Name: 成長板損傷を研究するためのトリコロールトランスジェニックマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶ 成長板損傷のトリコロール蛍光トランスジェニックマウスモデル。蛍光イメージングで細胞応答を可視化し、Salter-Harris II型損傷を再現して骨橋形成メカニズムを解明する。

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この研究は、国立衛生研究所、国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(NIAMS)1R21AR079153、およびコネチカット大学研究強化プログラム(REP)からの助成金によって支援されました。著者らは、コネチカット大学MicroCTイメージングコア施設のRenata Rydzik氏の協力に感謝します。

三系統蛍光マウスを用いた精密成長板損傷研究

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<li>Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+responses+and+repair+mechanisms+of+the+injured+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Injury responses and repair mechanisms of the injured growth plate.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3 (1), 117-125 (2011).</li>
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<li>Erickson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+tibial+growth+plate+injury+model+to+characterize+repair+mechanisms+and+evaluate+growth+plate+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies.</a> J Vis Exp. (125), e55571(2017).</li>
<li>Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+effect+of+bone+marrow-derived+stem+cell+implantation+after+epiphyseal+plate+injury+is+abrogated+by+chondrogenic+predifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation.</a> Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).</li>
<li>Mccarty, R. C., Xian, C. J., Gronthos, S., Zannettino, A. C., Foster, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+autologous+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+an+ovine+model+of+growth+plate+cartilage+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Orthop+J%22%5BJournal%5D)">Application of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells to an ovine model of growth plate cartilage injury.</a> Open Orthop J. 4, 204-210 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+mandibular+condylar+cartilage+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine mandibular condylar cartilage cell populations.</a> Cells Tissues Organs. 195 (3), 232-243 (2012).</li>
<li>Clearfield, D. S., Xin, X., Yadav, S., Rowe, D. W., Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+differentiation+of+fluorescent+multireporter+cells+on+zonally-organized+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteochondral differentiation of fluorescent multireporter cells on zonally-organized biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 25 (5-6), 468-486 (2019).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
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<li>Maye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+col10a1-mcherry+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of col10a1-mcherry reporter mice.</a> Genesis. 49 (5), 410-418 (2011).</li>
<li>Chokalingam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+effects+of+compression+and+time+in+culture+on+aggregate+modulus+and+on+gene+expression+and+protein+content+of+collagen+type+ii+in+murine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro effects of compression and time in culture on aggregate modulus and on gene expression and protein content of collagen type ii in murine chondrocytes.</a> Tissue Eng Part A. 15 (10), 2807-2816 (2009).</li>
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<li>Chavez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+micro-computed+tomography+analysis+of+rodent+dentoalveolar+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22JBMR+Plus%22%5BJournal%5D)">Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues.</a> JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).</li>
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</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

