Name: 多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶ多細胞スフェロイドの作製法とFLIMを用いた細胞代謝・酸素分布のマルチパラメーター解析。3D培養モデルの標準化と生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡による代謝バイオマーカー可視化の手法です。

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この研究は、ゲント大学の特別研究基金(BOF)助成金(BOF/STA/202009/003;BOF/IOP/2022/058)、フランダース研究財団(FWO、I001922N)、欧州連合、fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN No. 101073507.

1. 多細胞スフェロイドの作製
<ol><li>細胞培養 <ol><li><li></li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> <ol><li></li><li> </li><li><li> </li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li><li></ol></li><li> <ol><li> </li><li><li> </li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li> </li><li><li><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li> </li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li><li> <ol><li> </li><li></li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li><li></li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li><li><li></ol></li><li> <ol><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li> </li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66845/66845eq01.jpg" style="margin: auto;"> </li><li> </li></ol></li></ol>

FLIMベースの代謝および低酸素分析のための多細胞スフェロイド形成

開示するものはありません。

多細胞スフェロイドは、腫瘍および幹細胞ニッチ微小環境の研究、創薬、およびバイオファブリケーションのための「組織ビルディングブロック」の開発において選択される方法になりつつあります。スフェロイドの不均一な内部構造、栄養素の勾配、および酸素化は、比較的単純化されたアクセス可能な環境で、in vivo組織や腫瘍のそれらを模倣することができます。方法論の透明性26,28および標準化71の必要性により、これらのプロトコルは、研究者がライブ定量的蛍光寿命イメージング顕微鏡実験に最適なスフェロイド形成方法を選択するのに役立つと期待されている。提示された方法は、細胞染色ナノ粒子センサーと内因性細胞自家蛍光を利用しており、細胞死の染色と容易に組み合わせることができます。
最も重要なステップは、スフェロイド形成プロトコルです。したがって、ハイスループットのアガロースベースの方法では、培養培地のアガロース型を十分に平衡化することが不可欠です。平衡化時間が不十分な場合、残りのPBS中の栄養素が希釈され、スフェロイドの不均一性21,26,72,73の追加要因がもたらされます。また、作りたてのアガロース型は、気泡や微小な亀裂などの欠陥がないか目視で確認する必要があります。
ナノ粒子懸濁液はイメージングには効率的ですが、低付着形成法では自己凝集を示し、不規則な形状のスフェロイドの形成を引き起こす可能性があります。これは、多くの場合、培養培地に血清を添加するか、スフェロイド形成前に単層細胞培養を事前に染色することで軽減できます。多くの場合、スフェロイドの圧縮中に、少量のナノ粒子(例えば、初期染色濃度の10%)を添加することも、スフェロイドの増殖ゾーンの染色に役立つことがあります。最後に、すべての形成方法で「ダストフリー」の滅菌ピペットチップを使用することが重要です。
