Name: 高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶ 高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸測定。ミトコンドリアネットワークを保持し、代謝的柔軟性と酸化リン酸化をリアルタイムで評価する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>筋線維におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化

<table><tbody><tr><td>10 &micro;L ハミルトン シリンジ (ガラス製シリンジ)</td><td>ThermoFisher</td><td>14-813-125</td><td>呼吸アッセイ滴定用</td></tr><tr><td>25 &micro;L ハミルトン シリンジ (ガラスシリンジ)</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>14-813-133</td><td>呼吸アッセイ 滴定</td></tr>用 <tr><td>ADP</td><td>メルク</td><td>117105</td><td>呼吸器測定アッセイ</td></tr><tr><td>ブラックガラス 解剖皿</td><td>Scintica</td><td>DD-90-S-BLK</td><td>サンプル調製用</td></tr><tr><td>ブレビスタチン</td><td>Σ</td><td>B0560</td><td>ワーキング MiR05 溶液</td></tr><tr><td>BSA、脂肪酸フリー</td><td>Σ</td><td>A6003</td><td>MiR05 溶液</td></tr><tr><td>炭酸カルシウム</td><td>Σ</td><td>C4830</td><td>BIOPS 溶液</td></tr><tr><td>クレアチン</td><td>Sigma</td><td>27900</td><td>ワーキング MiR05 溶液</td></tr><tr><td>シトクロム C</td><td>Σ</td><td>C7752</td><td>呼吸器測定アッセイ</td></tr><tr><td>DatLab</td><td>Oroboros Instruments</td><td>N/A</td><td>呼吸器測定ソフトウェア</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>D0632</td><td>BIOPS ソリューション</td></tr><tr><td>D-スクロース</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>MiR05 ソリューション</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Σ</td><td>E4378</td><td>BIOPS &MiR05 ソリューション</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>呼吸器測定アッセイ</td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>Sigma</td><td>G1626</td><td>呼吸測定アッセイ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7523</td><td>MiR05 溶液</td></tr><tr><td>イミダゾール&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>56750</td><td>BIOPSソリューション</td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5379</td><td>MiR05 溶液</td></tr><tr><td>ラクトビオン酸</td><td>Sigma</td><td>153516</td><td>MiR05 溶液</td></tr><tr><td>リンゴ酸</td><td>Σ</td><td>M1000</td><td>呼吸器測定アッセイ</td></tr><tr><td>MES 水和物&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>M8250</td><td>BIOPS溶液</td></tr><tr><td>MgCl2 - 6 H2O&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>M2670</td><td>BIOPS &MiR05 ソリューション</td></tr><tr><td>オロボロス オキシグラフ-2K (O2K) システム</td><td>オロボロス機器</td><td>10203-03</td><td>高解像度呼吸計</td></tr><tr><td>パルミトイル-カルニチン</td><td>Σ</td><td>P4509</td><td>呼吸測定アッセイ</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Σ</td><td>P1767</td><td>BIOPS 溶液</td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>フィッシャー</td><td>17-467-168</td><td>サンプル調製用</td></tr><tr><td>サポニン</td><td></td><td></td><td>繊維透過化</td></tr><tr><td>ナトリウムATP</td><td>シグマ</td><td>A2383</td><td>BIOPS溶液</td></tr><tr><td>ナトリウムホスホクレアチン</td><td>シグマ</td><td>P7936</td><td>BIOPS溶液</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>P2256</td><td>呼吸器アッセイ</td></tr>コ<tr><td>ハク酸</td><td>シグマ</td><td>S2378</td><td>呼吸器アッセイ</td></tr><tr><td>タウリン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>T0625</td><td>BIOPS &MiR05 ソリューション</td></tr></tbody></table>

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

Measurement of Mitochondrial Respiration in Human and Mouse Skeletal Muscle Fibers by High-Resolution Respirometry

