Name: 末梢神経細胞の特徴を研究するためのマルチコンパートメントデバイスにおける後根神経節の採取、埋め込み、および培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学ぶ マルチコンパートメントデバイスを用いた後根神経節（DRG）の採取・培養法。Sprague Dawleyラットから末梢神経細胞を分離し、神経細胞体と周辺神経突起を解剖学的に分離して慢性疼痛のメカニズムを研究する。

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この研究は、NSF Grant (2152065) と NSF CAREER Award (1846857) の支援を受けました。著者は、このプロトコルに貢献してくれたWachs Labの現在および過去のメンバー全員に感謝します。 図1 の図はBiorenderで作成されています。

DRG培養における神経過敏症の研究のための高度なIn Vitroモデル

<ol><li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+incidence%2C+prevalence%2C+and+years+lived+with+disability+for+310+diseases+and+injuries%2C+1990-2015%3A+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015.</a> Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).</li>
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<li>Van De Wijdeven, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structuring+a+multi-nodal+neural+network+in+vitro+within+a+novel+design+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip.</a> Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).</li>
<li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li>
<li>Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+transport+and+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+along+sensory+axons+promote+Schwann+cell+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination.</a> J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+drg+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li>
<li>Seidlits, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+hyaluronic+acid+hydrogels+with+tunable+mechanical+properties+on+neural+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation.</a> Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).</li>
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<li>Naveed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+of+dissection+protocols+for+the+rapid+isolation+of+rat+dorsal+root+ganglia+under+the+non-microscopic+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition.</a> Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212(2023).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+anatomical+rat+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anatomy%22%5BJournal%5D)">A high-resolution anatomical rat atlas.</a> J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).</li>
<li>Bian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hyaluronic+acid+hydrogel+crosslinking+density+and+macromolecular+diffusivity+on+human+MSC+chondrogenesis+and+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy.</a> Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).</li>
<li>Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human dorsal root ganglia.</a> Front Cell Neurosci. 13, 271(2019).</li>
<li>Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+rat+and+human+dorsal+root+ganglion+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome.</a> Scientific Rep. 8 (1), 13469(2018).</li>
</ol>

この研究の著者は、利益相反がないことを宣言します。

このプロトコルは、成虫のSprague Dawley DRGを収穫し、それらを3D天然ハイドロゲルで培養する方法を概説しています。この方法とは対照的に、マウスやラットからDRGを採取する他のアプローチでは、脊柱を分離します。切除された脊柱は半分になり、脊髄はDRGs23,24,25を露出させるために取り除かれます。脊髄の損傷は血液供給を制限し、DRGと内部ニューロンに影響を及ぼします26。これにより、DRGの活性が低下し、外科的アプローチがより適切になります。さらに、DRGの生理学的に関連性のある培養を可能にする堅牢なMCデバイスを3Dプリントする方法が概説されています。
このプロトコルは、解剖学的および生理学的に関連するモデルでニューロンの末梢感作を研究することを強調して、 in vitroでDRGを培養する方法を概説しています。...