トリコロールコラーゲンレポーターマウスの革新的な使用により、所定のサイズと位置で成長板欠損を作成することができ、成長板損傷のマウス実験モデルの精度が大幅に向上します。生後2週間齢のマウスのサイズが小さいことを考えると、手足が弱くなり、全層骨折を引き起こすのを避けるために、小さな0.5mmのバーを使用して損傷を引き起こすことが重要です。また、外科医は、同じ理由で骨に深く穴を開けすぎないように、欠損を作成する際に十分な圧力をかける必要があります。ペリオプローブの使用は、一貫した損傷の深さを確認するために重要です。
他の手術と同様に、適切な麻酔の深さを確認することが重要であり、時折つま先をつまむことで確認され、全体を通して無菌性が維持されます。また、カーバーによる鈍解剖は、軟部組織の損傷を防ぎ、麻酔からの回復後すぐにマウスが母マウスに到達して栄養と快適さを得ることができるため、カーバーによる鈍的解剖が説明されていることです。私たちの経験では、縫合糸で閉じられた傷は正常に閉じられたままであり、創傷クリップは必要ありません。成長板骨折を経験する幼児を最もよく模倣するために、2週齢のマウスの手術が推奨されます。このプロトコルの欠点の1つは、出産の予測不可能な性質を考えると、このマウスモデルの使用には、急な通知で外科医が利用できる必要があることです。
欠陥を作成するためのバーの位置に関して、プロトコルは、コラーゲンX蛍光の明るさのために成長プレート内の肥厚ゾーンを照らすmCherry/Texas赤色フィルターセットを使用して損傷を作成することを説明しています。損傷が脛骨成長板内に生じるようにするには、軟部組織の開口部を左右にわずかに動かして、近位脛骨成長板が大腿骨ではなく視界内にあることを確認することが有益です。増殖性軟骨細胞ゾーンまたは隣接する骨切片を照らすためにフィルターセットチャンネルを切り替えることは、増殖性ゾーンと隣接する骨切片の位置に対する正確な配置を確認するのに役立ちます。
増殖性軟骨細胞ゾーンと骨端骨および骨端骨は、生きたマウスの蛍光顕微鏡法で区別できますが、II型およびI型コラーゲンレポーターの真の価値は、成長板の組織学的分析中に実現されます。クライオ組織学的プロセスの水性の性質を考えると、脱水ステップによって引き起こされる蛍光イメージングと色の不一致が生じる可能性があるため、従来の発色色素沈殿プロトコルは不適切です。水性プロトコールでは、パラフィン切片と同様の染色パターンが得られますが、組織からの色素拡散を防ぐためには、染色後の迅速なイメージングが不可欠です。封入剤として蒸留水中の30%グリセロールを利用すると、この拡散を減速させることができ、サフラニンO/Fast Greenによる軟骨を含む、同じ切片での複数の発色染色が可能になります。
軟骨内骨化プロセスは、進化する骨橋を覆う赤い軟骨細胞ではっきりと見えます (図6)。多くのマウス抗体が利用可能な免疫組織化学技術の追加使用は、これらのトランスジェニックマウスで実施されたメカニズム研究をさらに強化する可能性があります。全体として、このトランスジェニックマウスモデルにおけるファキシトロン、マイクロCT、およびクライオ組織学的イメージング技術の組み合わせは、成長板の損傷に応答して発生する巨視的および微視的変化の包括的な理解を提供し、そのような有害な結果を軽減するための将来の治療介入への道を開きます。これらのトランスジェニックマウスのさらなる遺伝子操作を行うことで、系統追跡研究が治癒に時間的および空間的に関与する細胞の起源を理解することを可能にすることができる。追加の変更を加えたマウスでの実験により、骨軟骨腫(成長板近くの軟骨と骨の過成長)などの軟骨疾患の研究が可能になります。
私たちのモデルの一貫性は、関節軟骨損傷のためにグループからマウスを捨てる必要なしに、すべてのマウスで骨ブリッジの再現可能な形成によって実証されています。これは、成長板の下の皮質窓から成長板にアプローチし、鋭利な工具またはバールを成長板に向かって上向きに角度をつけ、時折関節軟骨にオーバーシュートする従来のモデルよりも改善されています。関節軟骨の追加の損傷は、子供に一般的に発生する成長板の損傷を模倣するものではありません。この動物モデルのより正確な損傷は、実験ごとに必要なマウスの数を減らし、それは別の改善です。トランスジェニックマウスを使用すると、研究者は、関節軟骨に影響を与えることなく、肥大性/暫定的に石灰化した領域や骨端/安静時帯/増殖性領域などの成長板のサブセクションに損傷を集中させることができます。ただし、このモデルの制限は、骨ブリッジの体積のばらつきであり、負傷した動物間で最大30%異なる可能性があります。したがって、骨ブリッジ形成に対する臨床的に有意な影響を検出するには、統計的な関連性を達成するためには、依然として多数の動物が必要です。
以前に発表されたラットまたはウサギの成長板損傷モデルと比較して、ここで説明したマウスモデルの利点7,9,10,14には、使用される動物数が少ないこと、コスト削減、再現性のある骨棒形成による効率的な複製サイズ、研究時間枠の短縮、およびトリプルトランスジェニックマウスのライブイメージングによるより正確な損傷配置が含まれます。詳細は説明されていませんが、このマウスモデルは、成長因子を送達する組織工学インプラントや生体材料の試験に使用できます。このマウス法の顕著な制限は、治療薬または細胞を送達するために使用されるインプラントのサイズが、直径約0.5mmの球の欠陥体積に制限されることである。より大きな動物モデルのみが、人間の患者に使用される試験材料の量に対応できます。このプロトコルで作成されるburの欠陥は薄いひび割れと同じ幾何学的ではない、従って実際の人間の傷害と異なって。それにもかかわらず、このマウスモデルの利点は多く、横方向のアプローチは、脛骨の長軸に沿って成長板の上または下に盲目的に近づくときに発生する関節軟骨の損傷を回避します。この方法論は、成長板損傷研究における大きな飛躍を表しており、病理学を調査し、新しい治療戦略を評価するための詳細で再現性のある方法を提供します。

