多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)
2024年8月9日
ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。
本研究では、生細胞顕微鏡を用いた細胞代謝や酸素分布の解析に使用できるスフェロイド形成法を提示し、比較します。近年、蛍光寿命イメージング顕微鏡は、生細胞のNADPHやFADなどの代謝バイオマーカーの研究に広く使用されており、細胞や組織の酸素化のイメージングとそのような測定を多重化するために、いくつかの蛍光ナノ粒子が開発されています。多細胞スフェロイド、オルガノイド、Organ-on-a-chipは、複雑な生体内のような微小環境を再現できるため、動物研究の必要性を最小限に抑えることができます。
スフェロイドの製造については、低スループットから高スループットまで、さまざまな形成方法を示します。また、光学的アクセシビリティ、蛍光寿命イメージング顕微鏡との互換性、および細胞外マトリックス成分を含める可能性を強調しています。そのため、3D in vitroモデルは2D培養と比較してより優れたコンテキストを提供しますが、その高い変動性、低い再現性、および不完全な実験報告は依然として問題です。
スフェロイドのサイズ、栄養素組成、細胞外粘度、さらにはスフェロイド形成方法などのパラメータはすべて、細胞の不均一性の増加につながる可能性があります。このプロトコルにより、スフェロイドの作製方法を調和させ、標準化することを目指しており、FLIM顕微鏡を用いたスフェロイドの寿命連続およびマルチパラメトリック分析に重要な側面を強調しています。
概要
本記事では、生細胞顕微鏡を用いて細胞代謝および酸素分布を解析するための、多細胞スフェロイド形成のさまざまな手法を紹介します。本研究では、生細胞内の代謝バイオマーカーを調査するための蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）の活用に焦点を当てています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- ライブセルイメージング
背景
- 多細胞スフェロイドおよびオルガノイドは、生体内に類似した微小環境を再現します。
- 蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）は、代謝バイオマーカーの研究に使用されます。
- 3D in vitroモデルにおける高い変動性と低い再現性が課題となっています。
- さまざまな用途に応じて、異なるスフェロイド形成法を採用することが可能です。
研究目的
- 生細胞顕微鏡観察のためのスフェロイド形成法を比較する。
- 3Dモデルにおける細胞代謝、低酸素状態、および細胞死を解析する。
- 多細胞システムにおける酸素分布の理解を深める。
使用した手法
- 蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）
- 細胞自発蛍光解析
- 染色染料および蛍光ナノ粒子の利用
- さまざまなスフェロイド形成技術
主な結果
- 3Dスフェロイドにおける細胞代謝を解析するための手法を実証した。
- 代謝研究において、スフェロイドがFLIMと適合することを示した。
- スフェロイド形成における細胞外マトリックス成分の重要性を強調した。
- 3D培養の再現性と変動性における課題について述べた。
結論
- 異なるスフェロイド形成法を用いることで、生細胞解析を向上させることができます。
- FLIMは、3Dモデルにおける代謝プロセスに関する貴重な知見を提供します。
- これらの手法の開発を継続的に進めることで、動物モデルへの依存度を低減できる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
多細胞スフェロイドの標準化された作製およびマルチパラメータFLIM解析は、創薬に向けた腫瘍微小環境モデリングにおける重要な課題を解決します。スフェロイド形成とライブセルイメージングのワークフローを調和させることで、代謝および低酸素関連のリードアウトにおける予測信頼性が向上し、初期段階での堅牢な意思決定を支援します。このアプローチは、オンコロジーおよび幹細胞研究開発ポートフォリオ全体において、トランスレーショナルな連続性を強化し、生物学的リスクを低減させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 生理学的に適切な3Dモデルにおける代謝経路と酸素勾配の解析を可能にします。
- 生存したスフェロイド内のNADPHおよびFADバイオマーカーを定量化することで、機能的なターゲットバリデーションを支援します。
- 代謝と低酸素状態のマルチプレックス測定を通じて、生物学的なリスク低減（de-risking）を促進します。
- 複雑なシステムにおけるターゲット結合および経路調節の予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ワイドフィールド、共焦点、および2光子FLIMプラットフォームに対応した、再現性の高い3Dスフェロイドモデルを作製します。
- アッセイ条件を標準化し、ばらつきを抑えて定量的な出力結果の信頼性を高めます。
- 細胞の代謝および生存率に対する化合物の影響について、スケーラブルなハイスループットスクリーニングを可能にします。
- マルチプレックス読み出しに向けた、バイオセンサおよびナノセンサ統合の堅牢な評価をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroでの代謝および低酸素プロファイルを、疾患に関連する腫瘍微小環境と一致させます。
- 動物モデルへの依存を最小限に抑えることで、創薬から前臨床検証までの継続性を確保します。
- 定量的かつ多パラメータなデータに基づき、リスク調整された進展判断を可能にします。
- 生細胞FLIMの出力を用いて、トランスレーショナルなバイオマーカーの開発を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この統合されたワークフローは、標準化されたスフェロイド作製とFLIM解析を活用することで、初期探索からリード化合物の同定、および前臨床検証までを統合しています。
- 探索生物学： 3Dのin vivoに近い環境における仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 化合物の選別に向けた、再現性と定量性のある代謝および低酸素状態のリードアウトを提供します。
- 分析： 堅牢な条件比較を可能にする、マルチプレックス蛍光寿命測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 腫瘍微小環境の特徴を再現することで、in vitroでの知見を前臨床モデルへと橋渡しします。
- エンタープライズでの再利用： 多様な腫瘍学および幹細胞の研究開発プログラムに活用可能な、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 3Dモデルシステムにおける予測の信頼性を向上させ、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用の価値： 生細胞イメージングワークフローの標準化、再現性、および拡張性を高める。
- 戦略的価値： 堅牢で定量的なデータを提供することにより、意思決定（Go/No-go判断）および資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 生物学的な妥当性が検証された候補物質のリスク調整済み優先順位付けと開発推進を可能にする。
実施上の留意点
- 3D細胞培養、生細胞顕微鏡観察、およびFLIM解析の専門知識が必要です。
- ワイドフィールド、共焦点、または2光子FLIM装置および互換性のある解析ソフトウェアへのアクセスが求められます。
- スフェロイドの作製およびイメージングプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 細胞種、細胞外マトリックス、またはセンサーの統合に応じて、調整が必要な場合があります。
- スフェロイドのサイズや組成のばらつきが、再現性やデータの解釈に影響を及ぼす可能性があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
