の除去は、下半身の完全な交感神経除神経を達成します。ただし、下部神経節の視覚化は、泌尿生殖器によって妨げられる可能性があります。これまでの逆行性追跡研究では、L2-L5神経節のニューロンの大部分がL2神経節とL3神経節に位置していることが示されている。代表的な結果を得るためには、年齢を合わせた雌マウスのみを用いたが、この外科的処置は雄マウスと雌マウスの両方で何度も再現されており、精巣動脈や卵巣動脈、交感神経節の位置に有意な解剖学的差は認められなかった。
神経節を切除すると、ピロカルピンに反応する発汗反応は急速に減少し、術後7日目までに有意差が見られます(図2)。術後7日目は、ラットの様々な坐骨神経損傷後7日以内に交感神経媒介性発汗活動が指数関数的に減少したため、選択された34。軸索変性症は完了するまでに最大14日かかることがあり、術中にL4およびL5神経節を視覚化するのが困難になる可能性があるため(膀胱および生殖器が視界を遮っている可能性があります)、発汗反応は完全には切除されない可能性があります35,36。
チロシンヒドロキシラーゼ陽性(TH+)軸索密度は、術後21日目までに有意に減少し、ニューロフィラメント重鎖(NF-H)密度は変化しませんでした(図3)。TH+軸索は、低閾値機械受容器を神経支配するTH+感覚軸索の存在と、完全な腰椎交感神経鎖37を視覚化することが困難であるため、完全に枯渇する可能性は低い。
<img alt="腹部解剖学的構造における静的平衡;左腎臓と血管の図とラベル付き手術画像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66821/66821fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:腰部交感神経節の術中図(A)予想されるランドマークの概略図。(B)ラベル付きランドマーク付きの代表的な術中画像。腰部交感神経節は、下行腹部大動脈と下大静脈(偏向)の後ろに位置しています。神経節は、腹部血管のたわみとともにマウスの右側に引っ張られ、右腰筋に位置し、下方向にも上方向にも横切ります。両側のL2神経節は、左腎動脈と左精巣動脈または卵巣動脈との間に視覚化でき、L3神経節は左精巣動脈または卵巣動脈よりも下に見られます。スケールバー:1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66821/66821fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="げっ歯類の足の汗腺機能;発汗スポットを比較した図、顕微鏡画像、グラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66821/66821fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:外科的腰椎交感神経切除術は、後足の発汗スポットの数を減らします。 (A)マウスの後足の足底表面のフットパッド位置の概略図。(B)無傷の動物におけるピロカルピン注射の8分後の発汗反応の代表画像。(B')拡大した画像で、白い矢印が発汗箇所の選択数を示しています。(C) 術後 7 日目の交感神経切除動物へのピロカルピン注射の 8 分後の発汗反応の代表的な画像。(C')拡大した画像で、白い矢印が発汗箇所の選択数を示しています。(D)後足の6つの足パッドすべてに発汗スポットの総数を無傷のマウスと交感神経切除したマウスの比較。データは中央値を表す線で示されています。マンホイットニー検定。*p &lt; 0.05。スケールバー:1 mmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66821/66821fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="軸索密度分析、棒グラフ比較、対照群とSynprX群、蛍光顕微鏡。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66821/66821fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3: 外科的腰椎交感神経切除術 (Sympx) は、坐骨神経の交感神経軸索の数を減らします。 (A) チロシンヒドロキシラーゼ (TH) 陽性軸索 1 μm あたり (神経の幅) 術後 21 日目。無傷(B)および交感神経切除(B')マウスにおけるTH染色の代表的な神経切片。(C)坐骨神経のμmあたりのニューロフィラメント重鎖(NF-H)陽性軸索。無傷(D)および交感神経切除(D')マウスにおけるNF-H染色の代表的な神経切片。マゼンタの破線は、神経の軸索密度を計算するために使用される神経セクションの幅にまたがるランダムに配置された垂直線を表します。マゼンタの矢印は、ランダムに配置された垂直線を横切る軸索の選択数を示します。データは平均±SEM として表示されます。**p &lt; 0.01.スケールバー:100μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66821/66821fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この原稿は、マウスから節後腰椎交感神経ニューロンを外科的に除去するためのプロトコルを示しています。この手順は、遠位組織標的における交感神経支配の役割を調査することを目的とした多数の研究を促進します。

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