多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)
August 9th, 2024
ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。
本研究では、生細胞顕微鏡を用いた細胞代謝や酸素分布の解析に使用できるスフェロイド形成法を提示し、比較します。近年、蛍光寿命イメージング顕微鏡は、生細胞のNADPHやFADなどの代謝バイオマーカーの研究に広く使用されており、細胞や組織の酸素化のイメージングとそのような測定を多重化するために、いくつかの蛍光ナノ粒子が開発されています。多細胞スフェロイド、オルガノイド、Organ-on-a-chipは、複雑な生体内のような微小環境を再現できるため、動物研究の必要性を最小限に抑えることができます。
スフェロイドの製造については、低スループットから高スループットまで、さまざまな形成方法を示します。また、光学的アクセシビリティ、蛍光寿命イメージング顕微鏡との互換性、および細胞外マトリックス成分を含める可能性を強調しています。そのため、3D in vitroモデルは2D培養と比較してより優れたコンテキストを提供しますが、その高い変動性、低い再現性、および不完全な実験報告は依然として問題です。
スフェロイドのサイズ、栄養素組成、細胞外粘度、さらにはスフェロイド形成方法などのパラメータはすべて、細胞の不均一性の増加につながる可能性があります。このプロトコルにより、スフェロイドの作製方法を調和させ、標準化することを目指しており、FLIM顕微鏡を用いたスフェロイドの寿命連続およびマルチパラメトリック分析に重要な側面を強調しています。
概要
この記事では、生細胞マイクロスコープを使用して細胞代謝と酸素分布を分析するための多細胞球体の形成方法をいくつか紹介します。この研究では、生細胞での代謝バイオマーカーを調査するために蛍光寿命イメージングマイクロスコープ（FLIM）の使用が強調されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生細胞イメージング
背景
- 多細胞球体とオルガノイドは、in vivoのような微小環境を再現します。
- 蛍光寿命イメージングマイクロスコープは代謝バイオマーカーの研究に使用されます。
- 高変動性と低い再現性は3D in vitroモデルにおける課題です。
- さまざまな用途に応じて異なる球体形成方法を用いることができます。
研究目的
- 生細胞マイクロスコープのための球体形成方法を比較すること。
- 3Dモデルにおける細胞代謝、低酸素状態、細胞死を分析すること。
- 多細胞システムにおける酸素分布の理解を深めること。
使用された方法
- 蛍光寿命イメージングマイクロスコープ（FLIM）
- 細胞の自己蛍光分析
- 染色染料と蛍光性ナノ粒子の使用
- 異なる球体形成技術
主な結果
- 3D球体における細胞代謝分析方法を実証しました。
- 球体とFLIMの代謝研究における互換性を示しました。
- 球体形成における細胞外マトリックス成分の重要性を強調しました。
- 3D培養の再現性と変動性の課題に対処しました。
結論
- 異なる球体形成方法は生細胞分析を強化できます。
- FLIMは3Dモデルにおける代謝プロセスに関する貴重な洞察を提供します。
- これらの方法の継続的な開発により、動物モデルへの依存を減らすことができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