骨成長板は、小児期および青年期の長骨の縦方向の成長において極めて重要な役割を果たします1。長骨の末端に位置する成長板は複数のゾーンで構成されており、軟骨細胞はこのダイナミックな成長領域の生成と維持に関与する主要な細胞成分です。成長板の軟骨内骨化は、軟骨細胞の増殖、肥大、アポトーシス、血管による浸潤、骨前駆細胞の動員、そして最後に骨形成の連続的な進行を通じて、骨を伸ばし拡大するために起こります2。成長板は骨よりも比較的柔らかいため、スポーツやその他の活動中に骨が過負荷になると骨折しやすくなります。Salter-Harris分類は、成長板損傷の5つの異なるタイプを概説しています3。成長板の肥大領域と隣接する下部骨組織を通るII型骨折が最も一般的です4。骨ブリッジは、肥厚帯または隣接する骨の損傷に反応して形成されることが多く、隣接する長骨切片の早期融合につながる5。骨の橋は、成長板の正常な拡張を妨げます。現在、骨橋の形成には予防的治療法はなく、患者の年齢や骨橋の大きさや位置によっては、未治療のまま放置されているものもあります6。四肢の奇形がひどい場合、外科的選択肢には、除去とそれに続く脂肪やシリコーンゴムなどの配置間材料の埋め込み、または矯正骨切り術と骨延長手順が含まれます。しかし、骨ばった橋はまだ改革するかもしれません6。骨ブリッジの形成を防ぎ、骨成長板損傷の子供の転帰を改善するためには、さらなる研究が必要である。
いくつかの動物モデルが確立されており、根本的なメカニズムを探求し、損傷後の成長板の骨橋障害を防ぐための新しい戦略を開発しています7,8,9,10,11,12。これらの動物モデルは、通常、人間の損傷が発生する場所であることを考えると、近位脛骨成長板と遠位大腿骨成長板を主要な損傷部位として頻繁に焦点を当てています。動物の骨の欠損は、実際の骨折経路と同様の横方向のアプローチ、または成長プレートの中央のドリル穴につながる成長プレートの上または下からのアプローチによって作成されます。以前に報告されたラットモデルでは、成長板の欠損は、脛骨中軸の皮質窓を通して歯科用バーを挿入し、骨髄を膝関節に向かって上方に穿孔することによって作成され、成長板7,13を中央に損傷させる。あるいは、最近のマウスモデルは、小口径針を用いた横方向のアプローチを使用して、成長プレート8を通る平面針トラックを作成する。広く使用されているラットモデルでは、瑕疵は、顆の間の関節軟骨を穿孔することにより、遠位大腿骨の成長板に生じる9,14。ウサギやヒツジのような大型動物では、成長板の欠損は、成長板に穴を開けるか切り込むか、または下から接近して成長板の縁をそのまま残す中心欠陥を作成することにより、近位脛骨と遠位大腿骨に直接横方向に誘発されている10,11,12,15。
成長板損傷のマウスモデルは、幹細胞系譜追跡研究8など、遺伝子改変マウスで達成できる機構研究に有利である。しかし、マウスまたはラットの動物モデルにおける重要な課題は、成長板の特定のサブ領域に対して一貫した正確な損傷を達成することです。成長板と隣接する骨の特定の領域の損傷は、Salter-Harris分類によって説明される臨床的に関連する骨折経路の1つを模倣する必要があります。げっ歯類モデルにおけるこれまでの課題は、主に、損傷の外科的作成中に成長板の基層を識別する視覚的手段の欠如によるものです。このプロトコールは、コラーゲンI、II、およびX蛍光レポーター16、17、18を発現するトリプルトランスジェニックマウスを利用して、マウス成長プレートの標的基層に成長プレート欠陥を生じさせるための洗練された技術を記載している。成長プレートの主要なゾーンのそれぞれにおけるこれらのコラーゲンの異なる色の蛍光は、成長プレート損傷の外科的作成中に蛍光実体顕微鏡下で成長プレートの様々なセクションを視覚的に識別することを可能にする。これらのトランスジェニックマウスを用いることで、若いマウスにおいて、負傷した子供と同等の発達段階において、前例のない傷害精度を実現することができます。