図3 および 図4 は、適切に準備されたマウスの赤および白の腓腹筋線維のための好気性解糖および脂肪酸呼吸器測定プロトコルの酸素プロットをそれぞれ示しています。また、参照用の代表的な定量化された結果も示されています。 図5 は、適切に調製されたヒト筋生検サンプルにおける好気性解糖呼吸器の酸素プロットを示しています。代表的な定量化された結果も示されています。 図3、 図4、 および図5では、ADP添加後にシトクロムCを添加しても酸素フラックスに影響を与えず、サンプルのミトコンドリア外膜が損傷していないことを示しています。 図6 は、ADP後にシトクロムCを追加すると酸素フラックスが急上昇(40%増加)し、ミトコンドリア外膜が損傷しているため、サンプルを呼吸測定に使用すべきではないことを示す好気性解糖呼吸器測定の酸素プロットを示しています。 組織の透過化を延長し、新たに分離された組織を使用しない。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig03v3.jpg"> 図3:マウスの酸素消費量。 結果は、ピルビン酸プロトコルを使用した(A)赤と(B)白の腓腹筋の酸素消費量を示しています。リンゴ酸、グルタミン酸、およびピルビン酸を添加した後の状態2フラックス(青色の色合い、CI LEAK)。ADP投与後(緑の色合い、CI OXPHOS)にO2 消費の有意な刺激が観察され、コハク酸(紫色の色合い、CI+II OXPHOS)の添加後に呼吸がさらに促進されます。シトクロムCは有意な増加を示さず(&lt;15%)、ミトコンドリア外膜が無傷であることを示しています(オレンジ色、CI+II+Cyt C OXPHOS)。ミトコンドリアは、FCCP(黄色の色合い、MAX ETS)の添加により分離されます。青い線は密閉チャンバー内の酸素濃度を表しています。赤い線は酸素消費量(O2 フラックス)を表しています。添加化合物:リンゴ酸(m)、グルタミン酸(g)、ピルビン酸(p)、アデノシン二リン酸(ADP)、シトクロムC(cyt c)、シアン化カルボニル-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)。 (C) 棒グラフは代表的な結果を反映しています (n=8)。データは SEM ±表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig04v2.jpg"> 図4:マウスの酸素消費量。 結果は、パルミトイルカルニチンプロトコルを使用した(A)赤と(B)白の腓腹筋の酸素消費量を示しています。リンゴ酸、グルタミン酸、およびパルミトイルカルニチンを添加した後の状態2フラックス(青色の色合い、CI LEAK)。ADP投与後(緑の色合い、CI OXPHOS)にO2 消費の有意な刺激が観察され、コハク酸(紫色の色合い、CI+II OXPHOS)の添加後に呼吸がさらに促進されます。シトクロムCは有意な増加を示さず(&lt;15%)、ミトコンドリア外膜が無傷であることを示しています(オレンジ色、CI+II+Cyt C OXPHOS)。ミトコンドリアは、FCCP(黄色の色合い、MAX ETS)の添加により分離されます。青い線は密閉チャンバー内の酸素濃度を表しています。赤い線は酸素消費量(O2 フラックス)を表しています。添加化合物:リンゴ酸(m)、グルタミン酸(g)、パルミトイルカルニチン(pc)、アデノシン二リン酸(ADP)、シトクロムC(cyt c)、シアン化カルボニル-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)。 (C) 棒グラフは代表的な結果を反映しています(n = 7)。データは SEM ±表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig04largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig05v2.jpg"> 図5:ピルビン酸プロトコルを使用したヒト外側広筋の酸素消費量の代表的な結果(A)リンゴ酸、グルタミン酸、およびピルビン酸を添加した後の状態2フラックス(青の色合い、CIリーク)。ADP投与後(緑の色合い、CI OXPHOS)にO2消費の有意な刺激が観察され、コハク酸(紫色の色合い、CI+II OXPHOS)の添加後に呼吸がさらに促進されます。シトクロムCは有意な増加を示さず(&lt;15%)、ミトコンドリア外膜が無傷であることを示しています(オレンジ色、CI+II+Cyt C OXPHOS)。ミトコンドリアは、FCCP(黄色の色合い、MAX ETS)の添加により分離されます。青い線は密閉チャンバー内の酸素濃度を表しています。赤い線は酸素消費量(O2 フラックス)を表しています。添加化合物:リンゴ酸(m)、グルタミン酸(g)、ピルビン酸(p)、アデノシン二リン酸(ADP)、シトクロムC(cyt c)、シアン化カルボニル-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)。(B)棒グラフは、外側広筋生検(n = 24)から得られた代表的な結果を反映しています。データは SEM ±表されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig05largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig06.jpg"> 図6:マウスの赤腓腹筋におけるミトコンドリア外膜の完全性の低下を示す代表的な結果。 リンゴ酸、グルタミン酸、およびピルビン酸を添加した後の状態2フラックス(青色の色合い、CI LEAK)。ADP投与後(緑の色合い、CI OXPHOS)にO2 消費の有意な刺激が観察され、コハク酸(紫色の色合い、CI+II OXPHOS)の添加後に呼吸がさらに促進されます。シトクロムCはO2 消費量の有意な増加(&gt;15%)を誘発し、ミトコンドリア外膜の損傷を示しています。青い線は密閉チャンバー内の酸素濃度を表しています。赤い線は酸素消費量(O2 フラックス)を表しています。添加化合物:リンゴ酸(m)、グルタミン酸(g)、ピルビン酸(p)、アデノシン二リン酸(ADP)、シトクロムC(cyt c)、シアン化カルボニル-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:呼吸化合物と呼吸溶液の試薬調製。 アッセイに必要な試薬の調製について、最終ストック濃度や調製・保管方法など、詳細に説明します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/Reagent_Prep_7-31-24.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle ...

measurement-mitochondrial-respiration-human-mouse-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。...

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

ここでは、麻酔をかけたブタから大腿四頭筋の標本を採取し、ミトコンドリアを分画遠心分離によって分離します。次に、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、II、およびIVの呼吸数を高解像度呼吸測定を使用して決定します。...

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

高分解能呼吸計を用いた酸化的リン酸化の評価は、ミトコンドリアおよび細胞エネルギー代謝の機能解析の不可欠な部分となっている。ここでは、チャンバーおよびマイクロプレートベースの高分解能呼吸計を使用して細胞エネルギー代謝を分析するためのプロトコルを提示し、各デバイスの主な利点について説明します。...

チャンバーおよびプレートベースの呼吸計を使用して細胞および組織の生体エネルギーを評価するための高解像度呼吸法

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。...

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

馬は並外れた有酸素運動能力を持っているため、馬の骨格筋は、馬の運動生理学と哺乳類のミトコンドリア生理学の両方の研究にとって重要な組織となっています。この記事では、馬の骨格筋におけるミトコンドリア機能の包括的な評価のための技術について説明します。...

ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

微小循環の観察のための新たな汎用性の高い方法が提示される。それは長期的な観察のため、およびpharmacophysiologicalまたは分子生物学的介入との組み合わせに適して考えられている。...

イントラ不可欠な顕微鏡による骨格筋のin vivo微小循環測定における

このプロトコルは、骨格筋から単離したミトコンドリアの呼吸を研究するための手順を説明します。このメソッドは、Scorranoから翻案されました...

骨格筋からのミトコンドリア単離

学ぶ 高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸測定。ミトコンドリアネットワークを保持し、代謝的柔軟性と酸化リン酸化をリアルタイムで評価する手法です。

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

さらに動画を探す