慢性疼痛は、世界的に障害と失業の主な原因です1。慢性疼痛は、世界の成人の約20%が罹患しており、社会的および経済的に大きな負担を強いており2、米国では毎年5,600億ドルから6,350億ドルの総費用が見積もられています3。
慢性疼痛患者が示す主な末梢の特徴は、神経の刺激閾値の低下であり、これにより神経系が刺激に対してより敏感になります4,5。刺激の閾値が低下すると、以前は痛みを伴わなかった刺激に対する痛みを伴う反応(異痛症)や、痛みを伴う刺激に対する反応の増加(痛覚過敏)が生じる可能性があります6。現在の慢性疼痛治療薬の有効性は限られており、動物モデルで成功した治療法は、疼痛発現のメカニズムの違いにより、ヒトでの試験で失敗することがよくあります7。末梢感作メカニズムをより正確に模倣できるin vitroモデルは、新しい治療法の翻訳を増加させる可能性を秘めています8,9。さらに、培養システムにおける感作神経の重要な側面をモデル化することにより、研究者は閾値の低下を引き起こすメカニズムについてより深い理解を深め、それらを逆転させる新しい治療標的を特定することができます10。
理想的な in vitro プラットフォームまたは微生物学的システムは、遠位神経突起と後根神経節(DRG)細胞体の物理的分離、三次元(3D)細胞環境、 およびin vivo 条件を厳密に模倣する天然支持細胞の存在を組み込むことです。しかし、Caparasoらによる最近の論文11 では、現在のDRG培養プラットフォームにはこれらの主要な特徴が1つ以上欠けており、 in vivo 条件の再現には不十分であることが示されています。これらのプラットフォームは簡単にセットアップできますが、末梢感作の生物学的基盤を模倣していないため、 in vivo での有効性に変換されない可能性があります。この制限に対処するために、神経突起およびDRG細胞体の時間的流体分離を可能にするために、3つの隔離されたコンパートメントを有するヒドロゲルマトリックス内の後根神経節(DRG)の培養のために、生理学的に関連性のある in vitro モデルが開発された11。このモデルは、生理学的および解剖学的関連性の両方を提供し、 in vitroでニューロンの末梢感作を研究する可能性があります。
3D培養におけるDRG外植片の使用に対する関心の高まりは、DRG生存率の間接的な指標として機能する堅牢な神経突起成長を促進する能力によるものです12。初代新生児または胚性DRG外植片は、主に現在のin vitro培養プラットフォーム13,14で使用されていますが、成体げっ歯類からの外植片を使用すると、成熟したニューロン生理学のより良いモデルが提供され、新生児または胚性げっ歯類15からの外植片と比較して、ヒトのDRG生理学に密接に模倣されます。外植片DRGとは、主に天然の非ニューロン支持細胞を維持することにより、天然のDRG組織の細胞および分子組織の保存を指します。ここでは、このプロトコルは、成体のSprague DawleyラットからDRG外植片をマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫および培養する方法を説明します(図1)。
頸椎、胸椎、腰椎からのDRGの培養では、神経突起の成長に観察可能な違いが見られず、有効性が示されています。このアプリケーションの目的は、デバイスの外側のコンパートメントに神経突起の成長を引き出すことでした。したがって、この記事ではDRGレベルを区別しませんでした。ただし、特定の実験に必要な場合は、実験者のニーズに合わせてDRGレベルを調整できます。現在、DRGの3D培養16には他のコンパートメント化された培養モデルがありますが、これらのデバイスには保存された天然の非ニューロン支持細胞が含まれていないため、翻訳が制限される可能性があります。採取したDRGの天然構造を維持することは、非ニューロン支持細胞の保持を確実にするため、重要です。これは、DRGニューロンとの相互作用がこれらのニューロンの機能特性を維持するために不可欠であるためです。いくつかの研究では、ニューロンの髄鞘形成を促進するために、解離したDRGをシュワン細胞などの非天然ニューロン細胞と共培養しました17,18,19。