<table><tbody><tr><td>2-メチルブタン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>アルコール消毒パッド</td><td>Acme United Corporation</td><td>H305-200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>AxioVisionソフトウェア</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine溶液(10%ポビドンヨード)</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>67618-150-01</td><td></td></tr><tr><td>カルセイン</td><td>シグマ Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>カルセイン ブルー</td><td>シグマ Aldrich</td><td>M1255</td><td></td></tr><tr><td>CFP フィルター セット</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>クライオマトリックス</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>クライオモールド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>フィッシャーブランド #22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>3050s</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタットブレード</td><td>サーモサイエンティフィ</td>ック <td>3051835</td><td></td></tr><tr><td>クライオテープ</td><td>セクション ラボ</td><td>クライオフィルム 2C</td><td></td></tr><tr><td>カーブファインはさみ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>湾曲した蚊止血鉗子</td><td>HuFriedyGroup</td><td>H3</td><td></td></tr><tr><td>cy5フィルターセット</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td>、<td>62247</td><td></td></tr>、<tr><td>DAPIフィルターセット</td><td>、クロマテクノロジー株式会社</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>デンタルバー(直径0.5mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デンタルクレオイド円盤型カーバー</td><td>ACE Surgical Supply Inc.</td><td>6200097A-EA</td><td></td></tr><tr><td>ドライ ガラス ビーズ滅菌器 (Inotech Steri 350)</td><td>Inotech Bioscience, LLC</td><td>IS-250</td><td></td></tr><tr><td>Ear punch</td><td>Fine Science Tools</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>電熱パッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電子フット コントロール</td><td>Nouvag AG</td><td>1866nou</td><td></td></tr><tr><td>電子モーター 31 ESS</td><td>Nouvag AG</td><td>2063nou</td><td></td></tr><tr><td>環境表面バリア(3 x 12インチチューブソックス)</td><td>Patterson Companies、Inc.</td><td>BB-0312H</td><td></td></tr><tr><td>エタノール (70%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチカ XR (ブプレノルフィン徐放性注射用懸濁液) 1.3 mg/mL</td><td>フィデリス アニマルヘルス</td><td>86084-100-30</td><td></td></tr><tr><td>ファックストロン X線キャビネット</td><td>Kubtech 科学</td><td>パラメータ</td><td></td></tr><tr><td>蛍光 実体顕微鏡</td><td>カールツァイス AG</td><td>ルマー V12</td><td></td></tr><tr><td>GFP フィルターセット</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>ハンドピース (コントラアングル 32:1 プッシュボタン)</td><td>Nouvag AG</td><td>5201</td><td></td></tr><tr><td>インプラント/口腔外科システム制御ユニット(Straumann)</td><td>Nouvag AG</td><td>SEM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>デュアル内部/外部プロセスインジケータ付きインスタントシーリング滅菌ポーチ(3 1/2 x 5 1/4&nbsp;インチ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-812-50</td><td></td></tr><tr><td>デュアル内部/外部プロセスインジケータ付きインスタントシーリング滅菌ポーチ(5 4/1 x 10インチ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>インスリンシリンジ(29 G)</td><td>エクセルインターナショナル</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン&nbsp;</td><td>Dechra Pharmaceuticals plc</td><td>17033-091-25</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン麻酔システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherryフィルターセット</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>39010</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>針(20 G)</td><td>Becton、Dickinson and Company</td><td>305178</td><td></td></tr><tr>針<td>ホルダーHuFriedyGroup</td><td>NHCW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性緩衝ホルマリン(10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>非滅菌アプリケータースワブ</td><td>Allegro Industries</td><td>205</td><td></td></tr><tr><td>不織布ガーゼ (3 x 3 インチ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22028560</td><td></td></tr><tr><td>ノーランド光学接着剤、61</td><td>ノーランド光学</td><td>ノーランド光学接着剤、61</td><td></td></tr><tr><td>眼科軟膏 (Optixcare 眼潤滑剤)</td><td>CLC メディカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>歯周プローブ</td><td>HuFriedyGroup</td><td>PQW</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4 (1x)</td><td>Gibco, by Life Technologies</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック顕微鏡スライド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71890-01</td><td></td></tr><tr><td>プロフェッショナルクリッパー/トリマー (Wahl Classic Peanut)</td><td>Wahl Clipper Corporation</td><td>8685</td><td></td></tr><tr><td>ローラー</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>62800-46</td><td></td></tr><tr><td>Scanco Medicalソフトウェア</td><td>SCANCO Medical</td><td>Scanco &mu;CT 50</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸ナトリウム二塩基性二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td></td></tr><tr><td>検体ディスク</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14037008587</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼 #15 外科用ブレード&nbsp;</td><td>アスペンサージカルプロダクツ株式会社</td><td></td><td></td>371615</tr><tr><td>滅菌手術用手袋</td><td>Cardinal Health, Inc.</td><td>2D72PT65X</td><td></td></tr><tr><td>滅菌タオルドレープ (18 x 26 インチ)</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ (1 mL)</td><td>ベクトン、ディキンソン アンド カンパニー</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>未染色編組コーティング ビクリル縫合糸 (5-0)</td><td>エチコン株式会社</td><td>J490G</td><td></td></tr><tr><td>UVブラックライト</td><td>ゼネラル・エレクトリック</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr></tbody></table>