イメージング実験では、照明が細胞の生存率に及ぼす潜在的な影響を常に考慮する必要があります。したがって、各ライブイメージング実験に悪影響を与えるリスク要因を知ることが重要です。一般に、光損傷にはいくつかのメカニズムが関与している:(1)高い局所的な温度上昇、(2)機械的ストレス、(3)光化学的ストレス(酸化反応とフリーラジカル反応)74。イメージングモダリティ(例:1光子共焦点イメージングと多光子イメージング、連続照明モードとパルス照明モード、検出器の感度、励起調整が可能な場合は異なる波長での光源の出力)、細胞および組織の種類(例:効率的に光を吸収する色素またはその他の自家蛍光分子の組織タイプ依存の蓄積、3D組織と2D組織、 増殖およびイメージング培地組成)、蛍光プローブの起源(例えば、光増感特性)リスク因子の異なる組み合わせは、イメージング中に光毒性を誘発し得る。さらに、照射後に細胞死の増加が観察されない場合でも、ミトコンドリアおよび代謝に対する光力依存の早期死前の影響は、実験の分析および解釈を潜在的に妨げる可能性がある55。
実験結果への光毒性の影響を排除するために、研究者は、無傷のコントロールと比較して細胞生存率と細胞形態の変化の一般的なモニタリングを行うか、または細胞死プローブを使用して照明後の細胞死率の増加を推定する必要があります。代謝実験を実施する場合、パイロット実験では、測定された代謝パラメータに対するイメージングの影響を推定し、最小限に抑えるために、イメージングパラメータの最適化を行う必要があります。酸素感受性プローブの場合、光の過剰摂取は、いわゆる「光誘導O2消費」効果53,75によるO2感受性色素の燐光寿命と強度の突然の増加(O2感受性色素への参照の強度比の対応する変化)によって容易に追跡できる53,75.これは、例えば、以下の公開されたプロトコル25を使用して、異なる光パワーパラメータを用いたタイムラプス実験の運動曲線解析によって容易に行うことができる。パルス照明(例えば、TCSPC-F(P)LIM顕微鏡法で利用)の「防御」において、最近の研究は、定常照明測定76,77と比較して、ROS産生およびプローブ光退色への影響が最小限であることを示し、TCSPC-FLIMの従来の強度ベースのイメージングアプローチに対するさらなる利点を指摘している。
提示されたスフェロイド形成法の主な制限は、直接的および長期的なモニタリングアプリケーションにあります。アガロース型は、アガロースの厚い層と5D球面板の材料が赤色蛍光チャンネル(O2 プローブ)の測定を妨げる可能性があるため、長い作動距離対物レンズ(または追加の正立顕微鏡または蛍光実体顕微鏡)を必要とします。ハイスループット法で作製されるスフェロイドサイズは、マイクロウェルの直径によって制限され、培地の枯渇や酸性化を避けるために頻繁な培地交換が必要です。これらすべての制限があるため、ハイスループットを必要とする実験(3Dバイオプリンティングアプリケーションなど)には3Dシャーレ(MicroTissue)を、細胞数が少なくて済む「ミディアムスループット」の基礎研究には低接着法をお勧めします。
レシオメトリック酸素化モニタリングと従来の生細胞蛍光色素ベースの顕微鏡実験は、近赤外線(NIR)感度カメラ、発光ダイオード(LED)ベースの励起、および適切な対物レンズ25が装備されている場合、広く利用可能な倒立顕微鏡で手頃な価格です。より適切な光学セクショニングとFLIMのためには、市販の市販の共焦点顕微鏡システム(こちらで説明しているようなもの)をお勧めします。NAD(P)H自家蛍光を検出する方法についても説明しますが、より高価な2光子FLIM顕微鏡が必要ですが、白色光レーザーとハイブリッドまたはSPAD検出器を理想的に装備した共焦点FLIMシステムと互換性があり、有用な多くの異なるアプローチがあります。これらには、細胞代謝の評価、FRET-FLIMバイオセンサータンパク質、細胞および組織力学のイメージング、特定の細胞および組織タイプの自家蛍光、およびFLIM-FRET31を介して視覚化された受容体-薬物相互作用が含まれます。
ベンダーが提供するFLIM取得および解析ソフトウェアは、IRFまたは画像をダウンストリームのオープンソース解析と互換性のある形式でエクスポートできるとは限らないため、実験の成功に影響を与える可能性があります。ポストプロセッシングはFLIM解析ワークフローの重要な部分ですが、まだ普遍的に標準化されておらず、受け入れられているわけでもありません。カーブフィッティングには、フェーザアプローチと比較して、より多くの光子とより多くの計算能力が必要です。FLIMfit45 (グローバルおよびピクセル単位のフィッティング)とFlimview78 はカーブフィッティング解析に使用されるオープンソフトウェアであり、PAM79、FLUTE64、およびAlliGator80 はフェーザ解析に使用されます。FLIMJ46 は、両方のアプローチで動作する便利なImageJプラグインです。全体として、これらのオプションは、後処理ルーチンを改善し、より速く、より用途が広く、ユーザーフレンドリーになるのに役立ちます。