<table><tbody><tr><td>#5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td><td>DRG</td></tr><tr><td>10x DMEM</td><td>MilliporeSigma</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (オートクレーブ)</td> <td>ラボ</td><td></td>で調製 <td>7.3 - 7.5 pH</td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>VWR</td><td>82050-892</td><td>収穫して切断した DRG</td></tr><tr><td>3 mL シリンジ滅菌、シングルユース</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>48ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>677180</td><td></td></tr><tr><td>60 mm ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713A</td><td>トリミングと切断のためのメディアを保持するため</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>フィッシャーブランド</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>B27 プラス 50x</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504044</td><td>DRGメディア用</td></tr><tr><td>コラーゲン I 型</td><td>イビディ</td><td>50205</td><td></td></tr><tr><td>湾曲カップ フリードマン ピアソン ロンガー</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>16221-14</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>デュモン #3 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11293-00</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16000044</td><td>DRG メディア用</td></tr><tr><td>フォーム硬化型</td><td>フォーム ラボ</td><td></td><td>硬化剤</td></tr><tr><td>フォーム ウォッシュ</td><td>フォーム ラボ</td><td></td><td>MC から余分な樹脂を洗い流すには</td></tr><tr><td>ガラスビーズ滅菌器</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531961</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル (8 mL)</td><td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td><td>224724</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td>DRG メディア</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Millipore Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>高温 V2 樹脂</td><td>FormLabs</td><td>FLHTAM02</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロン酸ナトリウム塩</td><td>MilliporeSigma</td><td>53747</td><td>MAHA</td></tr><tr><td>Irgacure</td><td>MilliporeSigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>R& の製造に使用Dシステム</td><td>344600501</td><td></td></tr><tr><td>大型鈍鼻ハサミ</td><td>Militex</td><td>EG5-26</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>大型鉗子(鋸歯状の先端)</td><td>Militex</td><td>9538797</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>大型鋭鼻ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14010-15</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>ローリテンションピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-017</td><td>コラーゲンとピペッティング用MAHA</td></tr><tr><td>メタクリル化ヒアルロン酸(MAHA)</td><td>ラボで調製</td><td>N / A</td><td>85 - 115 % メタクリル化</td></tr><tr><td>神経成長因子(NGF)</td><td>R&Dシステム</td><td>556-NG-100</td><td>DRGメディア</td></tr>用 <tr><td>神経基礎Aメディア</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10888022</td><td>DRGメディア用</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (PS)</td><td>EMD Millipore</td><td>516106</td><td>DRGメディア</td></tr><tr><td>用pHテストストリップ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>BDH35309.606</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ(1000 & micro;L)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Preform 3.23.1 software</td><td>Formslab</td><td></td><td>STL ファイルをアップロードするには</td></tr><tr><td>Rat</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resin 3D printer</td><td>Form Labs</td><td>Form 3L</td><td>3D printing MC device</td></tr><tr><td>Small sharp-nosed はさみ</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>重炭酸</td><td>ナトリウムMilliporeSigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>ストレート カップ ロンゲール</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>16004-16</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>ストレート エッジ スプリング ハサミ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15024-10</td><td>解剖用</td></tr><tr><td>外科用スカプレル ブレード (No. 10)</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>22-079-690</td><td></td></tr><tr><td>シリング フィルター、PES (0.22 &micro;m)</td><td>Celltreat</td><td>229747</td><td></td></tr><tr><td>小さなスプリングハサミ</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>トリミングと切断用 DRG</td></tr><tr><td>UVランプ</td><td>Analytik Jena US</td><td></td><td>フォトクロスリンクハイドロゲル (15 - 18 mW/cm2)</td></tr></tbody></table>

末梢神経細胞の特徴を研究するためのマルチコンパートメントデバイスにおける後根神経節の採取、埋め込み、および培養

Harvesting, Embedding, and Culturing Dorsal Root Ganglia in Multi-compartment Devices to Study Peripheral Neuronal Features

疼痛の最も一般的な末梢神経細胞の特徴は、刺激閾値の低下または後根神経節(DRG)からの末端神経の過敏症です。この過敏症の原因として提案されているのは、末梢組織の免疫細胞とニューロンとの相互作用に関連しています。 In vitro モデルは、これらのメカニズムが侵害受容器過敏症を引き起こす方法を理解するための基礎知識を提供してきました。しかし、 in vitro モデルは、有効性をヒトに翻訳するという課題に直面しています。この課題に対処するために、生理学的および解剖学的に関連する in vitro モデルが開発され、48ウェルプレートの3つの隔離されたコンパートメントで無傷の後根神経節(DRG)を培養しました。一次DRGは、人道的安楽死後に成体のSprague Dawleyラットから採取されます。余分な神経根をトリミングし、DRGを培養に適したサイズにカットします。その後、DRGは天然のハイドロゲルで増殖し、すべてのコンパートメントでしっかりとした増殖を可能にします。このマルチコンパートメントシステムは、神経突起からのDRG細胞体の解剖学的に関連性のある単離、生理学的に関連する細胞タイプ、および神経細胞と免疫細胞の間の相互作用を研究するための機械的特性を提供します。したがって、この培養プラットフォームは、治療の分離戦略を調査するための貴重なツールを提供し、最終的には疼痛を予測するためのスクリーニングアプローチの改善につながります。

本プロトコルは、成体のSprague DawleyラットからDRGをマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫し培養する技術を記載しています。 図1に示すように、 成体ラットから採取したDRGをトリミングし、~0.5mmにカットしました。次に、トリミングおよび切断したDRGをMCデバイスの体細胞領域のハイドロゲルに包埋し(図2)、神経突起定量化の前に27日間培養しました。DRGは、コントロールとして機能するためにプレーンゲルで培養されました。この実験に使用したヒドロゲル製剤の濃度は、4.5/1.25 mg/mL コラーゲン:MAHAでした。マルチコンパートメントゲルとプレーンゲルのそれぞれ27日目と21日目に、神経突起の堅調な成長が見られました(図3)。MC中の神経突起の平均長(894.22μm±308.75μm)は、対照プレーンゲルの神経突起長(864.26μm±362.84μm)と同等でした(<strong class=...