成長板損傷を研究するためのトリコロールトランスジェニックマウスモデル

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

子供の骨にある軟骨成長板は、手足を伸ばすことができますが、骨に対して弱いため、骨が過負荷になると骨折しやすくなります。損傷に対する反応は、成長板を早期に融合させる骨の橋であり、手足の発育不全および/または曲がった状態につながるため、重度の成長板の骨折に対するより良い治療が必要です。成長板損傷のマウスモデルは、機構研究には有利ですが、若いマウスの小さな成長板を視覚化して正確に損傷させることが難しいため、困難です。ここでは、I型、II.型、およびX型コラーゲンの三系統蛍光レポーターを用いたトランスジェニックマウスを用いた改良型成長板損傷モデルについて述べる。
これらのマウスは、成長プレートの3つの主要な基質に関連する天然の蛍光を示します。Salter-Harris Type II損傷と同様の成長板損傷は、蛍光実体顕微鏡ガイダンス下でのライブイメージング中に、成長板の肥大部を基準として使用してバーで再現可能に作成されます。天然蛍光の凍結組織学解析により、損傷に対する細胞応答の評価が容易になります。この方法論は、成長板損傷研究における大きな飛躍を表しており、病理学を調査し、新しい治療戦略を評価するための詳細で再現性のある方法を提供します。