多細胞スフェロイドは、細胞の自己凝集によって取得され、球形を示す3D組織モデルのグループを表します。これらは、in vitroで細胞間および細胞とマトリックスの相互作用を模倣し、多数のがんおよび幹細胞由来のコンストラクト内で3Dコンテキストを再現するために広く使用されています。細胞の付着を減らし、凝集を促進するために、いくつかの技術が採用されています。これらには、表面張力1に依存する吊り下げ式が含まれます。超低付着プレート、マイクロモールド、マイクロウェルなどの細胞付着をはじく方法2,3;音波ベースのアプローチ4;流動誘起凝集法(スピナーフラスコ、バイオリアクター、マイクロ流体デバイス)5;磁性粒子支援形成6と凝集促進合成およびECMベースのマトリックスおよび足場の使用7,8,9。
癌の研究、開発、および新薬療法の検証において、スフェロイドは、栄養素、老廃物、およびO2の空間拡散制限勾配を再現する能力により魅力的なモデルであり、しばしば固形腫瘍に典型的な壊死性コアの形成につながる10,11。これらのより信頼性が高く洗練されたin vitroモデルは、動物研究の3Rの原則(置換、削減、改良)に従って、動物モデルの広範な使用の必要性に挑戦します(食品医薬品局[FDA]近代化法2.012)。がんに加えて、スフェロイドは幹細胞研究に応用されています。例えば、多能性幹細胞は胚様体(EB)を形成する能力を有しており、これは人工多能性幹細胞(iPSC)を、神経前駆細胞13や卵巣顆粒膜細胞13,14など、患者から直接入手することが困難な特殊な細胞型に分化させるために使用できる。さらに、EBの形成は、しばしば、より複雑なオルガノイドモデル、例えば、神経15、網膜16、心臓17、肝臓18、胃19、および腸オルガノイド20の開発における最初のステップである。実験に適したスフェロイド形成法を選択する際には、サイズ、再現性、スループット、ダウンストリームアプリケーションなどの要素を考慮する必要があります。
3D培養は複雑化するため、2D培養に比べてばらつきが大きくなる可能性があります。栄養組成物21、培地蒸発22、粘度23、pH制御24、スフェロイド形成方法、さらには培養25,26の時間などの要因により、さまざまな形態、サイズ、生存率、および異なる化学療法抵抗性27,28のスフェロイドを得ることができる.最近の研究では、スフェロイドの酸素勾配は常に静的ではなく、形成方法、スフェロイドサイズ、および細胞外粘度の影響を受け、スフェロイドの不均一性に影響を与えることが示された29。スフェロイドの再現性とデータへのアクセス性を向上させるために、MISpheroIDナレッジベースが開発され26、細胞株、培地、形成方法、およびスフェロイドサイズが再現性のある結果のための最小限の情報として特定されています。したがって、複数のハイスループット法(SphericalPlate 5D、ラボ製マイクロモールド、およびマイクロティッシュモールド)および低アタッチメント法(すなわち、BiofloatおよびLipidureコーティングされた96ウェルプレート、足場フリーおよびスキャフォールドベース)(図1および表1)について、ウェルサイズ(最大スフェロイドサイズの推定値)、使用した消耗品、調製時間、およびスフェロイドを顕微鏡ディッシュに輸送せずにスフェロイドをモニタリングする可能性を含む詳細な比較が行われました。 後者では長期的な研究が可能ですが、ハイスループット法で作製したスフェロイドは、多くの場合、エンドポイント実験につながります。5DspheriPlateのグリッドを除くすべての方法は、不要な自家蛍光をもたらさないため、顕微鏡で直接使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> 図1:スフェロイド形成方法の説明。 特許取得済みのマイクロウェルをプレートに統合したSphericalPlate 5Dなどのハイスループット法や、ラボで製造されたマイクロモールドやMicroTissueモールドは、スタンプを使用してアガロース(青)で複数のマイクロウェルを作製します。Lipidure(Amsbio)やBiofloat(Sarstedt)などの低接着性プレートは、細胞表面の接着を阻害し、細胞の自己凝集を促進する非接着性コーティングを使用しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5Dスフェリプレート</td>
			<td>自社製作のマイクロモールド</td>
			<td>マイクロティッシュ</td>
			<td>低アタッチメント方式</td>
		</tr><tr><td>スフェロイド数/ウェル</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>直径井戸</td>
			<td>90μm</td>
			<td>400μm</td>
			<td>800μm</td>
			<td>1ミリメートル</td>
		</tr><tr><td>培養量</td>
			<td>1 mLの</td>
			<td>5ミリリットル</td>
			<td>1 mLの</td>
			<td>200μL</td>
		</tr><tr><td>その他の消耗品</td>
			<td>/</td>
			<td>3%アガロース7mL</td>
			<td>500 μL の 2% アガロース</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>準備時間</td>
			<td>10分間</td>