このプロトコルは、成体のSprague Dawleyラットから摘出された後根神経節(DRG)をマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫し、培養する技術を提供します。

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia ...

harvesting-embedding-culturing-dorsal-root-ganglia-multi-compartment

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、後根神経節の培養感覚ニューロンについてはコンパートメント室を準備し、維持するテクニックについて説明します。...

コンパートメント文化の後根神経節ニューロンの準備とメンテナンス

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

このビデオでは、採取したラットの脊椎から後根神経節またはDRGを抽出し、下流に応用する方法を示します。...

ラットの背骨からのDRGの収穫:ラットモデルの背骨から背根神経節を抽出する手順

このビデオは、ラットの胚から後根神経節(DRG)ニューロンを分離し、それらをシュワン細胞前駆体と共培養して成熟したシュワン細胞を生成する手順を示しています。単離されたDRGは、ニューロンとグリア細胞を単離するために処理されます。単離された細胞を培養してニューロンを精製し、ニューロンを共培養培地でシュワン細胞様細胞(SCLC)と共培養します。DRGニューロンとの相互作用は、SCLCのシュワン細胞への成熟につながります。...

DRGニューロンの単離とシュワン細胞前駆体との共培養によるシュワン細胞の生成

このビデオでは、単離されたマウスDRG組織を使用して、後根神経節またはDRG外植片培養およびDRG解離細胞モデルを開発する方法を示します。これらのモデルは、制御された環境下でのニューロンとグリアの相互作用に関するさまざまなメカニズムを研究するのに役立ちます。...

後根神経節外植片の生成と解離細胞培養

このビデオは、後根神経節(DRG)からニューロンを採取する方法を示しています。ラットの脊柱からDRGを単離し、酵素で処理した後、機械的に解離して単一細胞懸濁液を得る。ニューロンは、密度勾配遠心分離を使用してグリア細胞から分離され、増殖培地で培養されます。...

神経細胞培養のための背根神経節の採取と解離の技術

後根神経節（DRG）、末梢神経系の感覚ニューロンを含む構造である。解離した場合、それらは損傷部位でのインビボ環境を模倣し、in vitroでの神経再生及び髄鞘形成を研究するための貴重なモデルを提供し、SC-ような脂肪由来幹細胞（ASC）と共培養することができる。...

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

後根神経節 (DRG) の初代培養は、生理機能や感覚ニューロンの病理に関連するイベントを研究するよく使用されます。ここでは、我々 は FF 神経ペプチド受容体選択的なアゴニスト 2...

伝達物質の放出を勉強する後根神経節細胞の分離と培養

ここでは、ヒトグリオーマ細胞(hGC)移行をリアルタイムで研究するためのex-vivo混合単層培養システムを提示する。このモデルは、区画化されたチャンバー内のhGCと骨髄化した軸索と非骨髄化軸の間の相互作用を観察する能力を提供する。...

後根神経節軸軸索-オリゴデンドロサイト共培養におけるヒトグリオーマ細胞移動のリアルタイムモニタリング

このプロトコルでは、マウス背根神経節 (DRG)...

背根神経節培養の In Vitro モデルの確立:がん-神経クロストーク研究のための補完的アプローチ

学ぶ マルチコンパートメントデバイスを用いた後根神経節（DRG）の採取・培養法。Sprague Dawleyラットから末梢神経細胞を分離し、神経細胞体と周辺神経突起を解剖学的に分離して慢性疼痛のメカニズムを研究する。

末梢神経細胞の特徴を研究するためのマルチコンパートメントデバイスにおける後根神経節の採取、埋め込み、および培養

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