このプロトコルは、三系統蛍光レポーターマウスを利用して、X型コラーゲンが発する固有の赤色蛍光を外科的指導に活用することにより、近位脛骨の側方成長板欠損を正確に誘導します。mCherryフィルターをセットした実体顕微鏡の接眼レンズを覗き込んだときの外科医の眺めを 図2Dに示します。ネイティブのタイプX蛍光により、外科医はバーを肥厚ゾーンに配置し、骨ブリッジにつながる一般的なタイプの成長板損傷を模倣した損傷を作り出すことができます (図2F)。赤チャンネルの下の蛍光は最も明るいため、バー留置中の使用をお勧めします。あるいは、実験の目標が肥厚性ゾーンおよび隣接する石灰化領域よりも成長プレートの他のゾーンへの損傷を研究することである場合、トリプルトランスジェニックマウスの天然蛍光の他の色を使用することによって欠陥作成を導くことができる。
直径0.5mmのデンタルバーを使用して、成長板の肥大領域と隣接する下部骨組織にSalter-HarrisII型のような欠損を作成することを、N = 3マウスの損傷していない側方コントロールと比較して、損傷した(時間0)近位脛骨のマイクロCTおよび凍結組織学イメージングを通じて検証しました(図4)。欠陥は3DマイクロCT画像では確認しにくかったが、2次元断面では検出可能だった(図3A、B、E、F)。 図3G は、I型コラーゲン産生骨細胞(緑色蛍光)、II型コラーゲン産生増殖性軟骨細胞(シアン蛍光)、およびX型コラーゲン産生肥大軟骨細胞の分布を示しています。負傷したマウス(図4G)の画像では、肥大領域、暫定的に石灰化した層、および増殖領域がわずかに乱れただけのコントロールと比較して最も新しく形成された骨の一部が破壊されています。サフラニンO/Fast Green染色(図4H)は、すべての細胞がはっきりと見えるため、損傷した成長プレート内の欠陥の位置を最もよく示しています。
X線分析は、このタイプの成長板損傷が脛骨の長さと骨橋形成に経時的に与える影響について、生きたマウスにいくつかの洞察を提供します (図3)。手術前と手術後3週間で撮影された無傷の脛骨 (図3A) と負傷した 脛骨(図3B) の比較画像では、大量の四肢の成長、成長板の菲薄化、および3週間で損傷した成長板領域に発生した明確な不透明な領域が明らかになります。成長板内のこの不透明度は、無傷のマウスや手術前のマウスには存在しません。したがって、Faxitronは、骨梁の形成や四肢の長さの変化など、生きたマウスの損傷によって引き起こされる病理学的変化を観察する1つの方法です。
解剖された骨のMicroCTイメージングは、手術の3週間後に損傷した成長板内の骨ブリッジ形成を詳細に視覚化します(図5)。図5に示す6つの異なる負傷マウスの画像に見られるように、すべてのマウスで一貫した骨ブリッジの発達が見られます。Scanco Medicalソフトウェアを使用して、近位脛骨成長板の各セクションを確認し、選択ツールで骨ブリッジの領域を描写し(図5B)、次に成長プレートの体積全体で各セクション領域を統合して総体積24を得ることにより、骨ブリッジの体積を計算しました。この方法で計算された骨橋の体積は 0.0761 mm3 ± 0.0246 (平均±標準偏差、N = 6) でした。骨の橋の大部分は、横方向のアプローチにもかかわらず、成長プレートの中央近くに形成され、成長プレートの外縁と中心を傷つけます。この現象は、軟骨周囲ではなく骨髄由来の間葉系幹細胞(MSC)が骨ブリッジ形成に関与しているという事実に起因する可能性がある25。
これらのトリコロールトランスジェニックマウスでは、損傷した成長板の凍結組織学的分析は、天然のコラーゲン蛍光によって強化されています(図6)。これは、損傷部位における骨細胞と軟骨細胞の複雑な相互作用を明らかにします。図6J、Kに示すMicroCT画像は、包埋と切片化をガイドするために組織学技術者に提供されました。I型コラーゲン産生骨細胞は図6L,O,P(緑色蛍光)に、II型コラーゲン産生増殖性軟骨細胞は図6L,O,Q(シアン蛍光)に見られます。X型コラーゲン産生肥大軟骨細胞は、図6L、O、R(赤色蛍光)に見られます。このマルチカラー蛍光アプローチにより、石灰化組織を背景にした骨橋領域内の術後軟骨細胞の分化を詳細に調べることができます。DAPI染色を使用して、成長プレート領域内のすべての細胞タイプの分布を確認しました(図6M)。Safranin O/Fast Green染色は、損傷した成長板内の軟骨と骨の複合的および構造的組織を示しています(図6N)。