			<td>2時間+3日間のメディア適応</td>
			<td>0.5時間+15分メディア適応</td>
			<td>10〜30分+1時間の乾燥</td>
		</tr><tr><td>モニタリング</td>
			<td>はい</td>
			<td>いいえ**</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr><tr><td>オート蛍光</td>
			<td>はい</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>いいえ</td>
		</tr><tr><td>再 利用</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>いいえ**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">費用</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€:コーティングとマトリゲル</td>
		</tr><tr><td>€€:市販の96ウェルプレート</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*一部の細胞株では、コンパクトなスフェロイドを形成するためにECM(2%–5%マトリゲル)を添加する必要があります。</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**コーティングは消耗するまで再利用できます。ただし、各プレートは少量のメディアを消費し、時間の経過とともにほこりが蓄積する可能性があります。フィルター滅菌は定期的に必要です。</td>
		</tr></tbody></table>表1:複数のスフェロイド形成方法の比較29.「モニタリング」:顕微鏡ディッシュに移すことなくスフェロイドをモニタリングする能力。€:0-50€、€€:50-150€、€€:150-500€、€€€:&gt;500€
蛍光顕微鏡法は、細胞死、生存率、増殖、代謝、粘度、さらには機械的特性など、スフェロイド内の主要な生物学的側面を直接モニタリングすることを可能にする30。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)は、それらの(マイクロ)環境31,32,33,34内での蛍光プローブ相互作用を研究するための追加の定量的次元を提供し、異なる発光寿命35,36に従って重なり合う発光スペクトルを解像することを可能にする内因性細胞自家蛍光に基づく細胞代謝の調査。したがって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NAD(P)H)、フラビンモノヌクレオチド(FMN)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、プロトポルフィリンIXなどの広範な細胞内自己蛍光化合物は、1光子および2光子FLIMで測定でき、グルコース異化作用、酸化的リン酸化(OxPhos)の固有の「センサー」として機能し、細胞の酸化還元状態の一般的な概要を提供します。NAD(P)Hは、遊離細胞質、またはタンパク質結合ミトコンドリア型で存在する37,38。同様に、FADの酸化状態は蛍光性であり、遊離型の寿命が長くなります。NAD(P)HおよびFAD顕微鏡法は、通常、試料の光損傷39を防ぐことを目的として、2光子励起FLIMを使用する。多くの場合、「光学代謝イメージング」FLIMは、色素ベースのプローブ、遺伝的にコードされたバイオセンサー、リン光寿命イメージング顕微鏡(PLIM)、およびレシオメトリック強度ベースの測定と組み合わせて使用することで、スフェロイドまたはオルガノイドの代謝、酸素化、増殖、および細胞生存率のより完全な画像を提供することができます29,30,31.さらに、FLIMは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)法と組み合わせて、アクセプターと密接に接触したときのドナー蛍光色素の寿命変動を測定し、薬物とその標的ドメインとの結合を調査することもできます33,40,41。
取得したFLIM画像は、通常、ピクセルごとに寿命を計算するために分析されます。現在、蛍光寿命を得るためには、少なくとも3つの一般的な戦略が用いられています:半定量的な「高速FLIM」42(「タウセンス」と呼ばれることもあります)43,44、1指数関数的、2指数関数的、または3指数関数的フィッティングを使用した減衰曲線フィッティング、およびフェーザ変換とフェーザプロット解析による「フィッティングフリー」アプローチです。ベンダーに応じて、提供されているソフトウェア(LAS X、Symphotime、SPCImageなど)またはオープンソースソフトウェア(FLIMfit45、FLIMJ46、またはその他47など)のいずれかを使用して、測定されたFLIMデータを処理できます。通常、ベンダーが提供するソフトウェアは予備的なデータ分析に役立ちますが、オープンソースのソリューションは、フェーザプロットや3Dビジュアライゼーションなどを使用して、より正確な研究を提供できます。