これらの染色切片をCy5フィルターセットでイメージングすると、骨端骨と軟骨の間の界面にある静止領域の細胞が著しく明るくなります。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig03.jpg"> 図3:対側コントロールと負傷したマウスの脛骨のX線画像 (A) 対側コントロール脛骨のX線画像は、マウスが生後2週間のときは損傷の直前に、マウスが生後5週間のときには手術後3週間で撮影されており、この期間中に起こる成長の程度を示しています。(B)(A)と同じ時点で同じマウスから負傷した脛骨。脛骨の長さの測定に使用されるランドマークは、近位脛骨頭の頂点から足首関節の脛骨の端までです(赤い両方向の矢印)。不透明な骨の橋は、5 週間で損傷した近位脛骨成長板に見えます。スケールバー = 5.00 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig04.jpg"> 図4:タイムゼロ対側コントロールと損傷したマウス近位脛骨のマイクロCTおよび組織学的画像(A,E)および(B,F)は、3Dおよび横方向の2DマイクロCTビューを示しており、(E)および(F)の赤い矢印で欠陥が示されています。(C,G)3つの自然蛍光層と石灰化組織層を融合させた凍結組織学的画像を合成した。緑色細胞(Col3.6GFPtpz)はI型コラーゲン産生骨細胞、シアンブルーの細胞(Col2A1GFPcyan)はII型コラーゲン産生増殖性軟骨細胞、赤色細胞(Col10A1RFPchry)はX型コラーゲン産生肥厚性軟骨細胞です。(D,H)(C)および(G)と同じ領域のSafranin O/Fast Green染色。スケールバー= 1.0 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig05.jpg"> 図5:このプロトコルによって形成された骨ブリッジのMicroCT画像(A、C、E、G、I、K)バー欠損作成後3週間の6つの異なるマウスの近位脛骨成長板の横断面。(A)の赤い点線で囲まれた骨の橋。(B,D,F,H,J,L) 縦方向の平面を切り取った3D再構成。(B)の赤い点線で囲まれた骨の橋。スケールバー= 1.0 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig06.jpg"> 図6:骨ブリッジ形成を伴う対側コントロールおよび損傷したマウス近位脛骨のMicroCTおよび組織学的画像。 (A,J)および(B,K)は、3Dおよび横方向の2DマイクロCTビューを示しており、(J)および(K)は骨ブリッジを黄色の矢印で示しています。(C,L)3つの自然蛍光層と石灰化組織層を融合させた凍結組織学的画像を合成した。緑色細胞(Col3.6GFPtpz)はI型コラーゲン産生骨細胞、シアンブルーの細胞(Col2A1GFPcyan)はII型コラーゲン産生増殖性軟骨細胞、赤色細胞(Col10A1RFPchry)はX型コラーゲン産生肥厚性軟骨細胞です。白いボックスは、 パネルF と Oで示されている高倍率を示しています。(D,M)パネル C および Lの成長板領域における石灰化組織およびDAPI染色。(E,N)(D)および(M)と同じ領域のSafranin O/Fast Green染色をcy5蛍光でスキャンしました。(F,O)パネル C と Lの合体画像における成長板面積の高倍率。(G-I,P-R)天然蛍光の個々のチャネルを、石灰化した組織の背景で示しています。スケールバー = 1.0 mm (A-E) と (J-N)、= 250 μm in (F-I) と (O-R)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、青年期の骨成長板損傷のための改良されたマウスモデルを記述します。成長プレートの3つの異なる基層に関連する一次マトリックスであるI型、II型、およびX型のコラーゲンの三系統蛍光レポーターを備えたトランスジェニックマウスを使用して、損傷の配置は顕微鏡下でのネイティブ蛍光によってガイドされます。

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

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成長板損傷を研究するためのトリコロールトランスジェニックマウスモデル

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