スフェロイドの研究法としてのFLIMの有用性と魅力にもかかわらず、利用可能な実験プロトコルは非常に少なく、FLIMを含むライブマルチパラメトリック顕微鏡実験を成功させるための最も適切な形成方法を選択するための知識が一般的に不足しています。ここでは、一般的に使用されるスフェロイド形成プロトコルの詳細な比較を、その形態、生存率、および酸素化に基づいて、最近検証され特性評価された遠赤および近赤外(NIR)酸素感知ナノセンサー(MMIR1)と示します。カチオン性ナノ粒子には、参照O2-非感受性aza-BODIPY(励起650 nm、発光675 nm)とNIR O2感受性メタロポルフィリンPtTPTBPF(励起620 nm、発光760 nm)の2つのレポーター色素を含浸させます。MMIR1は、細胞毒性を導入することなく、従来の蛍光顕微鏡(レシオメトリック分析を使用)またはリン光寿命顕微鏡(PLIM)で酸素勾配のリアルタイム分析を可能にし、安定したシグナル、長期モニタリング、およびマルチプレックス25,29を可能にします。色素やナノセンサー、スフェロイドのスループット、または細胞タイプで染色する必要性に応じて、最も適切な形成プロトコルを選択できます。スフェロイドの生存率と酸素化の研究は、がんおよび幹細胞由来のスフェロイドの研究に関連しているため、提示されたプロトコルには、これらのモデルを使用したNAD(P)H-FLIMおよびFAD-FLIMの例と予想される典型的な結果も含まれています。提示されたイメージングおよび分析パイプラインは、最も一般的な時間相関のある単一光子計数ベースのFLIM顕微鏡プラットフォームを対象としています。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>シグマからも入手可能</td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能</td></tr>です <tr><td>12ウェル細胞培養プレート、滅菌</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、その他の企業からも入手可能です。</td></tr><tr><td>12ウェルチャンバースライド、取り外し可能な</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Grace Bio-Labs、ThermoFisher Scientificなどからも入手可能</td></tr><tr><td>15mL遠心分離管</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRなどの企業からも入手可能</td></tr>です <tr><td>3Dペトリディッシュマイクロモールド</td><td>マイクロティッシュ</td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート、滅菌</td><td>Greinerbio-one</td><td>657160</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能</td></tr>です <tr><td>70% エタノール</td><td>ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>スフェロイド形成のための市販のコーティングされた96ウェルプレート</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>希釈1:1000</td></tr><tr><td>CellSens Dimensionソフトウェアで適用</td><td>オリンパスの</td><td>版3</td><td></td></tr><tr><td>人間の胎盤からのコラーゲン、タイプIV</td><td>シグマ</td><td>C5533</td><td>0.07 mg/mLのコラーゲンおよび0.03 mg/mLのPoly-D-lysineのコーティングされた顕微鏡皿の調製のため</td></tr><tr><td>共焦点FLIMの顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td>Stellaris 8 Falconの白い光レーザー、HyD Xの検出器、気候/T制御室(OkoLab)、25x/0.95 Wの目的</td></tr><tr><td>D(+)-グルコース</td><td>メルク</td><td>8342</td><td>イメージング培地(最終濃度10 mM)</td></tr><tr><td>ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)、フェノールレッド、グルコース、ピルビン酸およびグルタミンフリー</td><td>のSigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>イメージング培地調製用</td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清&nbsp;(FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>シグマからも入手可能です。使用前に熱不活化する必要があります。</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>希釈 1/100 イメージング培地調製用 (最終濃度 10 mM)</td></tr><tr><td>ヒト結腸がん細胞 HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>version 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>version 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>シグマからも入手可能です。1:100に希釈して塗布します。</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A、1 mMピルビン酸ナトリウムと10 mM HEPES</td><td>VWR</td><td>392-0420</td><td>HCT116細胞の標準増殖培地</td></tr><tr><td>マイクロパターン化された3DプリントPDMSスタンプ</td><td>N/A</td><td>N/A</td> マイクロ<td>システム技術センター提供、ゲント大学</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>教授ヤン・ヴァンフレテレン教授CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアーカッティングチャンバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15980396</td><td></td></tr><tr><td>O2プローブ: MMIR1</td><td>該当なし</td><td>該当なし 完全な</td><td>特性評価、検証、および一部のアプリケーションは、以下で見つけることができます: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>Gibco18912014</td><td>PBS錠剤を500mLの蒸留水に溶解します。</td></tr><tr><td>連鎖球菌連鎖球菌:P (10,000 U/mL) / ストレプトマイシン (10,000 &mu;g/mL) 100倍溶液</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>シグマからも入手可能です。1:100に希釈して塗布します。</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>シグマ</td><td>P6407-5mg</td><td>0.07 mg/mLコラーゲンおよび0.03 mg/mLポリ-D-リジンコーティング顕微鏡ディッシュの調製には</td></tr>、<tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>25535-16-4</td><td>細胞死染色、1 & マイクロ;1時間インキュベーション</td></tr><tr><td>PVDFシリンジフィルター0.22 &microでのg / mL;m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能</td></tr>です ピル<tr><td>ビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>希釈 1/100 イメージング媒体の調製用(最終濃度 1mM)</td></tr><tr><td>球面プレート 5D 24 ウェル</td><td>クーゲルマイヤー</td><td>ズ SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ペトリディッシュ</td><td>グライナー バイオワン</td><td>633181</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能</td></tr>です <tr><td>組織培養フラスコ (25 cm&sup2; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能</td></tr><tr><td>です 組織培養フラスコ(75 cm&sup2;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能</td></tr>です <tr><td>Uボトム96ウェルプレート</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>同様の製品は、Sarstedt、Corning、Greiner Bio-oneおよび他の会社からも入手可能</td></tr>です <tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>アガロース低融点(A-9414、シグマ)、ルーチン使用のためのアガロース(A-9539、シグマ)</td></tr><tr><td>広視野蛍光倒立顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>N / A</td><td>倒立蛍光顕微鏡IX81、電動Z軸制御、CoolLED pE4000(16チャンネル、365-770 nm)、ORCA-Flash4.0LT(浜松)cMOSカメラ、ガラス温暖プレートOkolab、CellSens Dimension v.3ソフトウェアおよび空気対物レンズ4x/0.13 UPlanFLNおよび40x/0.6 LUCPlanFLN。(オプション、高解像度イメージング用) 60x/1.0 LUMPLFLN 水</td></tr></tbody></table>

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(flim)

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

多細胞腫瘍スフェロイドは、腫瘍の微小環境を再現し、薬物療法を試験および最適化し、3Dコンテキストでバイオセンサーとナノセンサーを使用するための一般的な3D組織微小凝集体モデルです。それらの生産の容易さ、予測可能なサイズ、成長、および観察された栄養素と代謝物の勾配は、3Dニッチのような細胞微小環境を再現するために重要です。しかし、スフェロイドの不均一性やその作製方法のばらつきは、細胞全体の代謝、生存率、薬物応答に影響を与える可能性があります。そのため、サイズ、ばらつき、バイオファブリケーションのニーズ、幹細胞生物学やがん細胞生物学における in vitro 3D組織モデルとしての使用など、最適な方法論を選択することは困難です。特に、スフェロイドの産生は、光学代謝イメージング、蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、ナノセンサーによるスフェロイド低酸素症のモニタリング、生存率などの定量的生顕微鏡との適合性に影響を与える可能性があります。ここでは、従来のスフェロイド形成プロトコルをいくつか紹介し、生体広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、および2光子顕微鏡との適合性を強調しています。マルチプレックス自家蛍光FLIMを使用した、さまざまな種類のがんおよび幹細胞スフェロイドを使用した解析パイプラインへのフォローアップイメージングも紹介します。

ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

蛍光寿命イメージング（FLIM）はイメージに重要な手法として、生きた細胞内の特定のタンパク質と色素の環境との相互作用を浮上している。蛍光分子ローターのFLIMは、生体細胞内の粘度のマッピングを可能にします。...

生細胞における分子ローターの蛍光寿命イメージング

ここで提示される、スフェロイドイメージング装置の製造のためのプロトコルである。この装置は癌細胞スフェロイドの動的または縦方向の蛍光のイメージ投射を可能にする。プロトコルはまた癌細胞の浸潤の分析のための簡単な画像処理手順を提供する。...

3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

このプロトコルは、標準的な蛍光顕微鏡での酸素化および細胞死のマルチパラメトリック分析を使用して、バイオプリンティングのためのハイスループットスフェロイド生成を記述している。このアプローチは、スフェロイドの生存率を制御し、3D組織、腫瘍微小環境、および成功した(マイクロ)組織バイオファブリケーションのモデリングにおいて重要な標準化を実行するために適用することができる。...

多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション

生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。...

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

細胞膜タンパク質と脂質の空間分布と時間ダイナミクスは、生物学におけるホットなトピックです。ここでは、この問題は、概念的には同じ物理量の単一粒子追跡を提供する時空間画像変動解析によって対処されますが、低分子ラベルと標準的な顕微鏡セットアップを使用します。...

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。...

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

高速・高分解能を可能にする高度な顕微鏡分離膜と周囲の細胞内のボリュームの両方の画像が表示されます。1 つのセットアップでディスクと全反射蛍光顕微鏡を回転の統合により、3.5 まで高い獲得率でライブ...

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

細胞回転楕円体を培養できるモータ駆動遠心マイクロ流体装置を紹介する。この装置を使用して、単一または複数の細胞タイプの回転楕円体は、高い重力条件下で容易に共培養することができる。...

多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム

提示された方法は、ライブ共焦点顕微鏡を可能にしながら、シリコーンゴムに埋め込まれた3Dソフトヒドロゲルの単軸ストレッチを含む。繊維のアライメントと同様に、外部および内部ヒドロゲル株の特性評価が実証されている。開発された装置およびプロトコルはさまざまなひずみのレジームに対する細胞の応答を査定できる。...

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

学ぶ多細胞スフェロイドの作製法とFLIMを用いた細胞代謝・酸素分布のマルチパラメーター解析。3D培養モデルの標準化と生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡による代謝バイオマーカー可視化の手法です。

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

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